IFN-γ＋874位点单核苷酸多态性和蛋白表达水平与肠道病毒71感染关系

目的研究干扰素Ⅱ型（IFN-γ）基因＋874位点单核苷酸多态性及IFN-γ在血清中表达水平与肠道病毒71（EV71）感染的关系,探讨EV71感染的遗传易感因素。方法取急性期手足口病病儿粪便进行病毒分离,序列特异性引物-聚合酶链反应（PCR-SSP）技术检测EV71感染者及正常对照儿童IFN-γ基因第一内含子＋874位点T/A单核苷酸多态性;ELISA法测定血清中IFN-γ的表达水平。结果 78例手足口病病儿中有43例为EV71感染。EV71感染病儿血清中IFN-γ的水平显著高于正常对照组（t=6.477,P〈0.01）。EV71感染病儿IFN-γ基因型与对照组比较差异有显著性（2χ=6.149,P〈0.05）。EV71感染病儿等位基因频率与对照组比较差异有显著性（2χ=7.486,P〈0.05）。EV71一般感染组IFN-γ基因型分布与脑炎组相比,差异无显著意义（P〉0.05）,脑炎组IFN-γ等位基因A频率明显高于一般感染组（χ2=6.211,P〈0.05）。结论 IFN-γ表达水平和其基因第一内含子＋874位点多态性与EV71感染有关,与是否发生EV71脑炎有一定相关性。     

再生障碍性贫血患者的载脂蛋白B,E基因多态性分析

我们应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，研究２３例再生障碍性贫血（再障）患者载脂蛋白Ｂ，Ｅ（ＡｐｏＢ，Ｅ）基因限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰｓ）。比较再障患者与正常人的ＡｐｏＢ基因ＸｂａⅠ和ＥｃｏＲⅠ酶切位点ＲＦＬＰｓ的差异及ＡｐｏＥ基因ＨｈａⅠ酶切位点...     

干扰素-γ与白消安合用诱导建立小鼠重型再生障碍性贫血模型的研究

目的 探讨干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)联合白消安诱导小鼠重型再生障碍性贫血(再障)模型的建立.方法 随机选取30只清洁级BALB/c雌性小鼠,采用腹腔注射IFN-γ联合胃饲白消安的方法制作重型再障模型,以单纯白消安组(单M组)(n=30)和对照组(n=30)为对照,比较3组小鼠间一般情况、患病率、死亡率、血常规、胫骨骨髓有核细胞计数(tibial nucleated cell count,TNCC)、脾脏指数、骨髓细胞形态学及骨髓活组织病理学检查的结果.结果 IFN-γ与白消安联合组(联合用药组):至给药结束后第10天,重型再障患病率达100％,死亡率为20％;联合用药组WBC、Hb、PLT、网织红细胞绝对值(Ret)、TNCC分别为(0.8 ±0.3)×109/L、(45±20)g/L、( 10±8)×109/L、( 15.2±10.2)×109/L、(12±7)×106/根胫骨,与单M组和对照组比较均有显著性差异(P＜0.05);至给药结束后第20天,WBC、Hb、PLT及TNCC与单M组和对照组比较仍有显著性差异(P＜0.05).骨髓细胞形态学及骨髓活组织病理学检查示联合用药组骨髓增生极度低下,脂肪化明显,造血细胞减少,脂肪细胞和淋巴细胞等非造血细胞增加,骨髓抑制严重且不可逆;单M组外周血常规、TNCC及骨髓有核细胞增生均可随时间延长逐渐恢复,易见骨髓红系代偿性增生旺盛及病态造血现象.结论 IFN-γ与白消安合用可在较短时间内诱导建立小鼠重型再障动物模型,方法简便,诱导成功率高,更接近于人类再障.     

再生障碍性贫血患者Tim-3、IFN-γ及IL-4 mRNA的表达及其临床意义

目的探讨Tim-3、IFN-γ和IL-4基因在再生障碍性贫血(AA)患者的表达水平及其临床意义。方法通过实时定量RT-PCR检测48例AA、13例其他血细胞数下降患者和30名正常对照骨髓及外周血单个核细胞中的Tim-3 mRNA、IFN-γmRNA、IL-4 mRNA的表达水平(达到阈值所需相对循环数)。结果①AA患者Tim-3 mRNA的表达水平(-6．05±1．90)明显高于正常对照(-1．26±1．75)(P<0．01)和其他血细胞数下降患者(-1．85±1．76)(P<0．01)。②AA患者IFN-γmRNA检测阳性率为30例(62．5％),正常对照组仅测到1例阳性(3．3％),其他血细胞数下降组阳性2例(15．0％)。③Tim-3 mRNA、IFN-γmRNA在重症AA中的表达水平分别为-7．12±1．73和-6．94±1．75明显高于慢性AA(分别为-5．38±1．74和-5．03±2．21)(P值均<0．05);AA未缓解组Tim-3 mRNA和IFN-γmRNA表达水平(分别为-6．38±1．75和-5．86±2．23)显著高于缓解组(分别为-2．02±1．86和-2．46±1．89)(P值均<0．01);Tim-3 mRNA在骨髓和外周血中的表达水平(-6．12±1．94和-6．13±1．94)差异无统计学意义(P>0．05),IFN-γmRNA在骨髓的表达(-7．09±1．59)明显高于外周血中的表达(-5．16±2．02)(P<0．05)。④AA患者IL-4 mRNA表达阳性4例,其他血细胞数下降组2例,正常对照组0例。结论Tim-3 mRNA在AA患者中的表达明显高于正常人群和其他血液病患者,并与疾病的严重程度相关。     

β-珠蛋白生成障碍性贫血患者β-珠蛋白基因单核苷酸多态性分析

本研究旨在分析深圳地区β-珠蛋白生成障碍性贫血患者的β-珠蛋白基因序列,了解β-珠蛋白基因内的单核苷酸多态性,探讨β-珠蛋白基因突变与基因内单核苷酸多态性的连锁关系。本研究收集125例深圳地区β-珠蛋白生成障碍性贫血患者的外周血,并抽提基因组DNA,通过聚合酶链反应扩增β-珠蛋白基因,经DNA测序确定β-珠蛋白基因的突变类型和基因内单核苷酸多态性。结果显示:在114例深圳地区β-珠蛋白生成障碍性贫血患者的β-珠蛋白基因中共发现了10种突变和12个位点的单核苷酸多态性。在12个单核苷酸多态性位点中,有6个位点的6个单倍型与β-珠蛋白基因突变存在连锁不平衡。结论:在β-珠蛋白基因内存在密集的单核苷酸多态性位点,平均约230bp长度存在1个单核苷酸多态性位点,其中一些位点单倍型与β-珠蛋白基因突变存在连锁不平衡,这或许对基因诊断有一定价值。     

免疫抑制治疗对再生障碍性贫血患者外周血淋巴细胞胞浆内TNF-ɑ/IFN-γ表达的影响

本研究探讨免疫抑制治疗对再生障碍性贫血(AA)患者外周血淋巴细胞胞浆内肿瘤坏死因子-浕(TNF-浕)/干扰素-γ(IFN-γ)表达的影响。利用流式细胞术检测25例再生障碍性贫血初发病人和20例经免疫抑制治疗后的再生障碍性贫血患者外周血中CD3+淋巴细胞胞浆内TNF-浕/IFN-γ的表达情况。结果显示:再生障碍性贫血初发组CD3+淋巴细胞胞浆内TNF-浕、IFN-γ的表达率分别为(5.97±6.78)%和(15.20±11.28)%,正常对照组为(1.56±0.87)%,(1.76±0.87)%,两者之间的差异有统计学意义(p<0.05);免疫抑制治疗组CD3+淋巴细胞胞浆内TNF-浕、IFN-γ的表达率分别(1.67±1.26)%,(4.35±4.33)%,与初发组之间的差异有统计学意义(p<0.05)。结论 :再生障碍性贫血患者淋巴细胞胞浆内TNF-浕/IFN-γ的表达高于正常对照组,免疫抑制治疗可以显著下调胞浆内TNF-浕/IFN-γ的表达。     

免疫抑制治疗对再生障碍性贫血患者外周血淋巴细胞胞浆内TNF-ɑ/IFN-γ表达的影响

本研究探讨免疫抑制治疗对再生障碍性贫血(AA)患者外周血淋巴细胞胞浆内肿瘤坏死因子-浕(TNF-浕)/干扰素-γ(IFN-γ)表达的影响。利用流式细胞术检测25例再生障碍性贫血初发病人和20例经免疫抑制治疗后的再生障碍性贫血患者外周血中CD3+淋巴细胞胞浆内TNF-浕/IFN-γ的表达情况。结果显示:再生障碍性贫血初发组CD3+淋巴细胞胞浆内TNF-浕、IFN-γ的表达率分别为(5.97±6.78)%和(15.20±11.28)%,正常对照组为(1.56±0.87)%,(1.76±0.87)%,两者之间的差异有统计学意义(p<0.05);免疫抑制治疗组CD3+淋巴细胞胞浆内TNF-浕、IFN-γ的表达率分别(1.67±1.26)%,(4.35±4.33)%,与初发组之间的差异有统计学意义(p<0.05)。结论 :再生障碍性贫血患者淋巴细胞胞浆内TNF-浕/IFN-γ的表达高于正常对照组,免疫抑制治疗可以显著下调胞浆内TNF-浕/IFN-γ的表达。     

轻型β-珠蛋白生成障碍性贫血患者β-珠蛋白基因单核苷酸多态性分析

目的对临床诊断为轻型β-珠蛋白生成障碍性贫血患者进行β-珠蛋白基因单核苷酸多态性分析.方法用PCR法对β-珠蛋白基因进行扩增,扩增产物经纯化后测序,确定其单核苷酸多态性.结果β-珠蛋白基因分析片段中共发现3个位点存在单核苷酸多态性,分别是外显子1第59位的T/C多态性、内含子2第-16位的G/C多态性及内含子2第-74位的T/G多态性.结论同国外报道的正常人群相比,轻型β-珠蛋白生成障碍性贫血患者的β-珠蛋白基因单核苷酸多态性位点显著减少,各位点的碱基频率也有不同.     

获得性重型再生障碍性贫血患者穿孔素基因突变检测

本研究旨在探讨穿孔素(perforin)基因PRF1突变是否为获得性重型再生障碍性贫血(SAA)发病的遗传易感性基础。用聚合酶链反应(PCR)方法扩增31例SAA患者及15名正常对照者外周血单个核细胞基因组DNAPRF1外显子2(exon2)及外显子3(exon3);用双脱氧终止法测序,与GenBank报道序列核对寻找突变位点;发现突变序列克隆入M13噬菌体载体中,对所得2条染色体相应序列分别测序,以确定不同突变在染色体上的分布。结果表明:在SAA患者,发现了2处基因突变即822位C>T纯合子突变(无义突变)及907位G>A杂合子突变(Met303Val);rs885822单核苷酸多态性(SNP)位点分布病例组与对照组比较有统计学差异(p<0.05)。结论:穿孔素基因突变可能是部分SAA患者的遗传易感因素。     

Tcf-1基因在再生障碍性贫血患者骨髓CD4＋T细胞中的表达

目的探讨Tef-1基因在再生障碍性贫血(再障)患者骨髓CD4~ T细胞中的表达情况。方法用Mini-MACS磁珠分选系统分离出骨髓CD4~ T细胞,用半定最RT-PCR方法检测Tef-1 mRNA在再障患者和正常人骨髓CD4~ T细胞中的表达。结果Tef-1 mRNA在再障患者骨髓CD4~ T细胞中的表达水平显著高于正常人(P＜0．01),且重型再障患者骨髓CD4~ T细胞中的表达水平明显高于非重型再障患者(P＜0．01)。结论与正常人相比,Tef-1基因在再障患者骨髓CD4~ T细胞中表达上调,且在重型再障患者骨髓CD4~ T细胞中表达水平更高,推测Tef-1基因表达水平的高低可能与骨髓CD4~ T细胞增殖活化的程度相关。     

马钱子碱对再生障碍性贫血患者T细胞分泌功能和增殖能力的影响

本研究观察不同浓度马钱子碱对再生障碍性贫血(aplastic anenia,AA)患者T淋巴细胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-4的水平及其增殖的影响,以探讨马钱子治疗AA的作用机制。AA患者及健康志愿者各10例,分离外周血T淋巴细胞并对其进行培养和纯化。将AA患者T细胞分为马钱子碱0、100、200和400μg/ml 4个干预组;健康志愿者T细胞为正常对照组,不作干预。培养72小时后,用ELISA法检测各组细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-4的水平,MTT比色法检测AA各组T细胞的增殖状况。结果表明,AA患者T细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ水平较正常对照组均明显升高,而IL-4水平较正常对照组明显降低;AA患者T细胞经马钱子碱作用后,TNF-α、IFN-γ水平均明显降低,且呈剂量依赖关系,而作用前后IL-4水平无明显变化。马钱子碱100、200和400μg/ml浓度对AA患者T细胞生长抑制率分别为(13.61±4.31)%、(14.28±4.31)%、(15.12±4.56)%,3个组间的比较无明显差异。结论:马钱子碱通过降低AA患者TNF-α、IFN-γ造血负调控因子的水平和抑制T细胞增殖而发挥治疗作用。本研究为马钱子治疗AA提供了实验依据。     

再生障碍性贫血外周血Th17和CD4~+ CD25~+ Treg细胞表达情况研究

本研究旨在探讨成人再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)外周血Th17和CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)表达情况。45例初发AA患者分为轻型AA(n=25)和重型AA(n=25)两组,15例正常人作为对照。应用流式细胞术检测AA患者外周血中Th17和CD4+CD25+Treg的比例,ELISA检测血清及刺激后外周血单个核细胞(PBMNC)上清液中的白介素(IL-17)、γ干扰素(IFN-γ)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,并与正常对照组比较。结果表明:重型AA(SAA)组外周血Th17细胞比例,血清中IL-17及IFN-γ表达高于轻型AA(MAA)和正常人组,而重型AA组外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例降低。与轻型AA和正常对照相比,重型AA患者单个核细胞培养后上清液中IL-17及IFN-γ表达水平显著增加。AA患者血红蛋白计数与Th17细胞及血清IL-17表达呈负相关,与CD4+CD25+Treg表达成正相关。结论:重型AA患者外周血Th17细胞应答增强,而CD4+CD25+Treg细胞缺乏,贫血的严重程度与外周血Th17/Treg免疫应答失衡密切相关。     

52例儿童特发性再生障碍性贫血的淋巴细胞免疫异常分析

本研究评价儿童特发性再生障碍性贫血（IAA）发病时淋巴细胞免疫异常的特点，以探讨儿童特发性再生障碍性贫血的免疫发病机制。应用流式细胞术检测患者发病时外周血中淋巴细胞表型、Th1／Th2和Tc1／Tc2水平，以及CD25^＋及CD4^＋CD25^＋T细胞的水平，并与正常儿童对照组的比较。结果表明：重型再生障碍性贫血（SAA）组40例，轻型再生障碍性贫血（MAA）组12例。SAA组和MAA组患者的CD3^＋CD8^＋水平较正常对照组显著增高（P〈0．05）；MAA组CD3^＋和CD3^＋CD4^＋T细胞水平均明显低于SAA组（P〈0．05）．与正常对照组比较无显著差异．SAA组和MAA组CD3^-CD19^＋水平与正常对照组比较无明显差异。SAA组和MAA组CD3^-CD56^＋水平明显低于正常对照组（P〈0．05）：与正常对照组比较SAA组和MAA组Th1和Tc1水平明显增高（P〈0．05），Th1／Th2和Tc1／Tc2比值也明显增高（P〈0．05）；SAA组伴Th2增高；SAA组Th1和Tc1水平、Th1／Th2和Tc1／Tc2比值明显高于MAA组（P〈0．05）．SAA组、MAA组CD25^＋T细胞表达较正常对照组均显著增高（P〈0．05）。SAA组、MAA组CD4^＋CD25^＋T细胞表达水平和CD4^＋CD25^＋／CD4^＋比值均无明显差异。结论：儿童特发性再生障碍性贫血发病时淋巴细胞免疫异常，Th1／Th2、Tc1／Tc2极化平衡向Th1、Tc1偏移，并且与疾病严重程度相关，以及CD25^＋T细胞表达增高，均提示淋巴细胞免疫异常在儿童特发性再生障碍性贫血患者的发病中起着重要的作用．     

SOCS基因单核苷酸多态性与典型骨髓增殖性肿瘤的研究

本研究探讨细胞因子信号转导抑制蛋白（suppressorofcytokinesignaling,SOCS）突变和单核苷酸多态性（SNP）对典型骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferativeneoplasms,MPN）的作用及其机制。采用实时定量PCR和直接测序法等方法,在100例MPN患者中分别检测SOCSl、SOCS2、SOCS3基因突变和SNP发生情况。结果表明,SOCS315号外显子第63位核苷酸的A-c多态性（SNP库无报道）21例;SOCS315号外显子第1779位核苷酸的A-c多态性18例;SOCS315号外显子第2249位核苷酸的A-G多态性（SNP库无报道）49例;SOCs315号外显子第2366位核苷酸的T-C多态性（SNP库无报道）39例;SOCS215号外显子第2016位核苷酸的T-C多态性（SNP库无报道）9例。4组SOCs3SNP患者平均年龄高于野生型患者,白细胞计数及血小板水平均高于野生型患者,87．65％SNP均存于JAK2突变。结论：SOCS可能是抗癌治疗的一个重要靶点．SOCSSNP可能参与MPN的发病机制。     

Alterations in Hematopoietic Microenvironment in Patients with Aplastic Anemia

Mechanisms of hematopoietic failure in patients with aplastic anemia (AA) are obscure. We investigate alterations in the hematopoietic microenvironment in AA patients. We present the results of studying mesenchymal stromal cells (MSC), fibroblastic colony‐forming units (CFU‐F), and adherent cell layers (ACL) of long‐term bone marrow cultures (LTBMC) from bone marrow (BM) samples of AA patients. MSC of AA patients proliferated longer than those of donors. In half of the patients’ MSC cultures, adipogenesis was impaired. Osteogenic differentiation was not achieved in 36% of AA MSC. CFU‐F formed enlarged colonies, and their concentration in the BM of AA patients was significantly increased. Our data suggest that the physiological activation of the stromal microenvironment is characteristic of AA. We detected a decrease in the expression of the angiopoetin‐1 (ANG‐1) and vascular cell adhesion molecule‐1 (VCAM‐1) genes, together with an increase in the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in ACL of AA patients. This ndicates abnormal regulatory patterns in both osteoblastic and vascular contexts. Addition of AA patients’ serum to donors’ LTBMCfor 3 weeks induced similar gene expression alterations. The addition of parathyroid hormone (PTH) resulted in the expression levels of analyzed genes returning to normal, in both AA LTBMC and donor cultures treated with AA serum. The physiologic status of the BM stromal microenvironment (MSC, CFU‐F, and ACL of LTBMC) of AA patients was altered.     

HLA基因与再生障碍性贫血相关性研究

本研究探讨HLA基因与再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）发病之间的相关性.采用序列特异性引物聚合酶链反应（PCR—SSP）分型技术．对82例再生障碍性贫血患者和400名正常对照者进行HLA基因分型，分析HLA基因分布频率在两组中的差异。结果表明：AA组与正常对照组相比，HLA—A＊2301（1．84％）、B$5501（4．36％）、DRBl＊0901（23．49％）基因频率明显增高，相对危险性（relative risk，RR分别为5．0253、3．3645和2．1269，X^2为4．6634、6．3120、9．1511）（P〈0．01）。AA组DRBl＊130l基因频率（1．23％）显著低于正常对照组，其RR为0．2257，X^2=6．66294（P〈0．01）．结论：HLA—A＊230l、B＊550l、DRBl＊090l基因可分别作为AA发病的危险标志，而DRBl＊130l可作为AA的保护标志。     

ALG／ATG治疗重型再生障碍性贫血后血清病皮疹的观察及护理

为明确抗淋巴细胞球蛋白(Antilymphocyte globulin,ALG)/抗胸腺细胞球蛋白(Antithymocyte globulin,ATG)治疗重型再生障碍性贫血(SAA)患者血清病皮疹的发生率及其护理,对54例SAA患者应用ALG/ATG治疗后血清病皮疹的发生情况进行观察。皮疹发生率为35.18％。皮疹类型:充血性皮疹13例,出血性皮疹4例,混合型皮疹2例。皮疹发生部位:可见四肢、躯干或全身性。皮疹发生时间最快为用药当日,最慢18天,平均9天,持续时间12小时至10天,平均5.25天。治疗前IgG<10g/L者皮疹发生率(56％)明显高于IgG≥10g/L者(20％)。护理效果:19例出现皮疹患者经过我们的护理全部痊愈。     

TERT及TIN2在获得性再生障碍性贫血患者中的表达及其与发病相关性研究

目的:检测获得性再生障碍性贫血(acquired aplastic anemia,AAA)患者外周血单个核细胞的端粒酶逆转录酶TERT和端粒保护蛋白TIN2基因表达水平,探讨它们与AAA发病的关系。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-q PCR)检测40例AAA中非重型再生障碍性贫血(NSAA)患者33例,重型再生障碍性贫血(SAA)患者7例和20例正常对照者外周血单个核细胞中TERT、TIN2 mRNA表达情况,并与外周血细胞分类之间进行了相关性比较。结果:AAA患者TERT、TIN2 mRNA表达水平均较正常对照组明显降低(P0.05);SAA患者TERT、TIN2mRNA表达水平较正常对照组明显降低(P0.01);SAA患者TERT、TIN2 mRNA表达水平较NSAA明显降低(P0.05);NSAA患者TIN2 mRNA表达水平较正常对照组明显降低(P0.01);NSAA患者TERT mRNA表达水平和正常对照组比较没有显著性差异(P=0.082)。TERT mRNA表达水平与红细胞(RBC)(r=0.437,P=0.029)及血红蛋白(Hb)(r=0.522,P=0.007)有显著相关性;TIN2 mRNA表达水平与淋巴细胞百分比(lymphocyte%)(r=-0.404,P=0.045)有显著相关性。结论:端粒酶逆转录酶TERT mRNA表达水平与RBC、Hb水平有关;端粒保护蛋白TIN2 mRNA表达水平与淋巴细胞比例有关。