雪旺氏细胞和成纤维细胞体外培养的实验研究

目的：本实验通过雪旺氏细胞（Ｓｃ）和成纤维细胞（Ｆｂ）不同培养方法的研究来获得不同比例共存的雪旺氏细胞和成纤维细胞。方法。分散培养（１）差速贴壁法。（２）阿糖胞苷自理法。观察（１）相差显微镜，（２）Ｓ－１００免疫细胞化学染色。（３）细胞计数。结果：被Ｓ－１００染色染上雪旺氏细胞在相差显微镜下观察到的活体雪旺氏细胞的开矿是一致的，细胞呈梭形，经差速壁法和阿糖包苷处理后３天雪旺氏细胞所占比例为９５％，     

乙酰肝素酶及碱性成纤维细胞生长因子在子宫腺肌病中的表达及意义

目的:探讨乙酰肝素酶(Heparanase,Hpa)和碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)在子宫腺肌病中的表达及其临床意义。方法:免疫组化链霉亲和素生物素过氧化物(Strepta-vidin Biotin Complex,SABC)法检测32例子宫腺肌病患者的腺肌病病灶、异位内膜和在位内膜中Hpa、bFGF的表达,并与因子宫肌瘤行子宫切除术,经病理检查证实的正常的子宫内膜患者30例对照分析。结果:Hpa在子宫腺肌病患者的在位和异位内膜组织中的阳性表达率明显高于正常对照组,差异有统计学意义;子宫腺肌病患者在位内膜组bFGF阳性表达率显著高于对照组,差异有统计学意义;子宫腺肌病异位组与对照组bFGF阳性表达率无显著性差异。结论:Hpa、bFGF的表达说明两者在子宫内膜侵入子宫肌层的过程中起一定作用,为子宫腺肌病的预防和治疗提供理论依据。     

人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞的原代培养和鉴定的实验研究

目的建立人皮肤角质形成细胞(keratinocyte)成纤维细胞(fibmblast)原代培养和体外连续培养的模型，为组织工程化皮肤提供充足的种子细胞。方法以5-15岁小儿包皮为材料，胰蛋白酶消化后，分离两种细胞，分别用无血清表皮培养液(K-SFM)、DMEM(10％血清)培养，对年轻细胞(2-4代角质形成细胞，10-40代成纤维细胞)均用倒置显微镜进行大体观察，透射电镜进行超微结构观察，并拍照记录，同时进行免疫细胞化学鉴定。结果消化后得到大量细胞，在培养2周后开始传代，光镜下角质形成细胞呈典型铺路石状，透射电镜下呈多边形，符合角质形成细胞特征；成纤维细胞光镜下呈梭形，放射状或漩涡状排列，电镜证实是成纤维细胞。免疫细胞化学检测：角质形成细胞鼠抗人角蛋白(AE1／AE3)单克隆抗体(mouse anti-cytokeratin)染色阳性；成纤维细胞鼠抗人Ⅰ型，Ⅲ型胶原单克隆抗体(mouse anti-TypeⅠ，ⅢCollagen)和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(mouse anti-vim-entin)染色阳性。结论用简便易行，经济实用的方法在体外对角质形成细胞和成纤维细胞进行分离、培养和传代，能同时得到足够数量的组织工程皮肤的种子细胞。     

PTTG在原发性胆囊癌组织中表达的研究

目的　探讨垂体肿瘤转化基因 (PituitaryTumorTransformingGene ,PTTG)在原发性胆囊癌中的表达及其临床病理意义。方法　应用免疫组织化学法 ,检测 41例原发性胆囊癌及 2 0例慢性结石性胆囊炎中PTTG表达水平 ,并结合患者的临床病理资料进行统计学分析。结果　在原发性胆囊癌中PTTG阳性表达率为 85 .4%,其阳性率及表达等级均明显高于慢性胆囊炎中的表达情况 (P <0 .0 5 ) ;PTTG表达等级与胆囊癌的Nevin分期和淋巴结转移密切相关 (P <0 .0 5 ) ;PTTG表达与胆囊癌Nevin分期成等级正相关 (r =0 .5 3 3 ,P <0 .0 5 ) ;PTTG表达阳性患者的累积生存期明显低于阴性者 (P <0 .0 5 )。结论　PTTG可能在胆囊癌的发生、发展及预后中起着重要作用。PTTG表达的检测有助于原发性胆囊癌恶性程度和预后的判断 ,以进一步指导临床诊疗。     

兔骨折骨痂中骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子基因的表达

兔骨折骨痂中骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子基因的表达李亚非李青马福成陈万录刘新平骨断端成骨细胞活性和血液循环状态与骨折愈合、预后密切相关。骨形态发生蛋白（ＢＭＰ）有高度骨诱导活性，碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）也有促进成骨细胞增殖和毛细血管增...     

鼻咽癌中碱性成纤维细胞生长因子的实验研究

目的：研究碱性成纤维细胞生长因子在鼻咽癌中的表达,探讨它与鼻咽癌的增生、浸润及转移的关系。方法在26例鼻咽癌及相应癌旁组织和10例正常鼻咽部黏膜组织中,应用 RT-PCR和免疫组织化学方法检测碱性成纤维细胞生长因子mRNA和蛋白质的表达。结果碱性成纤维细胞生长因子在鼻咽癌组织中高表达,在正常鼻咽部黏膜中低表达,差异具有统计学意义（P＜0．01）。结论碱性成纤维细胞生长因子与鼻咽癌的生长、浸润及转移有密切关系。     

成纤维细胞活化蛋白在乳腺癌中表达的临床病理意义

目的：探讨成纤维细胞活化蛋白在乳腺癌中表达的临床病理意义。方法：应用免疫组织化学技术检测乳腺癌和正常乳腺组织中成纤维细胞活化蛋白的表达,分析蛋白表达与临床指标的相关性。结果：α-FAP在50例正常乳腺组织和良性增生性病变中的阳性表达率为10.0%（5/50）,在220例浸润性导管癌中的阳性表达率为31.8%（70/220）,两者比较有统计学意义（P〈0.05）。α-FAP阳性率与乳腺癌患者的年龄、肿块大小、淋巴结转移、分期无显著性相关,但与患者病死率有密切相关（P=0.01）。α-FAP表达可影响乳腺癌的生存,α-FAP阴性患者生存期显著长于α-FAP阳性患者（P=0.002）。结论：乳腺癌中α-FAP表达与乳腺癌的发生、演进、预后相关,α-FAP表达提示乳腺癌预后差。     

人眼睑组织来源的成纤维细胞作为饲养层细胞构建人口腔黏膜上皮细胞片层的研究

目的：探讨人眼睑组织来源的成纤维细胞作为饲养层细胞代替鼠源饲养层细胞在体外培养人口腔黏膜上皮细胞的可行性。方法：通过酶消化法从人眼睑组织中分离成纤维细胞传代培养，取P5代成纤维细胞通过丝裂霉素C方法制备饲养层细胞，将其制备成的饲养层细胞用来培养商品化人口腔黏膜上皮细胞。通过罗丹明染色观察其细胞克隆形成率；HE染色观察细胞片层的结构；免疫荧光检测特征蛋白P63、β1-integrin的表达。结果：人眼睑组织来源的成纤维细胞在体外具有较强的增殖能力，高表达成纤维细胞特异性标志性蛋白CD90，培养的人口腔黏膜上皮细胞呈克隆样生长，细胞克隆形成率约为2.2%，并将其构建成3～4层口腔黏膜细胞片层，且高表达上皮细胞标志物P63及β1-integrin。结论：人眼睑组织来源的成纤维细胞可以作为饲养层细胞构建人口腔黏膜上皮细胞片层，为临床应用提供一种新的人源化饲养层工具细胞。     

胰腺癌微血管密度和p14蛋白表达及其发生、发展的相关实验研究

目的：探讨胰腺癌组织微血管密度、p14^ARF表达对胰腺癌发生、发展的影响。方法：用免疫组织化学Envision改良法检测10例正常胰腺组织、42例胰腺癌组织中p14^ARF蛋白的表达；以Ⅶ因子相关抗原(FVⅢ—RAg)标记血管内皮细胞，采用ABC免疫组化法检测10例正常胰腺组织、42例胰腺癌组织中微血管密度。结果：正常胰腺组织中p14^ARF的表达率为90％，胰腺癌组织中为35．7％(P＜0．01)；胰腺癌组织的平均微血管密度与正常对照组之间差异有显著性(P＜0．01)；胰腺癌临床Ⅲ、Ⅳ期的平均微血管密度明显高于Ⅰ、Ⅱ期(P＜0．05)：淋巴结有转移的胰腺癌平均测血管密度明显高于淋巴结无转移组(P＜0．05)；胰腺癌组织中p14^ARF蛋白阳性表达的平均微血管密度低于p14^ARF蛋白阴性表达的胰腺癌组织，差异有显著性(P＜0．05)，胰腺癌组织的平均微血管密度与组织学分级、癌的浸润范围及肿块大小无关(P＞0．05)。结论：微血管密度、p14^ARF与胰腺癌的发生、发展存在着密切关系。     

软骨形态发生蛋白1诱导真皮成纤维细胞表达软骨细胞表型的实验研究

目的应用软骨形态发生蛋白(CDMP)生长因子,体外诱导真皮成纤维细胞向成软骨细胞表型分化,探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性.方法取包皮环切术后丢弃真皮组织共3例,成纤维细胞体外培养扩增至第二代,以1×104/cm2密度接种,12 h后加入细胞诱导液(10%胎牛血清F-12培养液,CDMP1终浓度为100 ng/ml)单层培养,未加的成纤维细胞培养用CDMP1为对照.诱导7 d后观察细胞形态变化,Image Plus图像分析软件计算细胞长宽比例.激光共聚焦显微镜分别观察诱导前后细胞内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表达及分布,Western印迹检测诱导前后细胞Ⅱ型胶原蛋白表达.反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测诱导后成软骨相关的Sox9、聚集蛋白聚糖与Ⅱ、Ⅸ型胶原mRNA表达;同时检测与成骨相关的X型胶原、碱性磷酸酶(AKP)mRNA表达.培养第二代细胞以2×107个细胞/ml细胞密度进行离心管法培养,诱导14 d后行阿辛蓝与Ⅱ型胶原免疫组化染色.结果诱导后可见单层培养的成纤维细胞形态由长梭形向软骨细胞样多角形转变,Image Plus图像分析软件计算细胞诱导后的长宽比例为(1.40±0.15),较诱导前(7.40±1.30)差异有显著意义(P＜0.05);与正常软骨细胞(1.29±0.24)差异无显著意义.免疫荧光激光共聚焦观察发现诱导后细胞内出现Ⅱ型胶原表达,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达呈阳性.RT-PCR检测成软骨相关的Sox9,聚集蛋白聚糖,Ⅱ、Ⅸ型胶原mRNA表达阳性;X型胶原、AKP未检测到mRNA阳性表达.Western印迹检测细胞诱导后Ⅱ型胶原蛋白表达阳性.离心管培养诱导7 d后阿辛蓝染色示糖胺聚糖(GAG)均匀分布于基质中,免疫组化染色示基质中Ⅱ型胶原表达阳性.结论第二代成人真皮成纤维细胞在CDMP1生长因子诱导下可向成软骨细胞表型分化,并能分泌软骨细胞特异性基质,有望成为软骨组织工程新的种子细胞来源.     

Cx43在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的 探讨非小细胞肺癌组织及癌旁正常肺组织中Cx43蛋白及mRNA的表达及意义.方法 应用免疫组织化学、Western blot和原位分子杂交观察48例非小细胞肺癌（NSCLC）及22例癌旁正常肺组织中Cx43蛋白及mRNA的表达.结果 ①癌旁正常肺组织和NSCLC组织中Cx43蛋白阳性表达率分别为90.91%和47.92%;Cx43mRNA的阳性表达率分另别为95.45%和60.42%.NSCLC组织中Cx43蛋白及mRNA阳性表达率均低于正常肺组织（P均＜0.05）.②有淋巴结转移组Cx43蛋白及mRNA阳性表达率分别为16.00%和20.00%;无淋巴结转移组两者的阳性表达率分别为69.57%和78.26%.两两比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）.③Western blot显示NSCLC组织中Cx43的蛋白表达水平低于正常肺组织,有转移组中Cx43的蛋白表达水平低于无转移组,各组比较差异均有统计学意义,P均＜0.05.结论 Cx43蛋白和mRNA低表达与非小细胞肺癌发生和转移有关.     

卡维地洛对扩张型心肌病大鼠心肌Cx43表达的影响

目的:观察卡维地洛对阿霉素诱导的扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)大鼠心室肌缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)表达的影响。方法:应用多柔比星腹腔注射建立DCM大鼠模型;模型组大鼠按照不同的给药方法随机分为卡维地洛组和模型对照组,卡维地洛组应用卡维地洛加双蒸馏水灌胃,模型对照组和正常对照组用定量的双蒸馏水灌胃,三组均1次/d,灌胃4周。12周末超声测量各组大鼠心脏左心室射血分数(LVEF),逆转录聚合酶链反应法检测Cx43 mRNA,采用免疫组化方法观察Cx43分布。结果:与模型对照组比较,卡维地洛组大鼠心肌Cx43mRNA、Cx43平均灰度值、LVEF及均明显增高,卡维地洛组较模型对照组心肌Cx43的分布紊乱有改善,差异均有统计学意义。结论:卡维地洛能改善DCM大鼠心肌Cx43表达和分布,并能改善其心功能。     

Cx43、ILK蛋白的表达与卵巢上皮性肿瘤生物学行为的关系

目的 Cx43、ILK蛋白在不同类型、不同分期的卵巢上皮性肿瘤的表达情况。方法采用S-P法免疫组化染色观察Cx43、ILK蛋白在37例卵巢良性肿瘤、33例卵巢交界性肿瘤和69例卵巢上皮癌的表达情况。结果在卵巢癌中Cx43蛋白表达阳性率降低;ILK表达阳性率增高。Cx43蛋白表达与组织学类型无关;而ILK在粘液性癌表达阳性率与浆液性癌和子宫内膜样癌比较,差异显著。Cx43蛋白和ILK在不同分化程度卵巢癌中的表达无显著差异。Cx43蛋白在Ⅰ～Ⅱ期癌表达阳性率均高于Ⅲ～Ⅳ期癌,ILK在Ⅲ～Ⅳ期癌表达阳性率高于Ⅰ～Ⅱ期癌。结论 Cx43表达缺失及ILK的过度在卵巢癌的发生和发展中可能都起重要作用。     

膀胱移行细胞癌中间隙连接蛋白Cx43mRNA、Bcl-2mRNA和Bax mRNA的表达及其相关性研究

目的 探讨间隙连接蛋白Cx43、Bcl-2及Bax在膀胱移行细胞癌(BTCC)中的表达及其意义.方法 用半定量RT-PCR的方法检测Cx43、Bcl-2及Bax在35例BTCC和21例癌旁组织中的表达情况,并分析其与BTCC临床病理因素的关系.同时取正常膀胱组织15例做对照.结果 BTCC组织中Cx43 mRNA的表达比值[Cx43/人肌动蛋白(β-actin)]为(0.34±0.37),低于BTCC癌旁组织中的(0.79±0.70)和正常膀胱组织的(0.81±0.47),差异有统计学意义(P＜0.01);Bcl-2 mRNA表达比值为(0.35±0.43),高于癌旁组织中的(0.16±0.33)和正常膀胱组织的(0.15±0.23),差异有统计学意义(P＜0.01).癌旁组织与正常膀胱组织Cx43 mRNA及Bcl-2 mRNA的表达比值比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).Cx43 mRNA在BTCC病理分级G3的表达为(0.30±0.16),G2的表达为(0.54±0.22),G1的表达为(0.60±0.25),3个级别比较差异有统计学意义(P＜0.05).Bcl-2 mRNA在BTCC病理分级G3的表达为(0.47±0.15),G2的表达为(0.35±0.11),G1的表达为(0.24±0.10),3个级别间比较差异有统计学意义(P＜0.01).复发BTCC组织中Bcl-2 mRNA的表达水平(0.40±0.15)高于初发癌组织(0.28±0.11),差异有统计学意义(P＜0.05).Bax mRNA在BTCC组织、癌旁组织及正常膀胱组织中的表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05).Bax mRNA的表达水平与BTCC患者的肿瘤分期、病理分级以及肿瘤有无复发比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 Cx43 表达下调与BTCC的发生、进展及其恶性特征有关,Cx43基因可能与凋亡相关基因Bcl-2(或Bcl-2/Bax)在BTCC的发展中起拮抗作用,与细胞的凋亡过程有关.     

阴茎包埋对大鼠阴茎海绵体缝隙连接蛋白43表达的影响

目的:探讨阴茎包埋对阴茎海绵体组织缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响。方法:通过建立隐匿阴茎大鼠模型获得实验标本,分2月组、4月组,每组25只大鼠,各阶段又分包埋组(15只),正常组(10只),光镜下观察海绵体形态结构的改变,免疫组化法观察海绵体平滑肌细胞Cx43的表达。结果:2月包埋组与2月正常组相比Cx43的表达无明显变化(吸光度值0.30±0.04比0.34±0.11,P>0.05),包埋4月组光镜下见大鼠阴茎海绵体大量间质组织增生,海绵窦狭窄,免疫组化观察包埋4月组大鼠阴茎海绵体平滑肌Cx43表达较正常组明显降低(正常4月组吸光度值0.38±0.06;包埋4月组0.18±0.03,P<0.05)。结论:随着包埋时间的延长,阴茎包埋导致海绵体形态结构上的病理改变、Cx43表达减少,可能引起阴茎勃起功能障碍。     

胃癌组织中Cx43和Skp2的表达及其相关性

目的:检测Cx43和Skp2在胃癌中的表达,探讨其与胃癌发展的关系以及两者的相互关系。方法:采用免疫组织化学法检测Cx43和Skp2在胃癌和正常胃组织中的表达,研究它们的表达与胃癌的关系以及二者的相关性。结果:在胃癌中,Cx43的阳性表达率以及染色强度均随分化程度的降低而呈现出下降趋势(P<0.05)。Skp2的阳性表达率随分化程度的降低而呈现出上升趋势(P<0.05)。Cx43与Skp2的表达呈现负相关性。结论:在胃癌组织中Cx43的低表达与Skp2的表达上调显示二者存在负相关,对胃癌的发生发展起一定作用。     

Cx43在神经管畸形发生中神经上皮的表达及意义

目的观察缝隙连接蛋白43(Connexin43, Cx43)在神经管畸形(neural tube defects, NTDs)发生中神经上皮的表达,以探讨Cx43与NTDs发生的关系。方法用过量RA建立小鼠胚胎NTDs模型。用SABC免疫组化方法和图像处理系统,分析比较实验组和对照组神经管发育情况以及Cx43蛋白表达的位置和强度。结果对照组神经管发育良好并适时闭合,实验组神经管发育不良而且不能闭合,脑泡不能发育;Cx43蛋白表达于神经上皮细胞的细胞膜和细胞质内,而且实验组明显高于对照组（P＜0.05）;Cx43蛋白的表达表现出时间的差异性。结论Cx43蛋白定位于神经管上皮细胞的胞膜和胞质内,且有时间差异性。Cx43蛋白的过高表达可能与RA致NTDs密切相关。     

高血压性心脏病猝死者心肌连接蛋白43的表达

目的:探讨高血压性心脏病(HHD)猝死者心肌连接蛋白43(Cx43)表达及其与猝死的关系。方法:挑选我校基础医学院法医学教研室2009-2011年尸体解剖案例20例,分为两组,每组各10例。①HHD组:男性9例,女性1例;年龄为41-73岁,平均年龄56.5岁;均为高血压性心脏病猝死。②非心源性死亡对照组:男性7例,女性3例;年龄为40-53岁,平均年龄46.8岁。每例心脏进行常规病理学检查并取材后,运用免疫组织化学和图像分析技术,检测左心室肌的Cx43染色情况。结果:HHD组心肌Cx43阳性颗粒数量显著减少,着色明显减弱,部分呈颗粒状,且分布于心室肌细胞内或细胞侧-侧连接处;对照组的染色未见明显变化。定量检测并经统计分析发现,HHD组Cx43蛋白染色阳性的面积和平均光密度与对照组均有非常显著的差异(P<0.01)。结论:高血压性心脏病猝死者心室肌Cx43蛋白的表达明显减少,高血压性心脏病的猝死可能与Cx43的表达变化有一定的关系。     

构建Cx43特异性shRNA真核表达载体及体外干扰效率的鉴定

目的 本研究前期研究结果表明Cx43与穴位、经脉之间存在着密切联系,为了进一步研究Cx43在针刺活动中的作用,我们应用RNA干扰技术首先构建针对Cx43基因的特异性shRNA(small hairpin RNA)真核表达载体,并转染体外培养的NIH/3T3细胞,观察其对Cx43基因的沉默效果,从而挑选出一条能有效沉默Cx43表达的shRNA,为进一步在体研究作准备.方法 针对大、小鼠Cx43 mRNA同源序列的两个靶点,体外合成两对互补的寡核苷酸链.经退火连接形成双链,插入到Pgenesil-1真核表达载体.经酶切鉴定及测序等步骤后,将构建好的表达载体[分别命名为P-Cx43-shRNA(1)、P-Cx43-shRNA(2)]分别转染NIH/3T3细胞,G418筛选后应用免疫荧光、Western blot等方法观察P-Cx43-shRNA对Cx43蛋白水平的影响.结果 酶切鉴定及测序结果表明,成功构建了两个针对Cx43基因的shRNA真核表达载体及对照质粒(P-con-shRNA);Western blot结果说明两个Cx43特异性shRNA真核表达载体分别使Cx43蛋白水平下降了73.5%(P＜0.01)和10.8%(P＞0.05).阴性对照质粒(P-con-shRNA)对NIH/3T3细胞Cx43蛋白水平无明显影响.结论 重组质粒P-Cx43-shRNA(1)能较好的特异性抑制Cx43基因在NIH/3T3细胞中的表达,为进一步在体研究提供了实验依据.     

缝隙连接蛋白43在子痫前期患者胎盘组织中的表达及意义

目的探讨缝隙连接蛋白43(Cx43)在子痫前期患者与正常妊娠妇女胎盘组织中的表达规律及其在子痫前期发病过程中可能的机制。方法随机选取子痫前期患者50例(轻度组20例,重度组30例)和正常妊娠孕妇50例(对照组),应用免疫组织化学法对3组胎盘Cx43的表达进行标记,通过彩色病理图像分析系统对染色结果进行定量检测并分析。结果 Cx43在子痫前期重度组表达低于轻度组及对照组,差异均有显著性意义(P<0.05);轻度组与对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。Cx43在胎盘组织的表达与妊娠期高血压疾病病情严重程度呈负相关(r=-0.370,P<0.05)。结论子痫前期患者胎盘组织中缝隙连接蛋白Cx43的表达变化可能与子痫前期的发病机制有关。