大肠杆菌表达系统的研究进展

近年来利用基因调控、融合表达、共表达以及代谢工程、定向进化等策略对大肠杆菌系统的载体和宿主进行了合理的改进,使目的基因的表达水平以及产物蛋白的活性大大提高,尤其是对长期以来有关真核基因在原核细胞中表达所存在的糖基化、二硫键形成等翻译后加工问题的研究取得了突破,使得大肠杆菌表达系统在研究和生产中的应用范围得到进一步拓宽。文章从表达载体和宿主细胞两个方面对大肠杆菌表达系统的研究进展进行了综述。     

His肽修饰小鼠IFNγ的制备

制备标记有6His的小鼠可溶性干扰素γ(Mouse interferon gamma,mIFNγ),为其功能研究提供更多实验基础.采用RT-PCR扩增编码mIFNγ的cDNA序列,克隆于pUC19质粒,测序鉴定正确后亚克隆到pQE80L表达质粒载体中,经BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切后1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定;利用SDS-PAGE和Western blot检测表达的目的蛋白,Ni2 -NTA亲和层析纯化重组蛋白,ELISA进行检测.结果RT-PCR扩增得到编码mIFNγ cDNA片段,测序结果正确,SDS-PAGE和Western blot分析显示重组蛋白在大肠杆菌中获得了较高水平表达,mIFNγ占菌体蛋白的30%.Ni2 -NTA亲和层析纯化得到的mIFNγ蛋白纯度达到96%以上;ELISA检测出目的蛋白.结果证实重组蛋白mIFNγ被成功制备.     

丙型肝炎病毒C端截短21个氨基酸NS5B蛋白的克隆、表达及鉴定

构建HCU C端截短21个氨基酸的.NS5B(HCV NS5B-C21)的重组原核表达质粒,并获得HCVNS5B-C21蛋白,为以其为靶位的抗HCV药物筛选等创造条件.利用PCR技术扩增HCVNS5B-C21基因,BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶酶切后连接到经同样酶酶切的原核表达载体pET-28a( )上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,获得阳性重组质粒pET-28a( )-NSSB-C21,IFTG诱导表达,亲和层析法纯化目的蛋白表达产物经SDS-PAGE进行鉴定.成功构建了HCV NSSB蛋白表达载体pET-28a( )-NS5B-C21,经诱导明显表达出6His-NS5B-C21,截短形式的6His-NS5D-C21表达产物的可溶性明显增加.HCV NS5B-C21蛋白在体外得到了有效表达,表达的蛋白主要存在于上清液中,纯化获得了NS5B-C21蛋白,为抗HCV药物筛选等奠定基础.     

来自肺炎克雷伯菌的SHV型β-内酰胺酶基因的克隆、表达与纯化

为研究先前筛得的可抑制TEM-1型β-内酰胺酶的多肽SIPIS-04-01对SHV型β-内酰胺酶的结合能力,从一株临床耐β-内酰胺类抗生素的肺炎克雷伯菌10032克隆了SHV型β-内酰胺酶基因,并替换质粒pUC18上原有的bla基因,转化大肠杆菌DH5α后表明该基因使宿主菌具有抗氨苄青霉素的能力。进一步将其克隆到一个高效表达载体pLY-5中,优化表达和纯化条件获得了SHV型β-内酰胺酶。体外试验证明该酶能降解氨苄青霉素,重组多肽SIPIS-04-01对此降解有所抑制。     

非融合型重组人骨唾液蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化

通过正交设计对毕赤酵母GS115/pPICZaAN-hbsp工程菌的发酵条件(菌体密度、甲醇诱导浓度、初始pH值、诱导时间)进行优化.采用重组人骨唾液蛋白(recombinant lauman bone sialoprotein,rhBSP)单克隆抗体与Aldehyde-Resin HP FF介质偶联制备免疫亲和层析柱,纯化非融合型rhBSP,并用Western blotting和补体抑制实验检测非融合型rhBSP的抗原性和活性.毕赤酵母GS115/pPICZαAN-hbsp工程菌最佳发酵优化为:菌体密度OD600达到45甲醇诱导剂量为1.5%,pH值6.0,诱导时间2 d,最大表达量为0.126 mg/ml.经免疫亲和层析法纯化后,SDS-PAGE显示非融合型rhBSP为43～66 ku的分散条带,纯度在90%以上,Westernblotting显示rhBSP具有良好的抗原性,补体实验证明纯化的非融合型rhBSP活性很好.毕赤酵母GS115/pPICzαAN-hbsp工程菌发酵条件经优化后能高效表达非融合型rhBSP,应用免疫亲和层析方法纯化的非融合型rHBSP纯度好,活性高,为进一步研究非融合型rHBSP打下了基础.