人整合素分子α4亚基片段的克隆和表达

目的克隆并表达人整合素分子α4亚基1.2kbcDNA片段。方法从HL-60细胞系中提取总RNA,以RT-PCR法扩增人整合素分子α4亚基片段1.2kbcDNA(1753～2934bp),并将该片段亚克隆至表达载体pGEX-3X,用IPTG诱导表达。结果克隆了α4亚基1.2kbcDNA片段。序列分析表明,其所编码的氨基酸序列与文献相比较只有一处错义突变(Arg→Gln),经分析该突变对抗原性影响不大。将该片段亚克隆至表达载体pGEX-3X,经IPTG诱导在大肠杆菌中获得高效表达。结论获得了α4亚基1.2kbcDNA片段及其原核表达产物,对研究α4整合素的功能具有重要的意义。     

人整合素分子α4亚基片段的克隆及大肠杆菌的表达

目的 克隆并原核表达α４亚基笥段。方法 从ＩＬ－６细胞系中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ方法分两段扩增人整素分子α４亚基片段２．０ｋｂ ｃＤＮＡ,将两片段连接,并将其中的１．７ｋｂ基因片段亚克隆至表达载体ＰＧＥＸ－ＫＧ中,ＩＰＴＧ诱导表达。结果 ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆了α４的两段ＣＤＮＡ,序列分析表明：与文献报道的μ４ＣＤＮＡ序列基本一致。两片段成功连接后将其中的１．７ｋｂ亚克隆至表达载体ＰＧＥＸ－     

人睫状神经营养因子在基因在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人睫状神经营养因子（ｈＣＮＴＦ）基因，并大大肠杆菌宿主系统中高效表达出具有生物活性的ｈＣＮＴＦ蛋白。方法 从人外周神经组织总ＲＮＡ经逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增得到编码人ＣＮＴＦ的全长ｃＤＮＡＡ片段，此片段经回收和纯化后克隆进ＰＧＥＭ－５Ｚｆ（＋）质粒载体，并进行了ＤＮＡ序列分析，然后进一步亚克隆进Ｔ７启动子表达载体，用ＩＰＴＧ在大肠杆菌主中诱导ｈＣＮＴＦ蛋白表达，并以体外培     

中国版纳猪MHCI类P1分子全长的原核表达与纯化

目的：获得原核表达的中国版纳猪ＳＬＡＩ类Ｐ１蛋白质分子。方法：ＰＣＲ扩增去信号肽的ＳＬＡＩ类Ｐ１ｃＤＮＡ序列，亚克隆至ｐＧＥＭＴ载体，测序。将亚克隆的Ｐ１　ｃＤＮＡ片段插入表达载体ｐＥＴ４２ｂ（＋），构建重组表达质粒ｐＥＴ－４２ｂ（＋）／ｓｌａ－ｐｌ，转化Ｅ·ｃｏｌｉ表达菌 ＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）－ＲＩＬ，ＩＰＴＧ诱导 Ｐ１－８ ｘ ｈｉｓ融合蛋白表达，经包涵体洗涤，８ ｍｏｌ／Ｌ尿素变性溶解，Ｎｉ２＋亲和层析，梯度透析后，定量保存。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定目的蛋白的表达与纯化。结果：目的蛋白（分子量３９．５ ｋＤ）表达量占细菌总蛋白 １５％，每升表达菌获得纯度９５％的目的蛋白 ４０ ｍｇ～６０ｍｇ。结论：成功建立猪 ＳＬＡ分子全长原核表达、纯化体系，为建立间接识别猪移植抗原ＳＬＡＩ类分子的人Ｔ细胞系及表位分析打下基础。     

人睫状神经营养因子基因在大肠杆菌中的表达

目的克隆人睫状神经营养因子（ｈＣＮＴＦ）基因，并在大肠杆菌宿主系统中高效表达出具有生物活性的ｈＣＮＴＦ蛋白。方法从人外周神经组织总ＲＮＡ经逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增得到编码人ＣＮＴＦ的全长ｃＤＮＡ片段，此片段经回收和纯化后克隆进ＰＧＥＭ－５Ｚｆ（＋）质粒载体，并进行了ＤＮＡ序列分析，然后进一步亚克隆进Ｔ７启动子表达载体，用ＩＰＴＧ在大肠杆菌宿主中诱导ｈＣＮＴＦ蛋白表达，并以体外培养的鸡胚背根神经节（ＤＲＧ）神经元测定了重组ｈＣＮＴＦ蛋白的神经营养活性。结果成功克隆了人ＣＮＴＦ基因，含重组ＣＮＴＦ质粒的大肠杆菌经０．４ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导３小时后，靶蛋白占细菌总蛋白的２５％以上。结论ｈＣＮＴＦ基因的克隆和高效表达为进一步研究其结构功能关系和临床应用打下了基础     

庚型肝炎病毒NS3蛋白大肠杆菌中的表达

目的 获取具备免疫反应原性的庚型肝炎病毒ＮＳ３抗原。方法 从重组质粒Ｉｗｑ２利用反应扩增出ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ ＮＳ３基因片段,克隆至表达载体ｐＰＲＯＥＸ ＨＴａ后进行核苷酸序列测定,待鉴定正确后经ＩＰＴＧ诱导重组工程菌,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ对重组蛋白进行鉴定。结果 酶切鉴定和核苷酸序列测定结果表明成功地构建了重组工程菌ｐＨＴＮＳ３／ＤＨ５α且克隆的基因片段为ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧ     

抗—HEV单克隆抗体B4C重链可变区基因的克隆及初步表达

抗－ＨＥＶ８７Ａ株单克隆抗体（ｍＡｂ）Ｂ４Ｃ的经体外研究鉴定，证实对我国暴发和散发性ＨＥＶ毒株有很高的特异性。为从分子水平上了解ｍＡｂＢ４Ｃ，我们利用基因工程技术，从杂交瘤细胞系中克隆出了重链可变区基因，并对其全部核苷酸序列进行了分析，可能属于小鼠免疫球蛋白重链Ｉ亚组，将ＶｎｃＤＮＡ克隆到高效表达载体ｐＱＥ－３１中，经ＩＰＴＧ诱导，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可见１条Ｍｒ的１６０００左右的表达带，表达产     

EphB2配体结合域基因片段的高效表达

目的;对酷氨酸蛋白激酶受体ＥｐｈＢ２胞外的配体结合区基因进行表达研究。方法：编码ＥｐｈＢ２胞外的配体结合区基因片段克隆于ｐＢｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（－）质粒中,经全自动序列分析仪测正确后,再克隆重组人表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１,构高效表达克隆ｐＨＴ。转化大肠杆菌ＤＨ５α表达。结果：经ＩＰＴＧ诱导５ｈ,蛋白表达即达高峰,ＳＤＳ ＰＡＧＥ及凝胶密度扫描分析,表达出约４１ＫＤ大小的蛋白,占菌体总蛋白的３５％     

人细胞色素P4502B6的GST融合蛋白及其抗体的制备

目的：获得纯化抗原用于制备ＣＹＰ２Ｂ６多克隆抗体方法：ＰＣＲ扩增目的基因片段,亚克隆入融合蛋白表达载体ＰＧＥＸ－３ｂ,构建了重组质粒ＰＧＥＸ／２Ｂ６。然后将该重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ分离,获纯化融合蛋白ＧＳＴ－２Ｂ６。用ＧＳＴ－３Ｂ２免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,自腹水中获取ＣＹＰ２Ｂ６多克隆抗体。结果：融合蛋白ＧＳＴ－２Ｂ６（ＣＹＰ２Ｂ６２０２￣３５２ａａ）,并获     

人整合素分子β7亚基片段的表达鉴定及多抗制备

目的 在大肠杆菌中高效表达人整合素分子β７片段并制备多抗。方法 ＤＮＡ重组法构建表达质粒,经ＩＰＴＧ诱导在大肠杆菌中获高效表达。表达产物经免疫印迹鉴定后,用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解包涵体,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纯化,免疫家兔获得多抗。结果 β７片段在大肠杆菌中训效表达。表达产物以包涵体形式存在。免疫印迹鉴定为目的蛋白。多抗效价达１：１０２４００。结论 制备了抗β７的多抗,对β７整合素的功能研究有重要意义。     

中国株HGV NS3区基因的原核表达及其产物的抗原性分析

目的 研究ＨＧＶ ＮＳ３区基因产物的抗原性,并探讨ＮＳ３蛋白在血清学检测中的应用。方法 将中国株ＨＧＶ ＮＥ３区的３个基因片段分别克隆到ｐＲＳＥＴ Ｂ和ｐＲＳＥＴ Ｃ质粒载体中,构建成原核表达载体。ＩＰＴＧ诱导下,在大肠杆菌ＢＬ２１中高效表达,获得３个重组蛋白,用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ法分别对表达产物进行分析。结果 所构建的表达载体均得到高效表达,得到的重组蛋白ＰＡ,Ｐ３和Ｐ４的分子     

大鼠神经肽Y前体融合蛋白在大肠杆菌中的超表达

应用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从大鼠腋组织钓得神经肽Ｙ（ＮＰＹ）ｃＤＮＡ编码区序列。经ＤＮＡ序列测定证实其准确性后，将该ｃＤＮＡ定向亚克隆入一大肠杆菌的表达载体ｐＭＡＬ－Ｃ＿２的果糖结合蛋白（ＭＢＰ）基因中。ＤＮＡ测序表明ＮＰＹｃＤＮＡ与表达载体中ＭＢＰ开放阅读框架一致。将重组质粒转入大肠杆茵ＤＨ５α菌系中，该重组大肠杆菌在液体ＬＢ培养基中经１ｍｍｏｌ／Ｌ终浓度的ＩＰＴＧ诱导４ｈ，所表达的ＮＰＹ－ＭＢＰ融合蛋白产量高达大肠杆菌总蛋白量的６０％～７０％。超表达的ＮＰＹ经纯化后将为进一步进行结构与功能研究提供材料来源。     

庚型肝炎病毒NS5区部分基因的表达及其在EIA中的 …

目的 在大肠杆蓖中表达ＨＧＶ ＮＳ５抗原,以建立ＨＧＶ抗体血清学检测方法。方法 利用扫转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法从人血浆中分离庚型肝炎病毒ＮＳ５部分基因,克隆到ｐＲＳＥＴ Ａ载体,经酶切初步鉴定后进行ＤＮＡ序列分析,结果表明克隆序列正确。以ｐＰＲＯＥＸ－１为表达载体,转化ＤＫ５α,诱导表达后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果 克隆的基因片段在大肠杆菌中表达出相对分子质量（Ｍ     

抗人CD3单链抗体的表达及其分离纯化

本研究将构建的抗人ＣＤ３单链抗体基因，克隆到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中，用ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合蛋白，并以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，在Ｍｒ为５２０００左右出现一条新生蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的４０％。经初步纯化和复性后，用ＧＳＴ亲和色谱纯化，再经凝血酶水解获得抗人ＣＤ３ＳｃＦｖ，竞争结合抑制实验证明，该表达产物具有ＣＤ３亲和活性     

人白细胞介素—15cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从正常人外周血中分离粘附的单核细胞，加入ＬＰＳ刺激４ｈ后提取细胞ｍＲＮＡ反转录获得ｃＤＮＡ第一链，用两对特异引物进行巢式ＰＣＲ扩增出含ＢａｍＨＩ酶切位点的编码人１Ｌ－１５成熟蛋白的ｃＤＮＡ，其大小约３６０ｂｐ。用ＰＥＧ法回收其片段并将其连接到ｐＢＳＳＫ载体的ＳｍａⅠ位点上进行序列分析，结果表明其序列与文献报道一致。然后再将其片段亚克隆插入到ｐＧＥＸ－２Ｔ的ＢａｍＨＩ位点。筛选插入方向正确的克隆，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，以１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导５ｈ收集菌体直接进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，与阴性对照相比，ＭＷ４４ＫＤ处多出一条带，紫外扫描显示此带占菌体蛋白总量的８．８％。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ证实此带能够特异地与兔抗人ＩＬ－１５的抗体发生反应。证明ＲＴ－ＰＣＲ所得的人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在大肠杆菌中获得了表达，为进一步探讨人ＩＬ－１５的生物学作用打下基础。     

CD59融合蛋白表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

探索ＧＰＩ－锚固蛋白的体外表达，获得具有生物学活性的可溶性游离ＣＤ５９分子。方法通过ＰＣＲ选择性扩增编码成熟ＣＤ５９氨基酸序列的基因片段，并将之克隆入ＰｉｎＰｏｉｎｔＸａ－３质粒中。ＩＰＴＧ诱导融合蛋白表达，产物经亲和素树脂亲和层析。在丛外微量反应性溶血抑制实验中检测重组ＣＤ５９纯化样品的生物学活性。     

人补体膜辅助调节蛋白MCP的基因克隆及共真核表达的研究

目的 克隆获得编码人补体膜辅助调节蛋白（ＭＣＰ）的ｃＤＮＡ，并对其在真核细胞的表达及功能进行研究。方法 应用ＲＴ－ＰＣＲ 方法，从Ｕ９３７细胞总ＲＮＡ中扩增编码人ＭＣＰ分子的ｃＤＮＡ片段，快速克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体，测定共序列。将该片段重组于ｐＬＸＳＮ载体，电穿孔转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，经ＦＡＣＳ检测筛选表达ＭＣＰ的阳性细胞克隆，用补体容破试验鉴定其抑制人补体溶破的功能。结果 ＲＴ－ＰＣＲ     

人乙酰胆碱受体α-亚基在大肠杆菌中的表达

目的 通过将乙酰胆碱受体（ＡｃｈＲ）α－亚基与分子伴侣蛋白（Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ）共表达，减少包涵体含量，提高可溶性目的蛋白含量。方法 将乙酰胆碱受体α－亚基结构域基因的重组质粒ｐＰＲ５０６与含分子伴侣蛋白ＧｒｏＥＳＬ基因的重组质粒ｐＧＥ６０一起转入Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨα，并在ＩＰＴＧ诱导下共表达。结果 由于分子伴侣蛋白具有协助重组蛋白再折叠的功能，其共表达产物与仅含ｐＰＲ５０６的工程菌单一表达产物     

人黄体松弛素原基因的克隆及在大肠杆菌中的初步…

为了加速我国基因工程高技术药物的研制，开发新型，具有生物活性功能的人重组松弛素原，利用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术从人黄体组织克隆了松弛素原的编码基因，包括Ｂ和Ａ链以及连接肽（Ｃ肽）。克隆的松弛素原基因进行序列测定后，再亚克隆的原核表达载体ＬＫＢ２，转化大肠杆菌ＢＬ２１，用ＩＰＴＧ诱导表达，结果表明，克隆的松弛素原基因与已发表的基因序列相同，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示表达蛋白的分子量为２０ｋ     

大肠杆菌菌株(λ衍生噬菌体)/PBR322衍生质粒作为人IL-6表达系统的研究

为探索人白细胞介素－６（ＩＬ－６）在原核细胞中高效表达的途径，选用ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＰＥＴ－２８作为表达系统，以聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增了ｈＩＬ－６的互补ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）的编码区，引入了ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ位点。用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切后，克隆于ＰＥＴ－２８载体的相应位点，转化ＤＨ５α。选出阳性克隆，经ＤＮＡ序列分析，表明其编码区内无非特异突变。将重组质粒转入ＤＨ５α，筛选阳性克隆，用异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）进行诱导表达。全细菌裂解液进行十二烷基黄酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ），结合固化蛋白质的免疫学测定（Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）杂交进行分析。结果表明：Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ杂交发现有与抗ＩＬ－６特异结合的蛋白带，以４ｈ的产量最多，激光扫描显示ＩＬ－６的吸收峰占总吸收面积的３７％（４ｈ诱导）。分子量约为２７ｋＤ。实验显示，人ＩＬ－６在原核细胞中实现了高效表达，表达产物具有ＩＬ－６的免疫活性