弓形虫主要表膜P30抗原的纯化与鉴定

目的 应用单克隆抗体免疫亲和层析技术提纯弓形虫主要表膜Ｐ３０抗原并进行鉴定。方法 将我们已建立的分泌抗表膜Ｐ３０抗原单克隆抗体的Ｅ３杂交瘤细胞注入ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔,收集腹水,用饱和硫酸胺沉淀和ＤＥＡＥ－－纤维柱层析法提纯单克隆抗体,将其偶联至溴化氢活化的琼脂糖４Ｂ上装柱,经免疫亲和层析技术,从大量的低功率超声粉碎速殖子抗原中分离纯化Ｐ３０蛋白质,并用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行鉴定。结果 本次实验约获得了８．１ｍｇ的Ｐ３０蛋白质,且纯度较高。结论 单克隆抗体免疫亲和层析技术可获得一定量的Ｐ３０抗原。     

抗弓形虫主要表膜P30抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗弓形虫主要表膜Ｐ３０抗原单克隆抗体（Ｍｃ－Ａｂ）半进行鉴定,为弓形虫病的诊断、抗原的提纯及亚单位疫苗的研制等提供可靠依据。方法 用ＲＨ株弓形虫速殖子膜抗原为免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取其脾细胞与小鼠ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合,筛选出能够稳定分泌高滴度抗Ｐ３０抗原ＭｃＡｂ杂交瘤细胞株,并测定Ｍｃ－Ａｂ免疫球蛋白亚类和单抗效价,用ＩＦＡＴ进行单抗识别的抗原定们,并通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅ     

弓形虫P30乳酸球菌口服免疫小鼠适当免疫剂量的探讨

目的:探讨弓形虫P30乳酸球菌口服免疫小鼠的适当免疫剂量,为体内免疫活性的研究提供直接的实验数据.方法:用弓形虫P30乳酸球菌口服免疫BALB/c实验小鼠,设三个免疫剂量组,分别为3×109CFU、3×108CFU、3×107CFU,同时设生理内水对照组.免疫结束2 w后,各实验组分别收集小鼠血清,以ELISA法测定血清中特异性抗体IgG的含量;各实验组取5只小鼠,以100个弓形虫强毒力RH株速殖子做虫体攻击实验,记录死亡时间.结果:三个免疫剂量组,在小鼠体内产生的抗体IgG有一定的差异(P＜0.01),但免疫剂量组一(3×109 CFU)与免疫剂量组2(3×108 CFU)几乎没有差别,免疫剂量组二偏差稍大;免疫剂量组一小鼠的平均存活时间有所延长,免疫剂量组二的小鼠最先出现死亡现象.结论:确定了3×109 CFU的免疫剂量,在此剂量下,小鼠的保护性效果则比其他剂量组有所提高.     

弓形虫P30基因非融合蛋白表达的研究

目的：构建弓形虫主要表面抗原P30基因的原核表达载体并在E.coli中进行表达。方法：采用定向克隆的方法。将PCR扩增得到的P30片段，插入原核表达质粒pBV220上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，于氨苄LB培养平板上筛选阳性克隆，经过酶切及PCR扩增鉴定重组子，将含阳性重组子pBV220-P30的工程菌经温度诱导表达，SDS-PAGE电泳及免疫印迹分析。结果：成功构建了pBV220-P30重组质粒；SDS-PAGE电泳及Western-blot显示表达P30非融合蛋白的分子量为29kD，且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论：从弓形虫基因组DNA中获取P30基因。并成功构建了pBV220-P30重组质粒，诱导表达了P30非融合蛋白，对弓形虫病基因疫苗研制奠定了基础。     

弓形虫表面抗原P22、P30复合基因在原核细胞中表达的研究

目的：对含有P22，P30复合基因的重组菌进行IPTG诱导表达，进而检测复合基因的融合表达产物的免疫活性。方法：用IPTG对工程菌进行诱导表达，表达产物行SDS－PAGE蛋白凝胶电泳及Western-Blot免疫印记检测，结果：蛋白电泳结果显示，阳性重组菌比阴性菌在66．5KDa位置上明显多一条带，此条带可与P30抗体结构并使免疫印记显示阳性结果。结论：含有P22、P30基因片段的质粒组体经诱导表达出融合蛋白，其内的组分蛋白P30具有与其相应抗体结合的能力。     

重组弓形虫P30抗原诊断弓形虫病的初步探讨

为探讨重组弓形虫P30抗原（rP30）对弓形虫病的诊断价值,将rP30包被于酶标反应板微孔,用常规ELISA检测血清抗体。结果4例染色试验阳性血清,抗-rP30 IgG全部阳性,阳性符合率为 100％;27例虫体IgG/IgM抗体阳性血清中,22例rP30I-ELISA阳性,符合率为85.2％;100例门诊病人和50例献血员血清的阳性检出率分别为9.0％和8.0％。说明rP30检测弓形虫病患者血清具有一定的敏感性和特异性,可望替代天然的弓形虫抗原用于弓形虫病的诊断。     

弓形虫P30-P22复合DNA疫苗免疫小鼠诱导的体液免疫应答

目的通过肌内注射弓形虫DNA疫苗PCDNA3．1-P30-P22直接免疫小鼠，观察其诱导的体液免疫应答及保护性作用。方法大量制备重组真核表达质粒PCDNA3．1-P30-P22，肌内注射免疫小鼠，ELISA法测定其抗体滴度的变化，用弓形虫作致死性攻击感染。结果实验组抗体水平明显高于对照组，二者存在显著性差异(P＜0．05)；攻击感染后实验组小鼠存活时间明显延长(P＜0．05)。结论重组真核表达质粒PCDNA3．1-P30-P22肌注BALB/C系小鼠可诱导一定的体液免疫应答，对攻击感染具有一定的保护性。     

弓形虫P30基因非融合蛋白表达的研究

目的构建弓形虫主要表面抗原P30基因的原核表达载体并在E.coli中进行表达.方法采用定向克隆的方法,将PCR扩增得到的P30片段,插入原核表达质粒pBV220上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,于氨苄LB培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及PCR扩增鉴定重组子.将含阳性重组子pBV220-P30的工程菌经温度诱导表达,SDS-PAGE电泳及免疫印迹分析.结果成功构建了pBV2200-P300重组质粒;SDS-PAGE电泳及Western-blot显示表达P30非融合蛋白的分子量为29kD,且能被弓形虫高免鼠血清识别.结论从弓形虫基因组DNA中获取P30基因,并成功构建了pBV220-P30重组质粒,诱导表达了P30非融合蛋白.对弓形虫病基因疫苗研制奠定了基础.     

弓形虫P30-P22 DNA疫苗免疫小鼠诱导的细胞免疫应答

目的观察弓形虫P30-P22 DNA疫苗免疫小鼠后所诱导的细胞免疫应答。方法大量制备重组真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22,经肌内注射免疫BALB/C小鼠,初次免疫后,第2周和第4周各加强免疫1次。用MTT法测定免疫鼠脾脏T淋巴细胞转化率和NK细胞杀伤率,用免疫荧光法对CD4 、CD8 T细胞亚群进行测定。结果NK细胞杀伤率:实验组为(72.3±4.15)%,空质粒对照组和PBS对照组分别为(51.3±4.67)%和(47.4±5.10)%,实验组与两对照组之间比较差异有统计学意义(P<0.05),两对照组之间无统计学意义(P>0.05);ConA刺激淋巴细胞转化实验,实验组与对照组差异无显著性(P>0.05);对T淋巴细胞亚群进行分析,可见CD8 的数量上升,CD4 /CD8 的比率下降,实验组与对照组有明显差异(P<0.05)。结论弓形虫表面抗原P30-P22 DNA疫苗免疫BALB/c小鼠可诱导一定的细胞免疫应答。     

弓形虫RH株表面抗原P30基因重组质粒的构建及鉴定

目的：构建弓形虫RH株表面抗原P30基因的重组表达质粒,为下一步免疫与诊断研究制备高纯度P30重组蛋白奠定基础。方法：自弓形虫RH株感染小鼠腹水中收集速殖子,用酚／氯仿法提取基因组DNA,用PCR法扩增编码P30的基因片段(经电泳切带纯化),定向插入到PQE-30表达质粒中,转化入TG1宿主菌,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切、PCR扩增和DNA序列分析等方法对插入片段进行鉴定。结果：阳性重组质粒PQE30-P30经Sal HindⅢ双酶切下的插片及PCR扩增产物均与原插入的P30基因片段大小一致为976bp,通过序列测定证实插入片段为编码P30的基因片段。结论：成功构建弓形虫表面抗原P30基因的重组质粒PQE30-P30。     

Expression of p30, the major surface antigen of Toxoplasma gondii, in baculovirus-insect cell system and the evaluation of immune response induced by p30

T~ gondii is an intiacellular ProtOZOan Par- optima gondii have been idelldried. One Of the s~easite and widely knoWn tO be infective in hUman, agricul- antigens, P30, has been isolated from the taChyAnte andthai and domestic ~s. It was estimated that as many idennded to have potential use as subedt yao.ine[3]. TIsas one ed Of the world population may have serological PIDtein is also PI'eSent in most of T~. p30 isevidence of infectionlll. Because of the POSSilile long in- highly anti…     

Expression of P30 gene of Toxoplasma gondii in Spodoptera frugiperda cell and Argyrogramma agnata larva

ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰ３０ｇｅｎｅｏｆＴｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉｉｎ　ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａｃｅｌｌａｎｄＡｒｇｙｒｏｇｒａｍｍａ　ａｇｎａｔａｌａｒｖａＣｈｅｎＸｉａｏｇｕａｎｇ；（陈晓光）；ＬｉｕＧｕｏｚｈａｎｇ（刘国...     

不同佐剂的弓形虫亚单位疫苗免疫效果观察

目的　探讨不同佐剂增强弓形虫P3 0 3 5亚单位疫苗刺激肌体产生免疫应答和保护性免疫力效果。　方法　应用拟菌颗粒、脂磷壁酸、蜂胶 3种佐剂分别和弓形虫P3 0 3 5特异蛋白组分混合、碾磨、免疫小白鼠 ,以福氏完全佐剂作对照 ,检测其细胞免疫和体液免疫 ,并观察其受到弓形虫攻击感染后的生存情况。　结果　拟菌颗粒佐剂能辅助弓形虫P3 0 3 5特异蛋白组分刺激宿主产生较高的细胞免疫和体液免疫 ,并能提供较好的免疫保护力。拟菌颗粒产生的IL -2较福氏完全佐剂稍低 ,但明显高于其它实验和对照组 (P <0 0 1) ,特别是IFN -γ和CD4 CD8 比值 ,两者差异均无显著性 (P >0 0 5 ) ,并且拟菌颗粒刺激机体产生的IgG明显高于福氏完全佐剂 (P <0 0 1)。脂磷壁酸佐剂和蜂胶佐剂辅助P3 0 3 5刺激产生的细胞免疫应答及免疫保护力低于拟菌颗粒佐剂和福氏完全佐剂。　结论　拟菌颗粒佐剂与福氏佐剂具有相似增强免疫应答和提高P3 0 3 5特异蛋白组分抗原的免疫原性作用 ,可用于弓形虫亚单位疫苗的研制。     

弓形虫p30基因在真核系统中的表达

采用聚乙二醇（PEG）沉淀法纯化克隆刚地弓形虫（Toxplasmagondii）p30基因的转移载体质粒pSXIVVI+X3－p30DNA；将pSXIVVI＋X3－p30DNA与粉纹夜蛾核型多角体缺陷型病毒TnNPV－SVI－GDNA共转染草地夜蛾（Sfg）细胞，构建出既能形成多角体又能表达外源基因的重组病毒TnNPV－p30。经空斑纯化挑选出6株单克隆重组病毒，感染细胞裂解液在相对分子质量约为34000～35000位置出现一条表达带；其含量占细胞总蛋白的5.13％～5．62％，株间差异不明显；用抗弓形虫多克隆抗血清进行Western－Blot呈一特异反应条带。感染后72h蛋白表达量最高，可达7．18％；96小时次之，为5．91％。     

Amplification，cloning，sequencing and expression of the gene encoding the major surface antigen of Toxoplasma gondii isolated

Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅｍａｊｏｒｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎｏｆＴｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉｉｓｏｌａｔｅｄｉｎＣｈｉｎａ￥ＣｈｅｎＸｉａ...