BDNF对诱导分化的SH-SY5Y细胞G_1期相关蛋白表达的影响

研究不同浓度的脑源性神经营养因子(BDNF)在体外诱导SH-SY5Y细胞分化时对G1期细胞周期相关蛋白表达的影响。采用全反式维甲酸(RA)和低(1ng/ml)、中(10ng/ml)、高(100ng/ml)三种不同浓度BDNF在无血清培养液中相继诱导SH-SY5Y细胞分化,形成均一的具有神经元形态的细胞。以实时定量RT-PCR法检测G1期细胞周期相关蛋白(包括cdk4,cdk6,cyclin D1,Cyclin E,p16和p27)的mRNA水平的表达变化。结果显示:不同浓度的BDNF处理后,Cdk4mRNA的表达水平均低于未分化细胞组(P<0.05);Cdk6和Cyclin D1的mRNA表达水平与RA组比较显著降低(P<0.05),Cyclin E和p16的mRNA表达水平仅在高浓度BDNF处理后明显降低,与未分化组比较P<0.05,p27的mRNA表达水平无显著变化。以上结果提示BD-NF在诱导SH-SY5Y细胞分化的同时无意促使其再进入细胞周期。同时,用RA预处理5d后改换BDNF培养SH-SY5Y细胞,可使细胞展现出成熟神经细胞的形态,是体外研究某些脑疾病的理想细胞模型。     

应激和分子伴侣对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞毒性的保护作用

目的:本文探讨应激和分子伴侣(stress and chaperone,STCH)对鱼藤酮的神经毒性之于SH-SY5Y细胞的保护作用及其可能的作用机制。方法:采用不同浓度鱼藤酮处理SH-SY5Y-pcDNA 3.1和SH-SY5Y-pcDNA3.1-STCH稳定细胞株,并观察细胞形态;采用MTT法和Western蛋白印迹法检测MAPK通路相关的信号分子和凋亡相关蛋白变化。结果:与未处理组相比,鱼藤酮均能引起细胞活力显著下降(P<0.05);STCH对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞毒性具有明显的保护作用(0.1μmol/L-5μmol/L),但10μmol/L浓度组与转染空载体组无显著差异。激活型caspase-3蛋白在鱼藤酮毒素处理后表达明显,p38磷酸化增强,过表达STCH在鱼藤酮处理后p38磷酸化受到明显抑制,裂解的caspase-3活性形式减少。结论:STCH对鱼藤酮诱导神经毒性的保护作用可能通过抑制p38磷酸化而实现。     

单纯疱疹病毒2型潜伏感染激活模型的建立及潜伏相关转录子开放读码框架抑制后对潜伏相关转录子基因表达的影响

目的 研究单纯疱疹病毒2型(HSV-2)潜伏感染激活中潜伏相关转录子(LAT)开放读码框架(ORF)抑制后对LAT基因表达的影响。方法 建立HSV-2潜伏感染复发的神经细胞(SHSY5Y)模型。运用相差显微镜观察HSV-2潜伏及激活后SH-SY5Y细胞形态的变化。对病毒在细胞中的潜伏及激发进行PCR验证并测序。设计3对siRNA,激活诱导后转染SH-SYSY细胞,相差显微镜观察细胞形态变化,RT-PCR半定量检测转染前后LAT ORF表达的改变。结果在存在60 μmol/L阿昔洛韦(ACV)的环境,HSV-2在SH-SY5Y细胞中建立潜伏状态。病毒在SH-SY5Y细胞中最长可潜伏14d。43℃ 1.5 h诱导病毒潜伏激发,而相差显微镜观察发现,病毒激发后细胞病变从24h到72 h,细胞变性、坏死的程度、数量随感染时间延长而增加。HSV-2 LAT、糖蛋白G(gG)基因PCR扩增及电泳结果证实病毒在细胞中的潜伏及激活。LAT ORF-siRNA转染细胞后,LAT ORF mRNA的表达水平在转染后24、36和48 h分别减少了39％、51％和60％。结论 抑制LAT ORF后能够抑制HSV-2 LAT基因的表达,为进一步研究LAT ORF在病毒潜伏感染复发中的作用提供了依据。     

p27~(Kip1)在永生化人神经前体细胞分化中的作用研究

目的:利用全反式视黄酸(all-trans retinoic acid,RA)诱导永生化的人神经前体细胞(immortalized human neural progenitor cells,hSN12W-TERTcells)分化,研究分化过程中细胞周期调节蛋白p27Kip1,p21Cip1,细胞周期蛋白激酶2(cyclin-dependent kinase2,cdk2)及细胞周期蛋白E(cyclinE)的变化,探讨永生化人神经前体细胞分化的相关分子机制。方法:取本课题组已经建立的永生化人神经前体细胞系hSN12W-TERT细胞(第12代)培养并给予1μmol/L RA诱导。在RA诱导的第3,7d观察细胞形态变化,用RT-PCR方法检测RA诱导前后hSN12W-TERT细胞p27Kip1,p21Cip1,cdk2及cyclinE mRNA的变化,用免疫细胞化学染色方法比较RA诱导前后p27Kip1蛋白表达的变化。结果:RA诱导第3d,hSN12W-TERT细胞比未经RA诱导的正常hSN12W-TERT细胞生长缓慢且形态发生改变,表现为胞体变小,突起延长增多。至RA诱导第7d时,hSN12W-TERT细胞形态变化更加明显,接近成熟神经元形态。RT-PCR结果表明,hSN12W-TERT细胞中p27Kip1mRNA的表达在RA诱导后明显增加,而p21Cip1mRNA的表达在RA诱导后略呈下降趋势。hSN12W-TERT细胞中cdk2、cyclinE的mRNA水平在RA诱导前后没有明显变化。免疫细胞化学染色结果显示,RA诱导第3d,hSN12W-TERT细胞p27Kip1的表达比未经RA诱导的正常hSN12W-TERT细胞明显增加(P0.05),RA诱导第7d,p27Kip1的表达进一步增加(P0.05)。结论:p27Kip1参与RA诱导的永生化人神经前体细胞生长阻滞和分化过程,p27Kip1可能在永生化人神经前体细胞的神经元分化过程中发挥重要作用;且RA诱导后p27Kip1蛋白含量的增加是通过转录水平调节的。     

SH-SY5Y细胞凋亡过程中Cpne5蛋白表达的变化

目的探讨Cpne5蛋白在SH-SY5Y细胞凋亡中表达量的变化。方法显微镜观察细胞形态及流式细胞术检测凋亡率,鉴定A23187诱导SH-SY5Y细胞凋亡及血清剥夺诱导凋亡的模型;免疫印迹法检测两种凋亡过程中Cpne5蛋白表达量的变化。结果 10μmol/L A23187诱导SH-SY5Y细胞24h,细胞出现皱缩、凋亡率增加。A23187诱导0.5h,Cpne5蛋白表达量即出现明显的上升,持续至12h;在24h时Cpne5蛋白表达量回落至诱导前水平。血清剥夺72h的SH-SY5Y细胞24份,凋亡率为23.2±2.1%,与对照组1.1±0.1%比,差异有统计学意义（P〈0.01）。免疫印迹结果表明,SH-SY5Y细胞分别经血清剥夺1h、6h、12h、24h、72h对Cpne5蛋白表达量无明显变化。结论 A23187诱导SH-SY5Y细胞凋亡早期Cpne5蛋白表达量有显著变化;提示Cpne5基因可能参与凋亡调控的钙信号通路。     

Bcl-xl和p53在人卵巢癌SKOV3细胞中表达及中药干预作用

目的探讨Bcl-xl、p53基因在白毛藤诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡中的作用。方法不同浓度白毛藤作用于细胞,荧光显微镜观察人卵巢癌SKOV3细胞凋亡作用,RT-PCR法检测Bcl-xl、p53基因表达量的变化。结果白毛藤能诱导人卵巢癌细胞凋亡,并且上调p53和降低Bcl-xl表达。结论白毛藤促进凋亡,其机制可能与激活p53、抑制Bcl-xl表达有关。     

mGluR4激动剂对氧糖剥夺SH-SY5Y细胞损伤的保护作用研究

目的:研究m GluR4在SH-SY5Y细胞氧糖剥夺模型中的预防作用,并探讨其相关机制。方法:维甲酸(RA)诱导体外培养SH-SY5Y并构建氧糖剥夺模型,将细胞分为对照组、氧糖剥夺组(OGD)、OGD+m GluR4激动剂VU0155041处理组、OGD+VU0155041+SB202190处理组。CCK8检测细胞存活率; Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,Western Blot检测蛋白表达水平;流式细胞仪检测细胞增殖。结果:RA诱导的SH-SY5Y细胞中广泛表达m GluR4,而m GluR4在小胶质瘤细胞中不表达; 10μmol/L的m GluR4激动剂VU0155041可显著预防OGD处理的SH-SY5Y细胞活力; m GluR4激动剂VU0155041可显著预防OGD引起的SH-SY5Y细胞凋亡,并且m GluR4激动剂VU0155041对细胞的保护作用与增殖无关; OGD可促进p-p38 MAPK通路的激活,并上调Cytc、active caspase 3水平;而m GluR4激动剂VU0155041可下调p-p38 MAPK水平,下调Cytc、active caspase 3水平,抑制细胞凋亡; p38 MAPK通路阻断剂SB202190可下调Cytc、active caspase 3水平、抑制细胞凋亡。m GluR4激动剂通过p38 MAPK通路调控SH-SY5Y细胞的存活。结论:m GluR4激动剂通过p38 MAPK通路调控SH-SY5Y细胞的存活。     

XAV939抑制人神经母细胞瘤细胞的增殖

目的探讨小分子抑制剂XAV939对人神经母细胞瘤(NB)细胞系SH-SY5Y细胞的抗增殖和诱导凋亡的作用,及其可能机制。方法采用MTT法检测XAV939对SH-SY5Y细胞活力的抑制作用,并确定最佳作用浓度。然后采用Annexin V-FITC法检测XAV939处理后早期凋亡细胞百分比,Hoechst33342染色法观察凋亡细胞核形态,克隆形成实验检测细胞体外增殖能力的变化。Western blotting检测Wnt/β-连环蛋白(β-catenin信号通路的关键蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2的变化。结果 MTT结果显示,1μmol/L XAV939作用24h后,SH-SY5Y细胞增殖的抑制率有明显上升。XAV939处理后48h及72h,凋亡细胞百分比显著高于对照组,且细胞呈现出不同程度的凋亡形态。此外,XAV939可显著降低SH-SY5Y细胞的体外克隆形成率,降低Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin,Cyclin D1和c-Myc及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。结论 XAV939可能部分通过抑制Wnt/β-catenin信号通路而抑制SH-SY5Y细胞的增殖。     

β-巯基乙醇与全反式维甲酸对小鼠胎肝间充质细胞神经胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的:探讨β-ME与RA对体外胎肝间充质细胞神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响。方法:无菌条件下获取胎龄14.5d的胎肝细胞,DMEM/HEPES/F12(20％FCS)培养弃去非黏附细胞,得到间充质细胞并传代,第5代细胞经β-巯基乙醇(β-ME)与全反式维甲酸(RA)程序化诱导处理后5h、5d用免疫细胞化学鉴定GFAP抗原表达,同时以β肌动蛋白基因为内对照,用半定量RT-PCR检则GFAPmRNA表达情况。结果:胎肝间充质细胞经β-ME,RA诱导处理后大多数细胞呈现神经细胞样的形态。免疫细胞化学显示处理后的细胞约85％表达GFAP;半定量RT-PCR结果显示处理后的细胞GFAP基因mRNA水平表达增加(P＜0.01)。结论:胎肝间充质细胞在体外培养条件下,经过β-ME与RA程序化处理,GFAP表达阳性。     

人参皂苷Re对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞缺氧复氧损伤的保护作用

目的：探讨人参皂苷Re 对人神经母细胞瘤SH-SY5Y 细胞缺氧复氧损伤的保护作用。 方法：采用缺氧复 氧法制备SH-SY5Y 细胞损伤模型,分为对照组、模型组、Re 6.25 μg/mL 组和Re 12.50 μg/mL 组。采用MTT 法测定细胞存活率,四甲基罗丹明甲酯（TMRM）染色评估细胞线粒体膜电位变化,DAPI 染色观察细胞凋亡 率,并进一步采用免疫印迹检测各组细胞核因子NF-E2 相关因子2（Nrf-2）、Bax 和p53 的蛋白表达。 结果：人 参皂苷Re 对SH-SY5Y 细胞活力无显著影响;缺氧复氧条件下,细胞存活率显著降低,而人参皂苷Re 在6.25、 12.50 μg/mL 浓度下预保护可显著提高细胞存活率。缺氧复氧损伤后,人参皂苷Re 6.25、12.50 μg/mL 能显著提 高SH-SY5Y 细胞的线粒体膜电位水平和抑制SH-SY5Y 细胞的凋亡率。人参皂苷Re 能够提高Nrf-2 的蛋白表达, 抑制Bax 和p53 蛋白的表达。结论：人参皂苷Re 可以抑制缺氧复氧损伤细胞的凋亡和氧化损伤,对缺氧复氧诱导 的神经细胞具有显著的保护作用。     

Bcl-xl基因克隆及其在SH-SY5Y细胞中的表达

目的研究Bcl-xl基因在SH-SY5Y细胞中的表达。方法构建真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,采用脂质体介导将重组质粒导入SH-SY5Y细胞,RT-PCR和Western-blot检测外源基因表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,并用脂质体介导的方法高效转染SH-SY5Y细胞,RT-PCR显示有Bcl-xlmRNA表达增加,Western-blot显示有32kD的蛋白质表达增加。结论重组质粒pIRES2-EGFP/Bcl-xl经转染能够在SH-SY5Y细胞中高效表达,为进一步研究Bcl-xl对SH-SY5Y细胞的生物学功能奠定了基础。     

TSG101小干扰RNA对SH-SY5Y细胞生长和药物敏感性的作用

目的：探讨TSG101基因对人神经母细胞瘤细胞生长和药物敏感性的调节作用。方法:构建TSG101基因的小干扰RNA载体并将其转导入SH-SY5Y细胞，G418筛选后获得稳定转染的阳性克隆后，应用RT-PCR和Western blotting进行鉴定；MTT法和流式细胞仪检测细胞转染前后生长速度和细胞周期的变化；DNA ladder法和流式细胞仪检测细胞转染前后对顺铂诱导的凋亡的变化；Western blotting检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax，耐药相关蛋白P-gp、MRP的表达变化。结果:成功构建了TSG101的小干扰RNA载体并将其转染SH-SY5Y细胞；筛选到稳定的TSG101低表达的神经母细胞瘤细胞模型；MTT和流式细胞仪检测结果显示，转染TSG101小干扰RNA后的细胞的生长速度显著减慢于对照组（P<0.05），且G1期的细胞比率显著高于对照组（P<0.05）；DNA ladder法和流式细胞仪检测结果显示，用10 mg/L CDDP处理36 h后，转染TSG101小干扰RNA后的细胞的凋亡数显著多于对照组（P<0.05），形成DNA条带；Western blotting显示，转染TSG101小干扰RNA后的细胞中Bcl-2和P-gp的表达明显低于对照组。结论：下调TSG101基因能抑制神经母细胞瘤细胞生长，增加细胞对化疗药物的敏感性，提示TSG101在基因治疗中具有较好的临床应用前景。     

利多卡因对SH-SY5Y细胞的损伤作用

目的: 采用SH-SY5Y细胞体外培养模型,通过观察细胞形态、测定细胞活力和细胞凋亡率,探讨不同浓度利多卡因对SH-SY5Y细胞的损伤作用。方法: SH-SY5Y细胞离体培养, 分为4组, 即: 正常培养组(对照组, 未经药物处理); 0.5%、1%、2%利多卡因组(L1、L2、L3组), 分别用相应浓度的利多卡因处理SH-SY5Y细胞10 min。在药物处理10 min后观察细胞形态, 并分别在药物处理后5 min (T1)、10 min (T2)、药物处理结束后15 min (T3)、药物处理结束后12 h (T4)测定细胞活力及细胞凋亡率。结果: 正常培养SH-SY5Y细胞胞体粗大, 呈多角形, 出现树突状突起, 神经突起, 多而粗大, 分布成网络, 各实验组SH-SY5Y细胞则变圆, 回缩, 轴突渐消失。各实验组不同浓度的利多卡因对SH-SY5Y细胞活力均有明显影响, 利多卡因处理5 min后, 各组细胞活力明显下降, 且随剂量增加, 细胞活力下降明显增加。对照组细胞凋亡率在各时点保持在5.9%~6.3%之间, 实验组细胞在利多卡因处理后各时点细胞凋亡率明显增加, 且随着浓度的增加,细胞凋亡率也增加。结论: 0.5%、1%、2%利多卡因对SH-SY5Y细胞均有损伤作用, 且随浓度的增加,损伤程度加重。     

依达拉奉通过microRNA-25抑制高糖诱导的SH-SY5Y细胞凋亡

目的:探讨依达拉奉通过微小RNA-25(microRNA-25,miR-25)对高糖诱导的人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法:将SH-SY5Y细胞用含高浓度葡萄糖的DMEM培养基和依达拉奉的联合培养液共同培养24 h。MTT比色法测定SH-SY5Y细胞存活率;DCFH-DA荧光探针法检测SH-SY5Y细胞中活性氧簇(ROS)的水平;采用流式细胞术检测SH-SY5Y细胞的凋亡率;Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平;实时定量PCR检测细胞中miR-25的表达水平。为进一步阐明依达拉奉抑制高糖诱导的神经细胞凋亡的作用靶点,我们将miR-25抑制剂应用于细胞,之后采用caspase-3凋亡试剂盒检测细胞的凋亡率。结果:与对照组相比,高糖诱导后细胞存活率明显降低,细胞中的ROS水平和细胞凋亡率明显升高,Bax的表达明显增加,Bcl-2的表达明显降低,miR-25的表达水平也明显降低。给予依达拉奉治疗之后,细胞存活率明显升高,ROS含量和细胞凋亡率明显降低,Bax的蛋白水平明显降低,Bcl-2蛋白水平明显升高,miR-25的表达水平亦明显升高。进一步给予miR-25抑制剂后,caspase-3的水平明显升高,此时同时给予依达拉奉后并不能抑制高糖引起的神经细胞的凋亡。结论:依达拉奉对高糖诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有抑制作用,其作用靶点可能是miR-25。     

RNAi下调survivin表达诱导成人神经细胞瘤细胞凋亡

目的利用RNA干扰技术下调凋亡抑制因子survivin在人成神经细胞瘤细胞系SH-SY5Y中的表达,并评价其对肿瘤细胞凋亡的影响。方法将设计合成的寡核苷酸片段退火后连入pBSHH1构建survivin的短发夹RNA表达质粒pBSHH1-survivin;通过RT-PCR和Western印迹评价其对SH-SY5Y细胞内源性survivin表达的抑制作用;运用Hoechst33258核染色、DNA凝胶电泳以及AnnexinFITC染色检测survivin表达下调对SH-SY5Y细胞凋亡的影响。结果酶切和DNA测序证实survivin的短发夹RNA表达质粒构建成功;RT-PCR和Western印迹表明质粒转染SH-SY5Y细胞后能明显下调survivin的表达;Hoechst33258核染色、DNA凝胶电泳以及AnnexinⅤFITC染色显示下调survivin的表达能诱导SH-SY5Y细胞凋亡。结论成功构建了有效针对survivin的短发夹RNA表达质粒;下调survivin的表达能诱导SH-SY5Y细胞凋亡。     

Resistance to geldanamycin-induced apoptosis in differentiated neuroblastoma SH-SY5Y cells

Geldanamycin (GA) is a specific inhibitor of the 90 kDs heat shock protein (Hsp90) in the cytoplasm of mammalian cells, which binds directly to Hsp90 and promotes proteolytic degradation of its client proteins. As an antitumor drug, GA antagonizes the protecting effects of Hsp90 on cell survival, while its mechanisms remain unclear. Here, we show that GA induces apoptosis in a human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. Treatment of the cells with all trans retinoic acid (RA) generates a neuron-like, morphological change of differentiation, and results in the activation of ERK and Akt pathways, an inhibition of the nuclear translocation of p53 induced by GA, and induces higher resistance to the GA-induced apoptosis. These results provide the first evidence for the requirement of p53 nucleation in SH-SY5Y cells to counteract GA in neuron survival.     

α-突触核蛋白在体外培养SH-SY5Y细胞内过表达可导致氧应激

目的：观察α-突触核蛋白基因在SH-SY5Y细胞内过表达对细胞的影响。 方法： LipofectAMINE法转染SH-SY5Y细胞，用G418对转基因细胞进行筛选，免疫荧光细胞化学检测α-突触核蛋白表达，氧化应激敏感的荧光素探针DCF-DA对活细胞进行染色后用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞内氧应激状况，还原型谷胱甘肽测定试剂盒通过分光光度计检测细胞内还原型谷胱甘肽水平。 结果： 转染细胞筛选后，细胞呈α-突触核蛋白免疫反应阳性；转α-突触核蛋白基因细胞内存在DCF信号增强和还原型谷胱甘肽水平下降。 结论： α-突触核蛋白过表达可引起细胞内氧应激，表明α-突触核蛋白在帕金森病发病机制中可能起重要作用。     

Responsiveness of voltage-gated calcium channels in SH-SY5Y human neuroblastoma cells on micropillar substrates

In this study, poly-L-lactic acid micropillar substrates were fabricated to evaluate the influence of topographic substrates on cell morphological and functional characteristics, such as spreading area, voltage-gated calcium channels (VGCCs) and membrane potential. The proliferation, spreading area, perimeter and circularity of SH-SY5Y cells interfaced with different substrates were first investigated. In addition, the cytoskeleton and focal adhesion of a cell as important manifestations of cell morphology were analyzed by immunofluorescence. VGCC responsiveness was evaluated by measuring the dynamic changes in intracellular Ca²⁺ evoked by 50 mM extracellular K⁺. To determine study whether the differences in VGCC responsiveness were caused by the differences in VGCC gene expression, the expression of N/L- type VGCCs was determined by qPCR and fluorescence staining. Notably, improved measurement of the membrane potential with potentiometric fluorescent dye TMRM was applied to determine the membrane potential of SH-SY5Y cells. Results indicated that the SH-SY5Y cells were deformed significantly to adapt to the substrates; however, no distinct effect on the proliferative ability of SH-SY5Y cells was observed. The micropillar substrates markedly influenced VGCC responsiveness, which correlated strongly with cell spreading but not with VGCC expression. The resting membrane potential of SH-SY5Y cells cultured on different substrates also changed, but no effect on responsiveness of VGCC was observed. These results suggest that the effect of the micropillar substrates on cell VGCC responsiveness may be attributed to changes in the functionality of the ion channel itself. Thus, topographic substrates can be used to engineer cell functionality in cell-based drug screening.