人胃癌细胞定向克隆表达cDNA文库的构建及鉴定

克隆胃癌的相关基因，方法，提取人胃癌细胞总ＲＮＡ，分离共ｍＲＮＡ。以ＮｏｔｔＩ／ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２－１８为引物合成双链ｃＤＮＡ，除去小于４００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段后，连接ＥｃｏＲＩ接头，经ＮｏｔＩ酶酶切，插入定向克隆表达载体λＥｘｃｅｌｌＮｏｔＩ／ＥｃｏｒＲＩ／ＣＩＰ，体外包装后转染大肠杆菌ＮＭ５２２，构建了人胃癌细胞ＭＧＣ－８０３定向克隆表达ｃＤＮＡ文库。结果：文库含１．２＊１０＾６个重组子，     

人肝癌细胞定向克隆表达cDNA文库的构建及鉴定

为克隆人肝癌相关基因，本实验从提取人肝癌细胞总ＲＮＡ入手，分离其ｍＲＮＡ。以ＮｏｔＩ／ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２－１８为引物合成双链ｃＤＮＡ，除去小于４００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段后，连接ＥｃｏＲＩ人工接头，经ＮｏｔＩ酶酶切，     

K562细胞消减cDNA文库的构建及初步鉴定

背景与目的:消减杂交技术是一种寻找和克隆差异基因的方法。本研究目的是通过快速、高质量构建消减cDNA文库,筛选K562细胞中差异表达基因。方法:以用限制性显示(restriction display,RD)技术制备的K562细胞cDNA片段作为消减对象,以正常人淋巴细胞的Sau3AⅠ酶解cDNA片段对其进行消减。经过消减后的RD片段被分组扩增出来,并克隆于T载体中,挑选阳性克隆进行测序并进行初步分析。结果:构建的K562细胞消减cDNA文库,包含360个阳性克隆,插入片断大小范围在200～800bp之间,选取50个克隆进行测序分析,结果为来源于42个已知基因。结论:利用自行建立的消减杂交法,成功构建了特异性K562细胞消减cDNA文库,文库质量可靠,可用于进一步筛选及克隆K562细胞中差异表达基因。     

人胃癌转移型裸鼠移植瘤cDNA文库构建及分析

从人转移型胃癌裸鼠移植瘤中抽提出总RNA,分离出多聚腺苷酸RNA,合成双链cDNA,接上ECoRI接头,以pT7T3 18U质粒为载体,以大肠杆菌NM522为受体菌,构建了人转移型胃癌裸鼠移植瘤cDNA文库。该文库含1.5×10~6转化子,插入片段cDNA长度为0.4～6.0Kb,重组效率为80％,并用四种癌基因探针筛选了阳性克隆。     

人脑胶质瘤SHG—44cDNA文库的构建和鉴定

从人脑胶质瘤体外细胞系SHG－44中抽提总RNA，亲和纯化分离mRNA．逆转录合成cDNA，经重组连接，体外包装，感染大肠杆菌Y1090后建成的SHG－44cDNA文库，其库容量含9．25×105原代重组子，重组百分比94．9％，克隆效率为1．04×10pfu／μgcDNA．同时，以兔抗牛GFAP多抗为探针对该文库进行免疫筛选，得到了两个GFAP相关基因的cDNA克隆，在表达水平上，该cDNA文库含GFAP基因的频率为1．2×10-5，从而证实文库中有目的基因的有效表达，为与此相关的分子生物学研究提供了一个有用的工具。     

鼻咽癌上皮细胞株HNE1cDNA文库的构建及鼻咽癌表达上调基因的筛选

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国南方常见的上皮源性恶性肿瘤,流行病学研究调查,鼻咽癌的发生与EB病毒感染、某些环境理化因素及遗传因素有关,但其分子机理仍不十分清楚.鼻咽癌的发生可能涉及到多个瘤基因的激活和抑瘤基因的失活,但目前国际上仍未获得鼻咽癌特异相关基因.为了进一步筛选与克隆鼻咽癌特异相关基因,我们构建了鼻咽癌上皮细胞株HNE1cDNA文库,以供进一步深入研究.     

环行七肽CGNSNPKSC的受体鉴定及其在胃癌中的表达

目的：探讨血管特异结合短肽CGNSNPKSC在胃癌中的表达及与肿瘤分化程度的关系;初步筛选短肽CGNSNPKSC的受体.方法：采用免疫组化SP法检测CGNSNPKSC在胃癌中的表达及与分化程度的关系;以CGNSNPKSC作为＂探针＂免疫筛选表达型λZAP噬菌体cDNA文库,筛选CGNSNPKSC可能的受体,并利用生物信息学对阳性克隆进行初步分析.结果：CGNSNPKSC受体在高,中,低度分化胃癌的血管中表达率依次为12/18（67%）,17/23（74%）,22/24（92%）;在低分化胃癌组织中的表达明显高于高分化和中分化胃癌组织（P＜0.05）.cDNA文库筛选获得43个独立候选克隆,生物信息学显示分属于13种不同的基因.结论：CGNSNPKSC与胃癌的血管特异结合,可作为肿瘤血管抑制治疗的靶向载体.     

正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库的构建及差异基因的初步筛选

目的构建人正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库.方法采用抑制削减杂交技术,以正常肝组织及有肝癌背景的肝硬化组织作为对比材料.分离出mRNA,经反转录后,通过两轮杂交、两次PCR和T/A克隆构建了两种组织间差异表达基因的cDNA削减文库.结果挑取70个克隆进行酶切和PCR鉴定,显示65个克隆有250～2000 bp插入片段.结论用SSH和T/A克隆技术成功构建了正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库.该文库的建立为进一步筛选、鉴定出肝癌发生过程中的相关调控基因奠定了基础,也有助于阐明肝硬化在肝癌发生过程中所起的作用.     

nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株抑制消减cDNA文库的构建

背景与目的 已有的研究表明,nm23-H1基因是一个重要的肺癌转移抑制基因,为了筛选与该基因表达相关的差异表达基因.本研究拟构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆与nm23-H1转移相关的基因奠定基础.方法利用抑制消减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)技术构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)间差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库,经蓝白菌落筛选克隆,并PCR反应鉴定.结果 成功构建了该两株细胞株差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选,正向消减文库总共获得约300个白斑克隆,反向消减文库总共获得约400个白斑克隆,从正反向消减文库中各挑选96个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示在挑选的正向文库中有84个克隆有插入片段,反向文库中有83个克隆有插入片段.其片段大小范围为(300-750)bp.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,我们应用SSH法和T/A克隆技术成功建立了nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库.nm23-H1基因在肺癌细胞中的表达可能影响某些转移相关基因的差异表达.     

人肺癌细胞cDNA表达文库的构建

用磁珠从肺癌细胞株A549中直接分离mRNA.以随机六聚体为引物,在M-MLV反转录酶作用下,合成cDNA第一链,在RNaseH和DNA聚合酶的共同作用下合成双链cDNA,经T_4DNA聚合酶使其末端平齐化后,连接到经EcoRI酶切后消平的质粒表达载体中,电击转化E.coliDH5α.该文库大小约为9.0×10~5,重组子阳性率达85%,插入的cDNA长度约在0.5～4kb之间.以该文库cDNA为模板,应用PCR方法,首次从肺癌细胞中获得了死亡蛋白酶CPP32基因.该cDNA文库的构建为筛选调节肺癌细胞死亡的其它基因打下了基础.     

KDR基因沉默对胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡的影响

[目的]探讨KDR基因对胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡的影响。[方法]设计及合成KDR的siRNA序列,LipofectamineTM 2000转染MGC-803细胞。通过RT-PCR、Western Blot检测KDR在干扰后的mRNA和蛋白的表达情况,利用流式细胞仪检测细胞周期,WST-1法检测细胞增殖活性,TUNEL法检测细胞凋亡情况。[结果]KDR mRNA和蛋白表达,观察组较对照组和空白组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组细胞的生长速度明显减慢,细胞周期被阻滞在G0/G1期,S期细胞数减少,差异有统计学意义(P<0.05)。转染KDRsiRNA的MGC-803细胞的增殖能力明显受到抑制(P<0.05),且明显促进了细胞的凋亡,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]特异性干扰KDR基因表达可抑制胃癌MGC-803细胞的增殖,并促进肿瘤细胞凋亡。KDR的siRNA序列可能成为治疗胃癌的有效靶点。     

非小细胞肺癌T7噬菌体展示文库的构建

背景与目的SEREX(Serological analysis of recombinant expression libraries)是近年来发展起来的一种寻找肿瘤相关抗原的方法,通过与噬菌体展示技术结合,可以有效和快速的筛选肿瘤相关抗原。本研究拟构建人肺鳞癌和肺腺癌T7噬菌体展示cDNA文库,为进一步筛选和鉴定非小细胞肺癌相关抗原打下基础。方法诊断明确的肺鳞癌和腺癌患者手术标本各5例,Trizol试剂提取总RNA,Straight A's系统分离鳞癌和腺癌mRNA,逆转录合成双链cDNA后,与T7Select 10-3载体连接,体外包装并扩增得到人肺鳞癌和腺癌T7噬菌体展示cDNA文库。结果构建肺鳞癌和肺腺癌T7噬菌体展示cDNA文库各一个,原始文库重组克隆数分别为鳞癌1.8×106pfu,腺癌5×106pfu。扩增后滴度为3.2×1010pfu/mL和2.5×1010pfu/mL。随机从2个文库中各抽取24个克隆PCR扩增插入片断,电泳结果显示肺腺癌文库所有克隆均有插入片段,肺鳞癌文库插入率超过95%(23/24)。两个文库插入片断大小均在(300-1500)bp之间。结论成功构建了人肺鳞癌和腺癌T7噬菌体展示cDNA文库,为下一步筛选和鉴定非小细胞肺癌相关基因奠定基础。     

人胃癌细胞系(BGC-823)的细胞遗传学研究

本研究以人胃癌(BGC-823)细胞系为材料,自建系后40～60代进行了细胞遗传学研究。先后共计数600个分裂中期细胞的染色体数,并对其中的30个分裂相作了胰酶消化和G-分带。核型分析结果表明:染色体众数为亚三倍体,发现了规律性出现的标记染色体和Ⅰ号染色体长臂的部分缺失,部分核型出现双微小体。带型分析表明。Ⅰ号标记染色体为染色体11,12间的易位,t(11,12)(11pter→11q23::12q13→12qter).12号染色体的断裂点和染色体的脆性部位位于同一染色体区带(12q13)。这将有助于阐明此系的癌基因ras与标记染色体的关系,进而了解癌变过程中癌基因的作用。     

雪灵芝水提物对人胃癌MGC-803细胞增殖及细胞周期的影响

目的探讨雪灵芝水溶性提取物(arenaria kansuensis aqueous extract,AKAE)对人胃癌细胞株MGC-803细胞增殖及细胞周期的影响。方法体外培养的MGC-803细胞经不同浓度AKAE处理,采用MTT法检测受试细胞增殖水平;应用流式细胞术检测AKAE处理12 h后各组细胞的细胞周期;Western blot检测不同浓度、不同时间AKAE处理组MGC-803细胞中cyclin D1蛋白表达水平;实时定量 PCR检测各组MGC-803细胞中cyclin D1、p16和p21基因的mRNA相对表达量。结果AKAE对体外培养的MGC-803细胞增殖具有浓度依赖性抑制作用（P<0.05）,IC₅₀为(0.134±0.005)mg/ml;经AKAE处理12 h,0.8 mg/ml组MGC-803细胞的 G₁期细胞比例高于对照组、S期细胞比例低于对照组（P<0.05）;(0.2～0.8) mg/ml浓度的AKAE处理,对MGC-803细胞中cyclin D1的蛋白及mRNA表达具有明显抑制作用（P<0.05）;AKAE促进MGC-803细胞中p16、p21基因mRNA 表达,0.2 mg/ml处理组p16、p21 mRNA相对表达量分别为对照组的3.3倍和18.5倍。结论雪灵芝水提物(AKAE)对MGC-803细胞增殖具有抑制作用,其机制与G₁期阻滞和对G₁期相关因子表达的影响有关。     

Expression of Fas Antigen and Its Mediation of Apoptosis in Human Gastric Cancer Cell Lines

Fas, a member of the tumor necrosis factor receptor/nerve growth factor receptor family, induces apoptosis by crosslinking with Fas ligand or anti-Fas antibody in a variety of cultured cells. We examined the expression of Fas antigen and its mediation of apoptosis in six human gastric carcinoma cell lines. Flow cytometric analysis and western blotting revealed relatively high expression of Fas antigen in MKN-74 (wild-type p53 gene) and MKN-45 (wild-type), followed by MKN-1 (mutated), MKN-7 (mutated) and KATO-III (deleted). MKN-28 (mutated) showed minimal expression of the antigen. The expression was apparently enhanced by interferon-γ, except for MKN-1 and MKN-28. Anti-Fas antibody (100 ng/ml) induced nuclear fragmentation characteristic of apoptosis. Apoptosis occurred in a delayed fashion and the apoptotic index at 72 h was approximately 60% in MKN-74, 35% in MKN-45, and 20% in MKN-1 and KATO-III. A DNA ladder was noted in MKN-74 at 72 h. Expression levels of P53 and P21^Wafl did not change for up to 48 h in MKN-74. The biological effects did not correlate with endogenous Bcl-2 expression. These results indicated that a) Fas antigen is variably expressed in human cultured gastric carcinoma cells, b) the protein transduces an apoptotic signal which leads to delayed cell death, and c) susceptibility to the antibody correlates well with the expression level of Fas antigen.     

鱼藤素和氟尿嘧啶对胃癌细胞株MGC-803的协同抗肿瘤作用

[目的]观察鱼藤素与氟尿嘧啶联用对胃癌细胞的作用。[方法]胃癌MGC-803细胞经鱼藤素、氟尿嘧啶单药及两药联合处理48h后,MTT法检测其对细胞生长增殖抑制水平,采用等效图解法分析其作用;流式细胞术检测经鱼藤素处理后MGC-803细胞周期的变化。[结果]鱼藤素可剂量依赖性抑制MGC-803细胞增殖,有G1期阻滞作用,与氟尿嘧啶联用可明显增强细胞杀伤作用。[结论]鱼藤素与氟尿嘧啶联用可产生明显协同作用,机制为两者作用于不同细胞周期,增强了细胞对氟尿嘧啶的敏感性。     

人卵巢癌cDNA表达文库的构建

以polyA~ mRNA提取试剂盒从卵巢癌组织中获得高质量的polyA~ mRNA,并以此合成第1、2链cDNA.cDNA两端补平后加EcoR Ⅰ接头,Xbo酶切,通过分级分离去除<400bP的片段.取100ng cDNA与噬菌体表达载体Uni-ZAP XR连接,体外进行噬菌体DNA包装,并立即进行文库的滴定和扩增,获得卵巢癌cDNA表达文库.该文库原始重组子为10~6独立克隆;重组率>99%;并以引物PUCⅠ、PUCⅡ扩增插入片段,平均大小约为1.1kb.证实此cDNA表达文库合格.以PCR从此cDNA表达文库中筛选HLA-DPB和β-actin基因,获得成功.     

PPARγ激活剂罗格列酮对人胃癌MGC803细胞周期及其PTEN表达的影响

目的探讨不同浓度的罗格列酮对人胃癌MGC803细胞增殖及其PTEN蛋白表达的影响。方法不同浓度的罗格列酮(12.5、25、50、100μmol/L)分别与MGC803细胞系共同培养48 h后,采用流式细胞仪检测罗格列酮对MGC803细胞周期的影响,免疫细胞化学检测MGC803细胞PTEN蛋白表达。结果罗格列酮使MGC803细胞停滞于细胞周期G1期,呈剂量依赖性,并诱导PTEN表达上调。结论罗格列酮可以通过诱导PTEN表达上调,使MGC803细胞停滞于细胞周期G1期,进而抑制人胃癌MGC803细胞生长,这可能是PPARγ激活剂抗肿瘤的机制之一。