日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞的分离

目的 探索稳定、高效的血吸虫感染小鼠肝星状细胞的分离方法. 方法 采用Ⅳ型胶原酶体外灌注、11.5％ Optiprep密度梯度离心、CD11b磁珠阴性分选方法相结合分离血吸虫感染小鼠肝星状细胞. 结果 11.5％Optiprep密度梯度离心后细胞得率可达到(7.66±2.43)×106个/鼠,存活率为96％～98％.CD11b磁珠阴性分选后肝星状细胞得率可达到(3.9±1.33)×106个/鼠,CD11b、F4/80双阴性细胞纯度为90.8％～95.8％. 结论 本实验建立的血吸虫感染小鼠肝星状细胞分离方法稳定、高效,能够有效去除kupffer细胞的污染,为进一步研究HSC在血吸虫病肝纤维化中的功能提供基础.     

基于免疫磁珠法的不同筛选方案对胎儿有核红细胞富集效果的比较

目的：将密度梯度离心(density gradient centrifugation,DGC)与免疫磁珠法(magnetic-activated cell sorting,MACS)相结合,应用4种不同的筛选方案,对脐血中的胎儿有核红细胞(fetal nucleated red blood cells,FNRBC)进行分离,评估不同策略富集FNRBC的效果。方法：对10例脐血标本(12 mL/例)按4种不同方案进行筛选：DGC;DGC⁺MACS阴性筛选(CD45^-);DGC⁺MACS阳性筛选(CD71⁺);DGC⁺MACS阴性/阳性筛选(CD45-/CD71⁺)。通过细胞计数板计数,K-B染色后显微镜下人工FNRBC计数,从获得总细胞量、FNRBC量和FNRBC比例经t检验后评估不同方案富集FNRBC的效果。结果：(1)与其他3组相比,DGC方案可获得的总细胞量(0.95×10⁷/mL)最多,FNRBC数量(39.87/mL)最多,F...     

孕妇外周血中胎儿有核红细胞的富集

目的 :从孕妇外周血中分选富集出胎儿有核红细胞 ,以便用于无创伤性产前诊断。方法从 32例孕 11～ 2 0周的孕妇血中用Histopaque 10 77密度梯度离心富集以及流式细胞仪计数出胎儿有核红细胞 ,并用喹吖因荧光染色检测Y 染色体以及用PCR检测Y -染色体DNA特异序列。结果流式细胞仪计数 ,每毫升孕妇外周血中计数到 0 .93× 10 3 ～ 8.11× 10 3 个GPA阳性细胞 ;PCR结果与产后性别证实 ,符合率为 90 .0 6 %。结论孕妇外周血中的胎儿有核红细胞经密度梯度离心和流式细胞仪分离后 ,可得到一定程度的富集和纯化 ,11～ 2 0周内FNRBCs数与孕期似无相关性 ,为非创伤性产前诊断提供实验数据与方法基础     

PCR技术检测孕妇外周血中胎儿细胞的研究

根据Ｙ染色体序列特点，含有Ｙ染色体特异重复ＤＮＡ族（ＤＹＺ１）８００～５０００拷贝、新设计一对引物Ｙ３、Ｙ４经聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增该序列的特定片段，来检测孕妇血中胎儿细胞。作者用此方法扩增各妊娠早、中、晚孕妇外周血标本粗提ＤＮＡ，检测男性胎儿细胞，与相应的绒毛、羊水及娩出胎儿性别相比较，符合率分别为９３％、１００％、８７．５％。本研究为无创伤性产前诊断提供了新的途径。     

孕妇外周血血浆胎儿DNA的检测

目的：建立可靠有效的检测孕妇血浆胎儿DNA的方法,探讨其在非创伤性产前诊断中的价值。方法：采用引物引伸预扩增（PEP）法及巢式PCR技术对65例孕妇外周血血浆DNA进行正常男性SRY基因检测。结果：单用巢式PCR技术和联合应用PEP,PCR技术对怀男胎的孕妇血中SRY基因检出率分别为65．2％（30／46）和89．1％（41／46）,两组差异有极显著性,对怀女胎孕妇血中SRY基因的未检出率为78．9％（15／19）和94．7％（18／19）,两组差异无显著性。结论：应用PEP法可对胎儿DNA进行全基因组扩增使DNA模板量增加,并使继后的PCR技术检测SRY基因的敏感性明显提高,PEP法是解决母血中胎儿细胞数量太少的途径之一,孕妇血浆中胎儿DNA可成为非创伤性产前诊断的胎儿物质来源。     

基于纳米技术从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞并进行无创性产前诊断的可行性

目的 建立一种基于纳米技术从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞并进行无创性产前诊断的方法.方法 Percoll 1.077单密度梯度离心法之后,选用抗体CD147修饰到以玻璃为载体的纳米羟基磷灰石基底上,对新生儿脐血中的胎儿有核红细胞进行捕获,利用胎儿特异性抗体HbF、红细胞表面特异性抗体CD71以及细胞核染色剂DAPI对捕获到的新生儿脐血中有核红细胞进行染色标记,进而实现分选.对正常不同孕周孕妇外周血、未孕健康妇女外周血及新生儿脐血中抗体CD147捕获到的有核红细胞进行染色标记分选.抽取10例行常规产检时发现高危因素的孕妇外周血2 mL,用抗体CD147捕获胎儿有核红细胞并用X、Y、18、21染色体探针进行荧光原位杂交.结果 用HbF+CD71双标记染色法的胎儿有核红细胞阳性率与HbF单染和CD71单染标记的细胞阳性率相比差异有统计学意义(P<0.05);HbF单染和CD71单染标记的阳性细胞率之间相比差异无统计学意义(P>0.05);在孕16~20周时孕妇外周血中阳性细胞数目达到顶峰,之后随孕周增加而呈下降趋势.10例高危孕妇外周血标本均成功分离出胎儿有核红细胞,并经过FISH鉴定,本方法对男性胎儿诊断的灵敏度为85.71%,特异度为100.00%,对女性胎儿诊断的灵敏度为100.00%,特异度为85.71%,同时诊断出1例非整倍染色体胎儿,所有结果均经后期随访证实.结论 用纳米材料为基底,抗体CD147捕获,HbF+CD71双染色标记法对孕妇外周血中的胎儿有核红细胞进行识别和富集,可提高胎儿有核红细胞的检出率,可为进一步产前诊断奠定基础,最佳时机应该在孕16~20周.     

孕妇外周血胎儿细胞在无创性产前诊断中的应用

传统的产前诊断为了获取胎儿遗传信息 ,常需羊膜腔穿刺、绒毛活检、胎儿脐静脉穿刺及胎儿组织活检等 ,这些侵入性操作对胎儿及孕妇均有一定的创伤。随着遗传医学、分子生物学技术的发展 ,产前诊断在无创伤性方面得到了迅猛发展 ,近年来研究的焦点集中在富集分离母血中胎儿细胞上。本文就此研究进展作一综述。1　适用于产前诊断的胎儿细胞　　随着胎儿细胞分离技术的日趋成熟以及聚合酶链反应 ( PCR)技术的发展 ,近年来大量的研究证实了母血中确实存在胎儿细胞。如马旭[1] 对 1 1 7例孕妇血中胎儿细胞分别进行了免疫学鉴定、多参数流式细胞…     

实验树鼩外周血单个核细胞分离的方法探讨

目的:建立从实验树鼩外周血中分离单个核细胞的可靠方法.方法:使用不同密度的Percoll?分离溶液对树鼩的静脉血进行密度梯度离心,并通过Wright-Giemsa染色和细胞计数分析树鼩的单核细胞的最佳分离密度.结果:采用60％和67％Percoll?分离溶液的不连续密度梯度离心方法可以分离出树鼩粒细胞.60％～63％的...     

脐血和成人外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的分离及功能特征的比较

目的分离成人外周血、脐血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞,并检测其功能,以了解脐血CD4^＋CD25^＋T细胞的特性。方法应用免疫磁珠分选法从健康成人外周血、脐血淋巴细胞中分离纯化CD4^＋CD25^＋、CD4＋CD25-T细胞。应用流式细胞术检测分离纯度,胎盘蓝染色检测细胞存活率;RT-PCR技术检测CD4^＋CD25^＋、CD4＋CD25-T细胞中Foxp3的mRNA的表达;体外增殖实验检测其对CD4＋CD25-T细胞的免疫抑制作用。结果 MACS分离的CD4^＋CD25^＋T细胞、CD4＋CD25-T细胞纯度达（92.7±1.6）%、（90.3±1.2）%,细胞存活率达（95.3±2.1）%;体外经抗CD3、CD28单克隆抗体刺激培养的脐血及成人外周血CD4^＋CD25^＋T细胞同时得到扩增,而且高表达Foxp3;CD4^＋CD25^＋T细胞能有效的抑制效应T细胞的增殖,当效靶比为1︰1时,其抑制效应T细胞的作用最强,成人外周血抑制率为（81.36±1.61）%、脐血抑制率为（90.74±2.43）%。结论脐血和成人外周血CD4^＋CD25^＋T细胞是一群具有免疫抑制功能的调节性T细胞,与成人外周血相比,培养后的脐血CD4^＋CD25^＋T细胞比成人外周血有更强的免疫抑制功能。     

母体外周血液中胎儿有核红细胞的检测及比例与孕周的关系

目的探讨孕周与母体外周血液中胎儿有核红细胞比例的关系。方法回顾性分析我院2008年2月～2011年3月收治入院的孕10～35周的孕妇80例,采用SYSMEX XE-2100血细胞计数仪对孕妇外周血中胎儿有核红细胞进行计数,并对表达转铁蛋白受体的阳性细胞（CD71＋细胞）进行技术分选。另外选择我院同期健康体检未孕妇女80例和80例新生儿进行检查对比。结果妊娠组的CD71＋细胞比例明显高于健康未孕组和新生儿脐血组（P〈0.01）。在孕妇组中,CD71＋细胞最高峰值出现于第17、18孕周。结论 SYSMEX XE-2100血细胞计数仪计数特异性、灵敏性较强。利用母体血循环中的胎儿细胞做产前诊断的最佳时间在第17、18孕周。     

Isolation of fetal nucleated red blood cells from maternal blood

In the sixties of this century, researchers havefound that there were fetal cells in maternal peripheral bloodlll. Because of the scanty amount of thesecells and technical limitations, research work in thisfield developed very slowly. Since the introduction offluorescent activated cell sorting (FACS) and magnetic activated cell sorting (MACS), it was possibleto isolate fetal cells from maternal blood. But the iserlation results were unsatisfied. Moreover, the expensive equipment and the co…     

Detection of Fetal Nucleated Erythrocytes and Fetal DNA from Peripheral Blood of Pregnant Women

Prenatal diagnosis of inherited disorders by non-invasive techniques has aroused great interestthroughout the world.Nowadays,the most impor-tantapproachesare based on the detection offetalnu-cleated erythrocytes(FNRBCs) in maternalperipher-al blood and the analysis of fetal DNA from maternalplasma.However,due to the rarity of FNRBCs,theabsence of ideal separation methods and the difficultyin accurate identification of fetal cells or DNA frommaternal,it is impossible for these techniques …     

应用孕妇外周血胎儿有核红细胞数量及胎儿脐动脉血流变化预测胎儿慢性缺氧

目的探讨母血中胎儿有核红细胞(fetal nucleated red blood cells,FNRBC)数量及胎儿脐动脉血流改变与胎儿慢性缺氧的关系。方法对78例孕妇(正常妊娠组30例、胎儿急性缺氧组18例、胎儿慢性缺氧组30例)的外周血分别进行单密度梯度离心、FNRBC计数;同时行彩色多普勒超声检测胎儿脐动脉血流搏动指数(pulsatility indexes,PI)、阻力指数(resistance indexes,RI)及收缩期最大血流速度与舒张末期血流速度的比值(systolic/diastolic,S/D);比较单法检测及二法联检的灵敏度、特异度及诊断正确率等。并通过病理证实胎盘变化。结果胎儿慢性缺氧组、急性缺氧组、正常妊娠组孕妇外周血中FNRBC计数分别为(15.42±4.11)、(6.92±2.17)、(5.95±1.76)个/6ml,慢性缺氧组FNRBC计数明显高于其他2组(P<0.05),而后两组间比较无显著性差异(P>0.05)。慢性缺氧组脐血流S/D、PI、RI值分别为(3.27±0.66)、(1.12±0.15)和(0.71±0.07),均显著高于正常妊娠组的(2.16±0.25)、(...     

半乳糖特异性植物血凝素富集胎儿有核红细胞

目的 建立半乳糖特异性植物血凝素分离和富集胎儿有核红细胞的方法和反应装置,为胎儿有核红细胞用于产前诊断提供基础.方法 选用38～40孕周正常分娩胎儿脐血,经半乳糖特异性植物血凝素反应体系分离和富集胎儿有核红细胞,半乳糖浓度为50、100、100、150、200μg/mL、大豆凝集素浓度为10、20、30、40、50μg/mL.特异性荧光抗体染色后用激光共聚焦显微镜观察并计数分离和富集到的胎儿有核红细胞.结果 半乳糖特异性植物血凝素反应体系能够有效分离和富集胎儿有核红细胞,当包被玻片的半乳糖浓度为100μg/mL、大豆凝集素浓度为20μg/mL时,与有核细胞的比率最高为(6.54±0.56)%.结论 半乳糖特异性植物凝素可用于选择性地分离和富集胎儿有核红细胞.     

用母体外周血中胎儿游离DNA检测胎儿SRY基因的研究

目的探索从孕妇外周血浆中检测胎儿躲y基因的高灵敏性及高准确性方法。方法应用PcR、实时荧光定量PcR、PEP—PcR技术,检测33例妊娠8～14周的正常孕妇血浆中游离胎儿DNA的脓y基因。组织标本躲y基因检测结果作为性别判定的标准。结果33例孕妇血浆标本检测职y基因,普通PcR检出的灵敏性为58．82％,特异性100％。PEP—PCR的灵敏性为88．24％,特异性100％。荧光定量PCR的灵敏性为88．24％,特异性100％。结论PEP—PCR技术和荧光定量PcR技术均可以提高胎儿游离DNA检测的灵敏度及准确性．可用于进一步染色体疾病的无创性产前筛查研究。     

N-乙酰半乳糖特异性植物凝素分离和富集胎儿有核红细胞

目的 采用N-乙酰半乳糖(N-Acetyl-D-galactosamine, GalNAc)包被的玻片分离和富集胎儿有核红细胞(fetal nucleated red blood cells,FNRBCs).方法 用密度梯度离心法收集胎儿脐血中的FNRBCs,然后将其与不同浓度的大豆凝聚素(SBA)混合,所形成的"FNRBCs-SBA"复合物用GalNAc包被的玻片来分离和富集,分析SBA工作浓度对FNRBCs分离和富集效率的影响.结果 当GalNAc包被玻片的浓度为100 μg/ml时,20 μg/ml 的SBA浓度是分离和富集FNRBCs的最适浓度;此时WBC与有核红细胞的比值较低(27.7%), 而FNRBCs与有核红细胞的比值最高(3.7%).结论 N-乙酰半乳糖特异性植物凝素可用于选择性地分离和富集FNRBCs,与传统方法相比较具有无需特殊仪器与设备,简便快速的优点.     

QPCR技术检测孕妇外周血中胎儿DNA方法的建立

目的:建立QPCR技术检测孕妇外周血中胎儿DNA的方法,并探讨其方法的稳定性、灵敏性与可靠性.方法:通过prime5.0设计出SRY与β-globin的TapMan探针,并对其QPCR反应体系进行优化.结果:分别得到了SRY与β-globin的引物及探针的反应最适浓度比,建立了其最佳QPCR反应体系,并得出所需外周血的最少量.结论:成功建立了QPCR技术检测孕妇外周血中胎儿DNA的方法,该方法将可用于无创性相关产前诊断.     

母血中胎儿有核红细胞用于无创产前诊断的研究

目的 用分离到的胎儿有核红细胞,评价应用荧光原位杂交技术筛查染色体非整倍性的临床应用价值.方法 43例(孕周17～21+4周)拟行产前诊断的孕妇外周血20ml,用双密度梯度离心和双抗体磁性活化细胞分选(magnetic activated cell sorting,MACS)方法富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞,其中10例患者富集的细胞进行吉姆萨-瑞氏染色,10例进行抗人CD235a和CD71免疫荧光抗体染色,行细胞鉴定和计数.23例富集后的细胞用荧光染色体原位杂交(fluorescence chromosomal in situ hybridization,FISH)探针进行非整倍体分析,并与羊水培养后核型分析结果进行比较.结果 所有标本均分离出有核红细胞,并经组织学染色、免疫荧光特异抗体和FISH鉴定.23例FISH诊断中,未发现非整倍体异常;14例男性胎儿有13例发现Y荧光信号,1例未发现,女性胎儿中均发现2个X荧光信号.结论 荧光原位杂交技术可对经富集的孕妇外周血中胎儿细胞进行非整倍体诊断.     

孕妇外周血血浆胎源性牙釉质蛋白基因和DYS19位点检测

目的:检测孕妇外周血血浆胎源性牙釉质蛋白(Amelogenin)基因和DYS19位点,探讨其对男性胎儿性别诊断的可能性与准确性.为伴性遗传病的产前诊断提供参考.方法:采集22例正常孕妇外周血2 mL,以1例未婚无妊娠史女性为阴性对照、1例正常男性为阳性对照.提取血浆DNA作为PCR模板,以巢式PCR技术分别扩增Amelogenin基因和DYS19位点.并将实验结果与娩出后的新生儿实际性别比较.结果:孕妇外周血血浆中Amelogenin基因检测与娩出后新生儿实际性别符合率为95.5%.DYS19位点榆测符合率90.9%,2指标检测结果与胎儿实际性别符合率较高(kappa=0.909,P:0.088;kappa=0.820,P=0.120).Amelogenin基因与DYS19位点检测的一致率为95.2%.结论:Amelogenin基因和DYS19位点预测胎儿性别符合率无差异.联合检测Amelogenin基因和DYS19位点,可以提高诊断结果的可信度.