逼尿肌细胞的原代培养和鉴定

目的建立逼尿肌细胞的原代培养及鉴定方法。方法应用Ⅱ型胶原酶消化分离逼尿肌细胞,在含20%胎牛血清DMEM培养液中培养,观察细胞形态和扩增情况,用a-SM-Actin进行免疫组化鉴定细胞类型。结果 逼尿肌细胞在培养18 h后开始贴壁在瓶底,4~5 d后可见细胞融合,8~10 d后可见细胞覆盖瓶底80%以上。a-SM-Actin免疫组化染色鉴定,光镜下观察梭形细胞胞浆内见纵行排列的棕黄色丝状物。结论该方法简单、易于掌握,短期内可获得大量高纯度的逼尿肌细胞。     

膀胱出口梗阻所致逼尿肌尿动力学及超微结构的变化

目的：观察膀胱出口梗阻（BOO）后逼尿肌尿动力学及超微结构的改变。方法：通过改良法，建立BOO后引起逼尿肌不稳定（DI）的动物模型，根据尿动力学检查结果分为DI组和正常对照组，在了解逼尿肌功能变化基础上，利用透射电镜观察逼尿肌细胞的超微结构变化。结果：DI组逼尿肌细胞间连接以缝隙连接（GJ）为主要方式，正常对照组细胞以中间连接（IJ）为主。结论：BOO后膀胱逼尿肌功能改变与细胞超微结构改变有关，且GJ通道在DI发生中有重要作用。     

小鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养和鉴定

目的 探讨小鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养方法及鉴定技术. 方法 取新生小鼠后肢肌,采用混合酶消化法获得细胞悬液,经Percoll分离,结合差速贴壁法提纯骨骼肌卫星细胞.倒置显微镜观察细胞形态及增殖状况,绘制细胞生长曲线,采用结蛋白、α-肌动蛋白免疫细胞化学方法鉴定骨骼肌卫星细胞. 结果 原代骨骼肌卫星细胞呈圆形,培养1d后逐渐贴壁生长,细胞分布均匀,多呈圆形,48h后开始增殖,此后细胞体积逐渐增大并开始分裂,镜下可见2～3个或多个细胞成串排列,3～4d后细胞进入对数生长期,此时圆形细胞占优势,可见多处局部细胞克隆呈簇样生长.培养7～10d细胞生长至单层且成片分布(50%～70%),梭形或纺锤形细胞增多,但仍有部分细胞呈圆形,12～14d后细胞增殖减缓.免疫细胞化学染色显示,分离得到的小鼠骨骼肌卫星细胞表达肌源性标志物结蛋白联合骨骼肌特异性蛋白α-肌动蛋白. 结论 采用混合酶消化、Pereoll分离结合差速贴壁法可培养出高纯度的骨骼肌卫星细胞,结蛋白和骨骼肌肌动蛋白免疫细胞化学染色可更有效地鉴定骨骼肌卫星细胞.     

大鼠FasL阳性Sertoli细胞的分离与鉴定

目的 分离鉴定Sertoli细胞，并检测其FasL的表达。方法 取雄性Wistar大鼠睾丸，分离Sertoli细胞。培养72h，用多种方法进行形态学观察，做透射电镜进行形态学鉴定，免疫组化检测FasL的表达情况。结果 所获得的Sertoli细胞占细胞总数的90％以上，细胞培养72h后FasL仍然高表达。结论 本研究分离的Sertoli细胞可以用于细胞联合移植，发挥免疫豁免作用。     

真皮间充质干细胞的分离培养及其NOV基因的表达

目的：分离培养大鼠真皮来源成体多能干细胞并研究其NOV基因表达。方法：分离培养新生大鼠真皮间充质干细胞，采用形态学观察及免疫组化法进行鉴定。用脂质体法将构建的NOV基因真核表达载体转染入大鼠真皮多能干细胞中，在荧光倒置显微镜下观察转染产物，RT—PCR法检测转染细胞中NOV基因表达。结果：新生大鼠真皮间充质干细胞86％处于G0／G1期，多向诱导后可分化为神经细胞及中胚层来源细胞。NOV重组质粒体外转染大鼠真皮多能干细胞后，转染细胞中检测到NOV基因。结论：大鼠真皮组织中存在着成体多能干细胞，具有多胚系分化潜能。该细胞可作为NOV基因表达的细胞载体。     

体外培养大鼠触须毛囊真皮鞘细胞的生物学特性及其超微结构

目的：探讨大鼠触须毛囊真皮鞘细胞体外培养生长特性和电镜下超微结构特征。方法：显微分离大鼠触须毛囊真皮鞘，组织块法原代培养获得真皮鞘细胞，免疫组化和免疫荧光染色进行细胞鉴定，MTT法测定细胞生长曲线，并通过扫描电镜和透射电镜观察其超微结构。结果：真皮鞘细胞原代培养5—7d仅有少量细胞由组织块中长出，培养14d方可传代。传代后细胞呈克隆样丛状生长，细胞丛相互连接呈网状，3～5d传一代，可连续传10代以上。扫描电镜见毛囊真皮鞘内有许多散在的纺锤形细胞，胞体丰满，表面不光滑，有较长的细胞突起。透射电镜下见细胞核大，富含常染色质，核仁明显，胞浆中细胞器少，胞膜下可见由细丝样结构组成的致密斑。结论：大鼠触须毛囊真皮鞘细胞原代生长迟缓，传代后细胞增殖旺盛，其超微结构特点提示该细胞分化程度较低，属于成体中较为幼稚的间充质细胞。     

新分离呼肠病毒的空斑试验及病毒纯化

目的：建立新分离呼肠病毒（reovirus）的空斑技术，进行病毒纯化，为呼肠病毒生物学和分子生物学的研究奠定基础。方法：4株新分离呼肠病毒的早代毒种经L929细胞连续传代，当产生细胞病变后进行空斑试验，加营养琼脂培养6d后加中性红，24h内挑取空斑，扩增一次后做PCR鉴定。取呼肠病毒PCR阳性病毒进行第2次克隆纯化。结果：4株新分离呼肠病毒经L929细胞连续传2～4代，均能观察到明显的细胞病变。用10^-3和10^-4接种L929单层细胞，第6～7天均能产生空斑，空斑呈圆形，直径为0．2～1．0mm，并分别测定其空斑滴度（PFU／ml）。两次纯化后进行PCR检测，呼肠病毒基因扩增阳性、脊髓灰质炎病毒基因扩增阴性。结论：4株呼肠病毒的空斑出斑规律，通过两次克隆，获得纯化的病毒。     

体外培养豚鼠膀胱Cajal间质细胞的分离与鉴定

目的：探讨豚鼠膀胱Cajal间质细胞的原代分离、培养及鉴定方法。方法：断颈处死豚鼠,无菌条件下分离出膀胱组织,采用酶消化法分离细胞,将细胞悬液接种于含干细胞因子（SCF）的细胞培养基中培养。用酪氨酸蛋白激酶受体（c-kit）特异性抗体标记细胞,证实细胞类型。结果：培养后的Cajal间质细胞保持其固有特征,可见胞体为梭形且胞体有两个细长突起,该类细胞c-kit抗体荧光染色阳性。结论：用酶消化法可获得豚鼠膀胱Cajal间质细胞,并在体外生长良好。     

兔原代胸主动脉平滑肌细胞培养方法及不同浓度血清培养基对其增殖的研究

目的探讨体外分离培养兔原代胸主动脉平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）技术及在不同浓度血清培养基下生长情况。方法采用组织贴块法进行原代培养,分别用不同浓度血清培养基（10％、15％、20％）对原代VSMCs进行培养．胰酶消化法传代,用倒置显微镜对原代培养兔平滑肌细胞进行形态学观察并鉴定,MTT法测定增殖能力。结果体积分数20％血清的DMEM培养液培养的原代细胞生长出现明显对数期。培养5代的兔平滑肌细胞纯度达97％以上：镜下可见平滑肌细胞生长,免疫组化提示平滑肌细胞肌动蛋白阳性表达,细胞生长第4～5d内光密度值变化较明显。结论本法能有效提高兔动脉平滑肌细胞原代培养的成功率,为研究血管平滑肌细胞生物学行为提供了有效模型。     

人、鼠胰星状细胞3种细胞标志物desmin、GFAP、α-SMA的表达

目的 研究人和大鼠胰星状细胞(PSCs)在培养过程中细胞标志物表达的动态变化。方法 人和大鼠胰腺组织经胶原酶、链霉蛋白酶E和DNase Ⅰ联合消化后，采用Nycodenz不连续密度梯度离心方法分离PSCs，获得的细胞采用离心淘洗技术进行纯化。用激光共聚焦扫描显微镜观察新鲜分离细胞的维生素A(VitA)自发荧光现象，用免疫组化法检测细胞标志物——结蛋白(desmin)、神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和α-平滑肌动蛋白(α-SMA)的表达。细胞接种培养后，观察细胞形态和生长特性，采用Western和Northem分析分别检测细胞标志物和Ⅰ型前胶原α1链基因表达的动态变化。结果 采用离心淘洗技术获得的人和大鼠PSCs纯度分别可达85％以上和95％以上。新分离的人和大鼠PSCs胞浆内有VitA自发性蓝绿色荧光。新分离大鼠PSCs表达desmin和GFAP，不表达α-SMA，而人PSCs均不表达desmin、GFAP或α-SMA。在体外培养过程中，大鼠PSCs表达desmin和GFAP逐渐减弱，但人和大鼠PSCs均开始大量表达α-SMA蛋白和Ⅰ型前胶原基因。结论 利用离心淘洗技术可获得高纯度的人和大鼠PSCs。人和大鼠PSCs细胞标志物表达存在种属差异，但它们活化后均高表达α-SMA蛋白和Ⅰ型前胶原基因。     

洛伐他汀对HL-60细胞Fas抗原表达的影响

目的：观察洛伐他汀（LOV）对HL-60细胞Fas抗原表达的影响，探讨其抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的可能分子机制。方法：采用流式细胞仪检测HL-60细胞的细胞周期相分布，细胞凋亡率，Fas抗原表达水平。结果：4、8、16μmol／L LOV处理HL-60细胞48h后，G0／G1期细胞增多、细胞凋亡百分率增加、增殖指数降低、Fas抗原的平均荧光强度增加，与剂量呈正相关。结论：LOV对HL-60细胞有增殖抑制和诱导凋亡作用，上调节Fas抗原表达可能是其分子机制之一。     

聚乙醇酸负载同种异体软骨细胞移植修复兔关节软骨缺损

目的：应用聚乙醇酸（ＰＧＡ）负载的兔软骨细胞培养移植修复同种异体关节软骨缺损．方法：应用在生物体内可降解吸收、纤维状多孔态的ＰＧＡ作为支架行兔软骨细胞培养．培养１４天后，软骨细胞在ＰＧＡ提供的三维空间中大量分裂、增殖并合成大量软骨基质，形成ＰＧＡ－软骨细胞复合体，然后利用该复合体移植修复同种异体兔膝关节全层软骨缺损，对侧膝关节作对照．术后行大体、组织学、电镜动态观察及修复组织厚度测定．结果：ＰＧＡ在术后８周完全降解吸收，实验侧与对照侧修复组织的厚度有显著性差异（Ｐ＜０．０１）；术后１６周在实验侧可见典型的软骨组织，电镜下为成熟的软骨细胞，而对照侧为纤维组织修复．结论：应用ＰＧＡ－软骨细胞复合体移植，可修复同种异体的兔关节软骨缺损，为临床治疗关节软骨缺损奠定了基础．     

白杨黄素影响两种胃癌细胞系增殖与凋亡的研究

 目的 研究白杨黄素对两种胃癌细胞系SGC-7901和MKN-45是否具有抑制作用的分子生物学机制.方法 通过MTT法检测白杨黄素对SGC-7901和MKN-45细胞的增殖抑制作用,流式细胞术测定经白杨黄素处理后两种细胞的细胞周期,Westen-blot测定凋亡相关因子Caspase-3、Survivin和Bcl-2的表达水平.结果 白杨黄素对SGC-7901和MKN-45细胞具有增殖抑制作用,呈时间浓度依赖性;能够将细胞周期阻滞于Sub G1期;能上调Caspase-3,下调Survivin和Bcl-2的基因表达.结论 白杨黄素能够诱导SGC-7901和MKN-45细胞的凋亡并有效地抑制其增殖.其机制可能与干扰细胞周期及激活Caspase-3,抑制Survivin和Bcl-2有关.     

洛伐他汀对HL-60细胞增殖功能及细胞形态的影响

目的 :探讨胆固醇合成抑制剂洛伐他汀 (Lovastatin ,LOV)对HL - 6 0细胞增殖功能的影响并观察细胞的形态学变化。方法 :以LOV处理HL - 6 0细胞 ,采用MTT、生长曲线、光学显微镜观察等实验方法 ,观察LOV对HL - 6 0细胞增殖的抑制作用及对细胞形态的影响。结果 :4、8、16 μmol·L-1LOV处理HL - 6 0细胞 1～ 4d后 ,可抑制HL - 6 0细胞增殖 ,同时 ,细胞形态发生不同程度的改变。结论 :LOV能显著抑制HL - 6 0细胞增殖并使细胞形态发生明显改变 ,该作用呈剂量 -效应和时间依赖关系     

丹参素和克伦特罗对兔骨髓间充质干细胞成纤维细胞集落的影响

目的以丹参素和克伦特罗为干预药物,观察对兔骨髓间充质干细胞增殖的影响。方法用梯度密度法分离和培养兔骨髓间充质干细胞,18只兔子随机被分到空白组、丹参素和克伦特罗组。观察形成的骨髓间充质干细胞成纤维样集落数目。并利用骨髓间充质干细胞诱导成骨法和骨髓间充质干细胞表面标志流式分析法鉴定。结果和其它浓度相比,浓度为10ug/ml的丹参素和浓度为1.0ug/ml的克伦特罗有较大生成成纤维样集落数目能力。结论丹参素和克伦特罗对兔骨髓间充质干细胞有增殖作用。     

体外培养人胎肝细胞与永生化L-02肝细胞的生物学性状比较

目的 对比体外培养的人胎肝细胞与L-02肝细胞形态学及增殖分化特征的异同，初步评价其用于移植的可行性，探讨介入性肝细胞移植术的理想供体来源。方法 分离培养14～24周的引产胎儿肝细胞，放射免疫法测定上清液中甲胎蛋白(AFP)与白蛋白(ALB)含量，免疫细胞化学法检测细胞角蛋白19(CK—19)的表达。同法检测传代培养L-02肝细胞的蛋白表达。结果人胎肝细胞分离活率达95％，在体外存活最长达3周，可同时检测到AFP、ALB及CK—19表达，其中ALB分泌峰值42．06μg／ml；L-02肝细胞增殖迅速，AFP与CK-19表达阴性，ALB表达在10μg／ml水平，部分细胞多次传代后发生形态变异，ALB表达缺失。结论人胎肝细胞具有潜在的双向分化能力，是肝细胞移植较为合适的供体来源；L-02肝细胞不适用于移植。     

Lovastatin对人粒系白血病细胞增殖和细胞周期的影响

目的:观察洛伐他汀(lovastatin,LOV)对体外培养的人粒系白血病细胞株HL-60增殖和细胞周期的影响.方法:采用生长曲线测定、MTT检测、流式细胞仪分析等实验技术.结果:LOV对HL-60细胞有增殖抑制作用,能使细胞周期阻滞于G0/G1期,该作用呈剂量-效应和时间依赖关系.结论:LOV能抑制HL-60细胞的增殖,同时影响该细胞的细胞周期进程.     

miR-302a在胃癌中表达及其对胃癌细胞凋亡与细胞周期影响

目的研究微小RNA-302a(miRNA-302a)在胃癌标本中的表达水平与临床病理特征的关系,以及其对胃癌细胞的凋亡和细胞周期调控作用,以探讨将miR-302a用于胃癌生物靶向治疗的可能性。方法采用实时PCR(RT-PCR)方法检测胃癌组织和正常胃黏膜组织中miR-302a的相对表达水平,并分析其与对应患者的临床病理资料的相关性。同时,采用RTPCR方法检测miR-302a在胃癌细胞株SGC-7901、MGC-803和BGC-823及正常胃黏膜细胞GES-1中的表达情况;选取miR-302a表达水平最低者为癌细胞,并转染过表达miR-302a的真核重组质粒p CDNA3.1-miR-302a;转染后,采用流式细胞仪Annexin V/PI双染法和PI单染法检测miR-302a对细胞凋亡和细胞周期的影响。结果胃癌组织中miR-302a的相对表达水平显著低于癌旁正常胃癌黏膜组织(P<0.05),且其表达与临床分期、病理分级和转移均有密切关系(P<0.05)。同时,在胃癌细胞SGC-7901、MGC-803和BGC-823中miR-302a的相对表达水平显著低于正常细胞GES-1中的表达(P<0.05),且在BGC-823中表达水平最低。p CDNA3.1-miR-302a质粒转染组与空白组和p CDNA3.1质粒转染组比较,miR-302a质粒转染后48 h后细胞凋亡水平显著升高,且G2/M期细胞数显著增高(P<0.05)。结论在胃癌组织和细胞中miR-302a均呈现低水平表达,当miR-302a过表达后,能显著增高胃癌细胞的凋亡水平并使细胞出现G2/M期阻滞,可能成为胃癌治疗的新靶点。     

次声作用对大鼠视网膜Mueller细胞及血管内皮细胞增殖力的影响

目的 探讨次声作用对大鼠视网膜Mueller细胞及血管内皮细胞增殖力的影响。方法 采用原代培养的大鼠视网膜Mueller细胞和猴视网膜血管内皮细胞（细胞系），8Hz，130dB次声连续辐照2h，采用四唑蓝比色法实验方法分别于次声作用后4h,1d,2d,3d,4d和5d6个时间点珧吸收度值，绘制增殖曲线，进行统计分析。结果 8Hz,180dB次生作用2h对原代培养的大鼠视网膜Mueller细胞增殖能力有影响，在次声作用后4h,1d,2d和3d4个时间点，其光吸收度值与对照组相比差异显著。而猴视网膜血管内皮细胞则对次声不太敏感，仅在次声作用后2d与对照组的差别有显著性意义。结论 8Hz,130dB次声对原代培养的大鼠视网膜Mueller细胞有一定的损伤作用。     

抑制CHD6表达对A549细胞辐射敏感性的影响

目的通过RNA干扰技术建立染色质重构蛋白CHD6基因表达抑制的细胞模型,研究CHD6对人肺腺癌细胞A549细胞增殖及辐射敏感性的影响.方法利用质粒介导的siRNA技术建立CHD6基因表达抑制细胞模型,RT-PCR检测CHD6 mRNA的表达,细胞生长曲线和流式细胞技术分别检测A549细胞增殖及细胞周期的变化,荧光染色法检测细胞凋亡,细胞克隆形成率检测A549细胞辐射敏感性.结果通过本研究,成功构建了siRNA抑制CHD6表达的细胞模型;通过siRNA抑制CHD6的表达,A549细胞增殖能力明显增强,细胞对2 Gy以内γ射线照射有明显辐射抗性;大剂量照射后的细胞凋亡率无明显改变.结论抑制CHD6基因表达将提高细胞增殖能力和细胞的辐射抗性.