高效液相色谱法测定血浆同型半胱氨酸

目的 建立测定血浆同型半胱氨酸的高效液相色谱（ＨＰＬＣ）方法。方法 血浆同型半胱氨酸经巯基乙醇还原后用碘乙酸封闭巯基,。再与邻苯二甲醛（ＯＰＡ）反应完成衍生化,以磺在同型半胱氨酸为内标,经Ｃ１８反相柱进行色谱分离,荧光检测器测定结果。结果测定线性范围达１５０μｍｏｌ／Ｌ,最低检测限为１．０μｍｏｌ／Ｌ日内不精密度３．７－４．２％,日间不精密度３．８－４．３％;方法回收率９３－１０２％。结论本方法     

高效液相色谱法测定人血浆中同型半胱氨酸浓度

目的建立柱前衍生化反相高效液相色谱-荧光检测法测定血浆中同型半胱氨酸(Hcy)浓度的方法。方法以tris-(2-carboxylethyl)-phosphine hydrochloride(TCEP)为还原剂,以7-fluorbenzo-2-oxa-1,3-diazole-4-sulfonate(SBD-F)为衍生剂,色谱柱为Xterra RP18柱,柱温35℃,流动相为甲醇︰磷酸二氢钠缓冲液(pH值3.0)=3︰97,激发波长380 nm,发射波长510 nm,外标法定量。结果 Hcy浓度在1.95～125μmol/L范围内线性关系良好(r=0.999 8)。日内和日间相对标准偏差均<7%,方法回收率为103.2%～111.9%。结论此方法准确、灵敏、快速,是一种适合于实验室研究和临床检测血浆中Hcy浓度的方法。     

血浆同型半胱氨酸及其相关硫醇物在全血中的稳定性研究

目的 观察含EDTA的全血样本放置时间、保存温度以及不同稳定剂对血浆同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)及其相关硫醇物水平的影响.方法 用含EDTA、EDTA-氟化钠(EDTA-NaF)、EDTA-3-Deazaadenosine(EDTA-3DA)的试管收集17名健康成人静脉血,置于碎冰上(0～4 ℃)或室温中(25 ℃)保存,放置0、3、6、24、48 h后分离血浆.用HPLC法测定血浆总同型半胱氨酸(tHcy)、总半胱氨酸(total cysteine,tCys)、总半胱氨酰甘氨酸(total cysteinylglycine,tCysGly)、总谷胱甘肽(total glutathione,tGSH)浓度.设定全血样本0 h分离血浆所测硫醇物浓度为基础值.结果 EDTA管在室温中放置3、6、24、48 h,tHcy分别增加38.5%、64.2%、141.9%、225.4%;tCysGly、tGSH在3 h分别增加20.0%、37.9%,tCys则降低3.5%.EDTA管在碎冰上保存,各硫醇物浓度6 h内增加不超过5%.EDTA-3DA和EDTA-NaF管在室温放置3 h,与各自基础值相比,血浆tHcy、tCys、tCysGly、tGSH浓度差异无统计学意义(EDTA-3DA管:F值分别为0.01、0.94、0.09、0.01,P值均>0.05;EDTA-NaF管:F值分别为0.85、0.04、0.03、0.02,P值均>0.05).结论 EDTA抗凝血浆,所测tHcy及其相关硫醇物浓度呈时间、温度依赖性增加.血浆tHcy等硫醇物测定的分析前处理条件必须标准化.EDTA-3DA和EDTA-NaF管可使血浆tHcy、tCys、tCysGly、tGSH在室温中至少稳定3 h.

Abstract：

Objective To investigate the effects of different stabilizers, time and temperature before centrifugation on the stability of homocysteine (Hcy) and other related thiols levels involving EDTA-containing whole blood.Methods Blood was drawn from 17 healthy adults and collected into tubes containing EDTA, EDTA plus NaF and EDTA plus 3-deazaadenosine(3DA),then stored on crush ice(0-4 ℃) immediately or at room temperature(25 ℃).Plasma was separated at 0, 3, 6, 24 and 48 hours, respectively.The levels of plasma total Hcy (tHcy), total cysteine (tCys), tatal cysteinylglycine (tCysGly) and tatal glutathione (tGSH) were measured by HPLC.The plasma immediately separated was used as baseline sample. Results In EDTA tubes stored at room temperature, tHcy levels increased by 38.5%, 64.2%, 141.9%, 225.4% for 3, 6, 24, and 48 h, respectively.The levels of tCysGly and tGSH increased by 20.0% and 37.9% within 3 h, however, tCys decreased by 3.5%.The levels of the thiols increase by less than 5% up to 6 h in EDTA tubes stored on crush ice.In EDTA-3DA and EDTA-NaF tubes, no statistical differences were observed in the plasma levels of tHcy, tCys,tCysGly and tGSH compared with their respective baseline values at room temperature for 3 h(EDTA-3DA tubes:F=0.01,0.94,0.09,0.01,all P>0.05;EDTA-NaF tubes:F=0.85,0.04,0.03,0.02,all P>0.05).Conclusions The EDTA-plasma levels of tHcy and other related thiols are time and temperature-dependent. There is a strong need for standardization of blood sample collection and processing in tHcy and other thiols assays. The plasma concentrations of tHcy, tCys, tCysGly and tGSH were stable for 3 h at least in the EDTA-3DA and EDTA-NaF tubes kept at room temperature.     

高效液相色谱法测定血浆中同型半胱氨酸

目的 高同型半胱氨酸血症是周围血、脑、冠状血管阻塞性病变的独立危险因素，同型半胱氨酸测定对预测心血管病具有重要意义。方法 用高效液相色谱法（HPLC）测定血浆中同型半胱氨酸。结果 该法线性范围为0－40μmol/L，相关系数r=0.998(Y=0.02 0.006X)，批内变异系数为4．7％，批间变异系数为6．4％。正常值为5．98－15μmol/L。结论 方法简单、灵敏、准确、精密度较高，无干扰峰影响，是一种理想的测定方法。     

高效液相色谱法同时测定血清色氨酸和犬尿氨酸浓度的方法建立及应用

目的建立一种高效液相色谱-紫外检测法同时测定血清中色氨酸(Trp)和犬尿氨酸(Kyn)浓度的方法。方法色谱柱采用Agilent Hypersil ODS(125.0mm×4.0mm,5μm),流动相为15mmol/L乙酸钠缓冲液(pH4.0)和乙腈95∶5(V/V),流速为0.8ml/min,柱温25℃,紫外检测λKyn=360nm,λTrp=278nm。结果Kyn和Trp的保留时间分别为3.3min和5.2min,线性范围分别为0.083~21.000μmol/L和2.650~678.000μmol/L,检测限分别为0.028μmol/L和0.053μmol/L,日内和日间相对标准偏差分别低于5%和10%,回收率分别为91.99%~113.89%和95.81%~118.82%。结论该方法简便、快速、特异,适合于临床检测。     

高效液相色谱法测定人血清甜菜碱方法的建立

目的 采用柱前衍生高效液相色谱法-紫外检测法建立一种测定人血清甜菜碱浓度的方法.方法 以对溴苯乙酰溴和18-冠醚-6溶于乙腈制成衍生液,将其与甜菜碱反应形成的衍生物用Supelcosil LC-SCX色谱柱进行分离.流动相为乙腈∶水体积比90∶10,含16 mmol/L的氯化胆碱,等度洗脱,流速为0.8 ml/min,检测波长为259 nm,利用甜菜碱标准品绘制标准曲线,外标法定量检测20名健康大学生志愿者血清甜菜碱.结果 甜菜碱的测定线性范围为6.25～200.00 μmol/L,回归方程Y=1 568.1X-2 747.5,R2=0.999 8.最低检测限为3.0 μmol/L.批内不精密度为1.88%～3.79%(平均3.24%),批间不精密度为3.14%～6.76%(平均4.39%).方法 回收率为95.89%～102.86%(平均99.16%).结论 成功建立一种检测人血清甜菜碱浓度的方法,适用于实验室及临床常规检测.     

高效液相色谱法测定血浆中异丙酚浓度

[目的]建立反相高效液相色谱法测定血浆中异丙酚浓度的方法，为临床异丙酚的药理学研究提供科学的分析技术。[方法]用环己烷提取血浆中的异丙酚，用HPLC测定异丙酚含量。色谱柱为YWG—C18柱，乙腈-水(70：30)为流动相，以麝香草酚为内标，用紫外检测，波长254nm。[结果]本方法回收率高，重现性好，线性范围为0．5—10μg/ml，最低检测浓度为50ng/ml。[结论]本方法较为简单，结果准确可靠，适用于异丙酚的药代动力学研究及临床手术过程中异丙酚血药浓度检测。     

高效液相色谱法测定人血清中褪黑素的浓度

目的用反相高效液相色谱法测定血清中褪黑素的含量。方法采用荧光检测器检测20例自愿者血清中的褪黑素。结果血清中褪黑素最低检测浓度为0.5pg·ml-1,检测限0.2pg,褪黑素在1.0～500pg·ml-1之间呈线性关系,回归方程Y=65744.7x-220.6(r=0.9989,P<0.05),回收率>94.7%,日间、日内变异系数均在10%以下。结论用反相高效液相色谱法测定血清中褪黑素的含量灵敏、快速、准确,为褪黑素在体内代谢等研究提供方法,对临床合理补充外源性褪黑素具有指导性。     

高效液相色谱荧光检测法测定血浆同型半胱氨酸

[目的]建立使用高效液相色谱、等度洗脱、荧光检测法测定血浆同型半胱氨酸的方法。[方法]血浆同型半胱氨酸经Tris(2-Carboxyethyl)phosphate(17CEP)还原后，与7-Fluoro-benzo-2-oxa-1．3-diazole-4-sulohonate(SBD-F)衍生化，以胱氨为内标，C18反相色谱柱分离、等度洗脱，荧光检测器测定，以峰面积比进行定量。[结果]线性范围可达100μmol／L，最低检测限0．3μmol／L，批内不精密度1．2％-2．4％，批间不精密度1．4％-2．5％，平均回收率96．3-103％。[结论]本方法洗脱条件简单，准确性、特异性好，适用于临床实验室测定血浆同型半胱氨酸的含量。     

高效液相色谱电化学法直接测定血浆中同型半胱氨酸

[目的]建立以高效液相色谱电化学检测法(HPLC-ECD)直接测定血浆中同型半胱氨酸的方法。[方法]同型半胱氨酸被四氢硼酸钠还原后,利用色谱分离技术,以0．02mol／L醋酸盐缓冲液为流动相,电化学检测电极电位为 800mV,用外标法定量。并对其回收率、线性范围、最低检查限度、重复性进行实验。[结果]同型半胱氨酸的平均回收率为92．0％-96．5％,在2-160μmol/L内成线性,最低检查限度为0．5μmol/L批内与批问平均变异系数分别低于3．7％和4．7％。[结论]该法具有较新、简便、快速和直接的特点,适用于临床检测。     

一种新的高效液相色谱法选择性测定尿羟脯氨酸

目的　建立一种新的高效液相色谱法,选择性测定尿中羟脯氨酸的含量。方法　采用邻苯二甲醛和芴甲基氯甲酸酯两个衍生剂,先后处理尿标本,以国产 Ｃ８ 柱为固定相,在醋酸钠缓冲液中加入２３ ％ 的乙腈作为洗脱液,３ ,４脱氢脯氨酸作为内标。结果　测定结果的批内、批间变异系数分别为１ ．９２ ％ 和３ ．５８ ％ ,回收率为（９７ ．０ ±３ ．０） ％ ,在３１ ．２５ ～５００ ．００ μｍｏｌ／ Ｌ 范围内线性关系良好（ｒ 为０ ．９９７） 。结论　该法排除了尿液中具有一级胺结构的氨基酸在羟脯氨酸测定中的干扰,特异性好,无需梯度洗脱,适合临床检测需要。     

用高效液相色谱法检测2型糖尿病患者血浆游离脂肪酸谱的分析研究

目的 用高效液相色谱法分析T2DM患者血浆游离脂肪酸谱的变化.方法 收集武汉大学中南医院体检人群和住院患者,其中健康对照组94名、单纯T2DM组101例、T2DM合并高脂血症组77例.取受试者空腹静脉血,分离新鲜血浆,以正十七酸作为内标,以改良Doles法萃取游离脂肪酸,溴苯乙酮作为柱前衍化剂,采用Dionex Summit高效液相色谱法分析系统检测血浆游离脂肪酸谱,内标标准曲线法定量.结果 健康对照组、单纯T2DM组与T2DM合并高脂血症组3组之间的总游离脂肪酸浓度分别为(355.63±100.35)、(421.21±200.83)、(473.04±213.40)μmol/L,3组之间差异有统计学意义(X2=13.08,P<0.01),不饱和游离脂肪酸浓度依次为(206.29±61.94)、(218.11±110.28)、(240.94±116.79)μmol/L,3组之间差异无统计学意义(x2=2.17,P>0.05).单纯T2DM组与健康对照组比较,总游离脂肪酸升高[(421.21±200.83)μmol/L vs(355.63±100.35)μmol/L,x2=7.22,P<0.05],不饱和游离脂肪酸浓度和健康对照组差异无统计学意义.T2DM合并高脂血症组与健康对照组比较,总游离脂肪酸浓度升高[(473.04±213.40)μmol/L vs (355.63±100.35)μmol/L,x2=27.93,P<0.01].日间及日内RSD均<5%,最低检测浓度为0.05～0.35 μmol/L,高、中、低浓度下的回收率为96.4%～104.8%.结论 T2DM患者血浆总游离脂肪酸浓度升高,以饱和游离脂肪酸升高为主,不饱和游离脂肪酸改变差异无统计学意义.可能与T2MD的发生发展有关,有望成为糖尿病脂代谢紊乱的临床早期监测新指标.     

HPLC-UV检测法同时测定血浆色氨酸和犬尿氨酸的方法学研究

目的 建立一种同时测定血浆中Trp和Kyn浓度的HPLC-UV检测法.方法 以3-硝基酪氨酸(3-N-Tyr)为内标,采用Agilent Hypersil ODS色谱柱进行分离.流动相中醋酸缓冲液( 15 mmol/L,pH 5.5):乙腈为94∶ 6(v/v);流速为0.8 ml/min;柱温:25℃;紫外程序化检测波长:0～4 min,360 nm;4～5 min,302 nm.选取2010年9-12月重庆市九龙坡区第一人民医院15例慢性乙型肝炎患者、8例慢性肾炎患者、10例血小板减少性紫癜患者以及15名健康体检者,用该方法检测其血浆Trp、Kyn水平并计算Kyn/Tp比值;各指标在上述4组间的比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK法.结果 Kyn与Trp的保留时间分别为2.9 min和4.4 min,线性范围分别为0.44～18.30μmol/L和3.67～470.00 μmol/L,检测限分别为0.014 μmol/L和0.122 μmol/L.Kyn与Trp的日内变异均小于3％,日间变异均小于4％.平均回收率均在92.29％～104.40％之间.用该方法测定临床标本,健康对照组、慢性肾炎组、血小板减少性紫癜组以及慢性乙型肝炎组血浆中Kyn浓度分别为(1.59±0.28)、(2.73±0.56)、(2.69±0.44)和(1.54±0.48) μmol/L,Trp浓度分别为(59.8±10.0)、(46.1±11.7)、(58.5±8.0)和(41.4±13.1)μmol/L,Kyn/Trp比值分别为(0.027 4±0.007 5)、(0.061 6±0.0165)、(0.0467±0.0091)和(0.038 3±0.007 5),差异均有统计学意义(F值分别为23.734,8.463和20.921,P均＜0.01).结论 所建立HPLC-UV检测法可同时测定血浆中Kyn和Trp浓度,适合于临床检测.     

高效液相色谱测定血清胆固醇酯n-3脂肪酸指数方法的建立

目的 建立一种HPLC测定血清胆固醇酯n-3脂肪酸指数的方法.方法 血清标本来自于70名北京医院健康志愿者和36例冠心病患者,用NaOH乙醇溶液水解血清三酰甘油,乙酸终止水解反应,正己烷提取胆固醇和胆固醇酯,HPLC分离脂质,UV(205 nm)检测.20:5-CE和22:6-CE用液相色谱串联质谱鉴定,各胆固醇酯峰面积修正因子用测定相应组分胆固醇含量的方法确定,归一化法定量,计算n-3脂肪酸胆固醇酯的百分比(即胆固醇酯n-3指数).结果 色谱分析在6 min内完成;影响胆固醇酯n-3指数测定的三酰甘油用4 mol/L NaOH乙醇溶液水解30 s可被去除;测定血清胆固醇酯n-3指数的批内和总CV为0.66%和0.90%,106名试验对象血清胆固醇酯n-3指数略呈正偏态分布(偏度值=1.25,峰度值=1.70),全体中位数为0.98%(0.37%～2.40%).n-3指数对数基本呈正态分布,(x)±s为0.003 7%±0.15%.性别组n-3指数分布与全体类似,女性和男性中位数(范围)分别为1.08%(0.60%～2.40%)和0.95%(0.37%～2.11%),不同性别间差异具有统计学意义(t=-3.021,P=0.003).结论 成功建立了HPLC测定血清胆固醇酯n-3指数的方法,有望在营养监测和心血管病危险分析中发挥作用.     

高效液相色谱测定血清甘油三酯的研究——一种参考方法的建议

目的　建立特异、精密的血清总甘油和游离甘油测定方法 ,以便甘油三酯测定标准化。方法　以 1,2 ,4 丁三醇作内标 ,用柱前衍生高效液相色谱技术分析血清皂化前后的甘油含量 (两者分别代表血清游离甘油和总甘油浓度 )。结果　测定总甘油相对不精密度小于 2 % ,游离甘油小于 4% ;总甘油平均回收率 10 0 0 % ,游离甘油 99 7% ,与同位素稀释 /质谱法的相对偏差不大于± 2 %。结论方法特异、精密、简单 ,可望用作血清甘油三酯测定参考方法。     

高效液相色谱测定血清高密度脂蛋白胆固醇分数和摩尔酯化速率

目的 建立一种高效液相色谱(HPLC)测定血清高密度脂蛋白胆固醇分数和摩尔酯化速率(FERHDL和MERHDDL)的方法.方法 用5,5'二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)抑制全血中的卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)活性,分离血清,制备HDL;HDL分别在含和不含2-巯基乙醇(ME)的条件下37℃温育1 h,HPLC法测定HDL游离胆固醇,计算FERHDL和MERHDL.结果 DTNB可以有效抑制全血中的LCAT活性,使游离胆固醇稳定在初始水平;ME可有效解除DTNB对LCAT的抑制作用;测定血清FERHDL和MERHDL的总变异系数分别为1.59%～3.74%和1.64%～2.88%;70名健康志愿者FERHDL.均值为18.7%/h(标准差7.2%/h),中位数16.1%/h;MERHDL均值42.7 μmol·L-1·h-1(标准差11.8 μmol·L-1·h-1),中位数41.6 μmol·L-1·h-1;FERHDL和MERHDL与多种心血管病危险因素显著相关.结论 本研究建立了血清FERHDL和MERHDL准确测定的方法,方法安全、简便、精密,将为进一步研究和应用FERHDL和MERHDL打下基础.