重组血红蛋白的纯化

在大肠杆菌中用热诱导方式分别进行了人重组血红蛋白的α、β珠蛋白的非融合高效表达,并对表达产物进行阴离子交换、凝胶过滤纯化,使表达产物的纯度达90%左右。此为下一步制备和纯化人血红蛋白多克隆抗体奠定了关键基础。     

突变型(α99,β82位Lys-Cys)人重组血红蛋白的纯化

将基因突变型（α９９,β８２位Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）血红蛋白在ｐＢＶ２２０载体中诱导表达,表达产物达细菌总蛋白的２０％左右。该表达产物以包涵体形式存在,包涵体经洗涤后,用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解,先用Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ阴离子交换纯化,再经Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ－１００凝胶过滤纯化。纯化产物经复性,具有与氧结合的能力。     

重组人白介素21的表达、分离纯化及其体外生物活性的检测

白介素21(IL-21)是最新发现的与白介素2,白介素14和白介素15结构和序列同源的细胞因子.对于T细胞、B细胞和NK细胞有提高免疫应答等多种生物学活性.所以白介素21特别是人源白介素是一个抗肿瘤治疗和其他免疫治疗的一个潜在活性蛋白.为进一步研究IL-21,从刺激过的人外周血单核细胞中成功克隆成熟人白介素21编码基因,经过大肠杆菌密码子偏好的生物信息学分析、突变密码子、转化、诱导和CM-52阳离子交换柱分离纯化,实现了重组人白介素21蛋白在pET22b系统中的无标签表达.并将重组蛋白应用于淋巴细胞增殖实验和直接抗肿瘤(HepG2,K562和MDA)活性检测体外活性检测.结果表明,淋巴细胞增殖与重组人白介素21浓度成正相关,而r hIL-21对人肿瘤细胞无直接抗肿瘤活性.     

蜂毒肽基因在大肠杆菌中的表达、纯化及初步鉴定

目的通过pGEX-2T原核表达载体表达蜂毒肽。方法将人工合成整合了肠激酶作用位点的蜂毒肽基因,插入载体pGEX-2T,构建蜂毒肽与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-MEL。重组质粒转化E.coliBL21(DE3)诱导表达,超声破碎菌体,SDS-PAGE检测蛋白表达情况,取超声上清,通过GST亲和色谱系统纯化目的融合蛋白,酶切通过溶血实验检测其溶血活性。结果SDS-PAGE结果显示,表达了相对分子质量约为30 000的融合蛋白,目的融合蛋白量约占菌体总蛋白量的29.5%。经Western blot鉴定,表达的GST融合蛋白与GST抗体有强烈的交叉反应,说明成功表达了目的融合蛋白。取超声上清,亲和色谱纯化融合蛋白,纯度为95%。肠激酶切割得到了人工天然蜂毒肽,测定蜂毒肽回收率为80%。结论通过原核表达系统成功表达蜂毒肽,具有和天然蜂毒相同的溶血活性。     

重组TGF β1在大肠杆菌中的表达、纯化

目的通过pET 43.1原核表达载体,表达重组人转化生长因子β1(human transform growth fac-tor,rhTGFβ1)。方法将人工整合了肠激酶作用位点的TGFβ1,插入到含有NusA蛋白的融合表达载体pET 43.1中。重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21(+)并用IPTG诱导表达。通过镍柱纯化重组蛋白,用Western blot杂交检测重组蛋白的免疫原性,用肠激酶酶切得到TGFβ1单体。结果 SDS-PAGE结果显示,相对分子质量约为70 000的融合蛋白大部分在上清中表达,目的融合蛋白量约占菌体总蛋白量的80%。取超声上清,通过His亲和色谱系统纯化目的融合蛋白,纯度质量分数为95%。肠激酶切割得到TGFβ1单体,经Western blot检测重组蛋白的免疫原性。结论人转化生长因子β1在大肠杆菌中实现了高效表达,获得了具有免疫原性的重组TGFβ1。     

粒／巨噬细胞集落刺激生长因子在大肠杆菌内的表达及纯化

位／巨噬细胞集落刺激生长因子（GM－CSF）是最早发现的造血生长因子之一。美国FDA已批准重组人GM－CSF进入临床及市场，用于治疗艾滋病、肿瘤及白细胞减少等疾病。要获得大量均一的天然GM－CSF比较困难。1985年Wong及Lee分别克隆了人GM－CSF的CDNA，并在COS细胞内表达成功。19     

大肠杆菌表达的重组人肿瘤坏死因子的分离纯化

对表达在大肠杆菌里的重组人肿瘤坏死因子（ｒｈＴＮＦ－α）进行分离纯化。方法：采用疏水相互作用层析和离子交换层析。结果：考察了影响疏水相互作用层析纯化的因素,优化了层析操作条件;样品经疏水相互作用层析后,少量残余的杂蛋白可通过离子交换层析除去。结论：获得了比活性为 ２． ８９×１０~７ｕ／ｍｇ的 ｒｈＴＮＦ－α,总回收率为４０．６％。     

新基因Betatrophin原核重组蛋白表达及纯化

目的 构建人Betatrophin基因(h-Betatrophin)原核表达载体,诱导Betatrophin重组蛋白表达及纯化,为制备Betatrophin蛋白多克隆抗体及其功能研究打下基础.方法 体外克隆Betatrophin cDNA序列,酶切后连接到PET32 a(+)原核表达载体上,构建重组载体h-Betatrophin-PET 32 a,然后转入大肠杆菌BL 21(DE 3),用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE-考马斯亮蓝染色及Western blotting检测蛋白表达情况,然后用Ni-NTA His·Bind(R)Resin纯化目的蛋白.结果 成功构建Betatrophin基因原核表达载体,诱导表达Betatrophin重组蛋白表观分子量正确,经纯化后可以得到纯度较高的Betatrophin重组蛋白.结论 重组载体h-Betatrophin-PET 32 a转入大肠杆菌BL 21后通过诱导及纯化可获取到纯度很高的Betatrophin重组蛋白,为后期研究Betatrophin基因功能奠定基础.     

高效液相亲和层析介质的制备和对基因重组α-干扰素的纯化

以硅胶为基质，经表面改性和单克隆抗体固定化，制备了高效液相亲和层析介质。在改性反应中，以γ-缩甘油氧基丙基三甲氧基硅烷为改性剂，比较了水相法键合与有机相法键合的硅烷化率。用合成的α干扰素单克隆抗体高效液相亲和介质纯化由大肠杆菌表达的基因重组人α干扰素，层析过程的活性回收率为94％，纯化倍数为79倍，比活为7.94×106IU／mg。     

重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子的分离与纯化

探讨重组人粒－巨噬细胞集落刺激因子的分离、纯化工艺。方法;经破菌溶解包含体、复性等粗提纯后,以三步色谱法精制纯化,对终产品进行纯度、生物活性、热原及急性毒性检测。结果：终产品为单一条带、单一峰,生物活性为１．５９ ×１０~７～１．８６×１０~７ＩＵ／ｍｇ,热原测定及急性毒性试验符合要求。结论：此工艺纯化的产品纯度高、生物活性好,有一定的应用价值。     

重组人血管抑素生产菌培养基优化的研究

用正交试验对血管抑素生产菌株E.coli pQE32-AGN的发酵培养基成分进行了优化，优化后的合成培养基组成为：无水葡萄糖1％，(NH4)2SO4 0．4％，NaCl 0．2％，KH2PO4 0．3％，K2HPO4 2％，MgSO4 0．01％，盐酸硫胺素0．4mg／L，核黄素0．1mg／L，盐酸吡哆醇0．6mg／L，D-泛酸0．3ml／L，硫酸亚铁30mg／L，硫酸锂30mg／L，硫酸锰25mg／L，醋酸锌20mg／L，硫酸铝9mg／L，优化后的生物量达到9．0g／L以上，比采用1．13培养基培养的生物量提高了一倍多。同时，优化培养基对工程菌目的蛋白的表达、溶解及复性未产生不利影响。     

重组人白介素18的发酵、纯化及功能鉴定

目的:利用构建的重组菌株Pichia pastoris X-33/hlL-18,在3.7L发酵罐中表达重组人自介素18(hIL-18),探讨其大规模发酵及纯化工艺.方法:复苏工程菌X-33/hIL-18于BMGY培养基,在其A600鲫达到6左右时转入发酵罐进行高密度发酵.发酵液经过滤浓缩柱、疏水层析和阴离子交换层析分离纯化.结果:工程菌在3.7 L发酵罐采用甲醇诱导补料批式发酵,在pH 6.0,溶氧值(DO)20%～30%,温度28℃,甲醇诱导48 h重组hIL-18的表达产量为202 mg/L,发酵液经纯化后纯度可达97%以上,并初步证明重组hIL-18能协同IL-2诱导PBMCs分泌IFN-γ和协同IL-2增强NK细胞的杀伤活性.结论:利用Pichia pastoris分泌型表达系统和建立的分离纯化方法,能获得大量较高纯度的重组hIL-18,为进一步研究其活性和功能奠定基础.     

大规模牛血红蛋白提取方法的研究

建立了适合中国国情的大规模牛血红蛋白（Hb)的提取和纯化方法,为血液替代品的研究和生产提供原料保障。通过建立水性两相系统提取法、乙酸锌沉淀提取法、CO饱和提取法和板框过滤结合脱氧加热提取法,比较了用不同方法提取的牛Hb的纯度和牛Hb中所含的ertHb、HbCO和HbO2的含量。板框过滤结合脱氧加热提取法对器材要求不高,便于产业化,适合于为血液替代品的研究和生产提供合格的原料。     

重组人粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子初分离工艺的研究

目的:探讨重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)初分离工艺。方法:GM-CSF基因工程菌,通过改变溶菌酶浓度,TritonX-100浓度和尿素浓度,得到不同纯化程度的包涵体。结果:包涵体最终纯度可达到75％。结论:初分离后得到的包涵体纯度较高,且方法简单,有一定应用价值。     

包涵体重组蛋白的纯化及复性

综述了近年来国内、外在包涵体重组蛋白纯化及复性研究方面的主要进展．包括包涵体的处理及变性蛋白复性的各种最新技术、手段和方法     

人绒毛膜促性腺激素的精制、去热原工艺

以人绒毛膜促性腺激素（ＨＣＧ）粗品为原料，经乙醇分级沉淀和磷酸盐吸附两步骤获得符合《中华人民共和国药典》要求的ＨＣＧ精品．与ＤＥＡＥ－纤维素柱层析法比较，两种方法均可达到满意的纯化与去热原目的，但磷酸盐吸附法的回收率较高