c-myb基因反义寡核苷酸对K562细胞作用的研究

为研究慢性髓细胞白血病(ＣＭＬ)反义核酸的治疗效果,我们以ＣＭＬ细胞株Ｋ562为实验对象,研究ｃｍｙｂ基因硫代磷酸反义寡聚脱氧核苷酸对Ｋ562细胞的作用,现将结果报告如下。材料和方法1　细胞株　Ｋ562细胞由福建省医学科学研究所提供。培养条件:含体积分数为15%灭活胎牛血清(Ｇｉｂｃｏ)及50ＩＵ/ｍｌ青霉素、50μｇ/ｍｌ链霉素的ＲＰＭＩ1640完全培养液(ｐＨ72～74),置37℃、体积分数为5%ＣＯ2、完全饱和湿度培养箱中培养。2　反义寡核苷酸的合成　反义寡聚脱氧核苷酸是由本所合成,为防核酸酶降解,采用二硫化四乙基秋兰姆(ｔｅｔｒａｅ…     

人类端粒酶逆转录酶基因反义核苷酸对白血病细胞端粒酶活性的影响

为了探讨人类端粒酶逆转录酶（hTERT)基因反义寡核苷酸（ASODN）对原代培养的急性髓性白血病（AML）和慢性髓性白血病（CML）细胞端粒酶活性的影响。采用间接免疫荧光标记方法，通过流式细胞术检测hTERT基因ASODN作用于AML和CML细胞后hTERT蛋白表达含量的变化。采用端粒酶聚合酶链反应-酶子弟免疫测定（PCR-ELISA0法检测白血病细胞端粒酶活性的改变。结果显示：hTERT ASODN作用于AML和CML细胞24，48和72小时后，hTERT蛋白表达水平不断降低；同时，AML和CML细胞端粒酶活性均逐渐受到抑制。结论：hTERT基因ASODN可以通过特异性地抑制AML和CML细胞hTERT蛋白的表达，抑制AML和CML细胞端粒酶的活性。     

生长抑素对K562细胞的调控作用

生长抑素是一类广泛存在于人体不同组织器官的多肽类激素,研究发现生长抑素及其类似物不仅能抑制多种激素的分泌,还能抑制神经内分泌肿瘤和普通实体肿瘤的增殖。本研究采用~3H—TdR掺入法和液体闪烁技术研究八肽生长抑素(奥曲肽,octreotide,SMS)对K_(562)细胞增殖的影响,以探讨生长抑素对白血病细胞的调控作用。     

K562细胞端粒酶非同位素标记检测方法的建立

目前国外检测端粒酶活性的端粒重复序列扩增方法（ＴＲＡＰ）多采用放射性同位素标记引物或底物，经ＰＣＲ扩增后行放射自显影，不仅费时，而且存在放射性同位素标记和放射性废物处理的问题。我们用Ｋ５６２细胞和人工合成的引物，经ＰＣＲ扩增后用特殊的荧光染料ＳＹＢＲ...     

急性白血病细胞端粒酶逆转录酶(hTERT) mRNA的表达及意义

为研究原代急性白血病 (AL)骨髓单个核细胞 (MNCs)端粒酶逆转录酶 (hTERT)mRNA表达及其意义 ,采用半定量RT PCR方法检测骨髓MNCshTERTmRNA表达 ,用TRAP PCR ELISA法检测骨髓MNCs端粒酶活性。结果发现 :30例初发AL患者骨髓MNCshTERTmRNA表达量 (0 .71± 0 .34)明显高于 12例AL获CR的患者 (0 .4 3± 0 .2 5 )及 6例正常志愿者 (0 .2 2± 0 .2 1)。 30例初发AL患者骨髓MNCs端粒酶活性 (0 .2 35± 0 .395 )明显高于 12例AL获CR的患者 (0 .0 12± 0 .0 15 )。初发AL患者骨髓MNCshTERTmRNA表达量与端粒酶活性呈正相关 (r=0 .4 2 1,P <0 .0 1)。初发AL患者骨髓液常规涂片中原始细胞百分率与骨髓MNCs的hTERTmRNA表达量和端粒酶活性均呈正相关 (r =0 .4 5 7,P<0 .0 5和r =0 .4 11,P <0 .0 5 )。结论 :初发AL患者骨髓MNCs的hTERTmRNA表达与端粒酶活性相关。推测hTERTmRNA表达可能代表白血病细胞的一种高增殖状态。     

c-cbl反义RNA抑制K562细胞的增殖

为探讨原癌基因c-cbl对CML细胞增殖的影响,我们用RT-PCR克隆了包括5′端非编码区的人类c-cbl基因部分序列,将之反向插入pcDNA3载体,并转染K562及NB4细胞。经MTT实验、半固体集落培养和流式细胞术观察细胞增殖能力的改变。结果表明,限制性酶切分析及序列测定证明所克隆的基因核苷酸序列正确,MTT实验显示反义载体转染K562细胞生长明显受抑,24、48及72小时增殖抑制率分别为30.07％,42.53％和55.75％(P值均<0.001),FCM-BrdU法测定的细胞倍增时间之比为1∶1.87(P<0.02),细胞集落形成抑制率为33.01％,反义转染基因NB4细胞增殖率无改变。上述结果直接地证明了c-cbl在CML细胞生长中的重要性。     

SCL基因反义寡核苷酸对K562和CEM细胞系的作用

干细胞白血病(SCL)基因是新发现的与白血病发生有关的癌基因。为进一步探讨SCL反义寡核苷酸对白血病细胞的作用，本研究应用SCL基因的反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(AS—PS—ODN)分别与K562和CEM白血病细胞系作用，观察细胞生长、分化、凋亡和SCL　mRNA变化。结果显示：(1)AS—PS—ODN对K562和CEM细胞的生长有不同程度的抑制作用，并呈量效和时效关系；(2)AS—PS—ODN作用后K562细胞联苯胺染色阳性率明显增加；(3)AS—PS—ODN作用后K562细胞发生凋亡现象，但未观察到CEM细胞凋亡；(4)AS—PS—ODN作用后K562细胞和CEM细胞SCL　mRNA表达水平减低，同时CEM细胞SIL－SCL　mRNA表达水平也减低。结论：AS—PS—ODN能特异性抑制K562和CEM细胞的增殖，减低SCL　mRNA和SIL—SCL　mRNA表达水平，同时促进红系分化，诱导K562细胞过早凋亡。     

小剂量雷公藤内酯醇对K562细胞端粒酶活性的影响

雷公藤内酯醇是从福建省泰宁县产的雷公藤根皮中分离提取的,经实验及临床Ⅰ、Ⅱ期研究发现对急性白血病有较好的疗效[1]。我们发现小剂量的雷公藤内酯醇对Ｋ562细胞的端粒酶有明显的影响,现报告如下。材料和方法1　细胞培养　2×105ｍｌＫ562细胞在含体积分数为10%胎牛血清的ＲＰＭＩ1640(Ｇｉｂｃｏ公司)培养基中,与1,3和6ｎｇｍｌ雷公藤内酯醇,在体积分数为5%的ＣＯ2、饱和湿度和37℃条件下培养72ｈ。2　端粒酶活性测定　按照Ｋｒｕｐｐ改良的荧光素标记的端粒重复扩增方法(ＴＲＡＰ)[2]进行半定量测定。2.1　细胞抽提物的制备:将培养72ｈ…     

反义Bmi-1对K562细胞增殖的抑制作用及机制探讨

目前已知Bmi-1对于正常和白血病造血干细胞的自我更新至关重要,而且在正常和白血病造血干/祖细胞增殖活性的调控中Bmi-1是一个最值得关注的基因[3,4].我们通过将反义Bmi-1表达载体用脂质体介导的基因转染法将其导入红白血病细胞系K562细胞中,观察其对K562细胞的体外增殖、细胞周期、P16蛋白及细胞凋亡的影响.探讨Bmi-1反义寡核苷酸抑制白血病细胞增殖的作用机制及在白血病基因治疗中的作用.     

苦参碱对K562细胞增殖与分化作用的机制研究

细胞反分化假说是目前在分子水平上关于肿瘤发生机制的主要学说之一。８０年代以来,肿瘤细胞的诱导分化治疗已成为肿瘤治疗的研究热点。全反式维甲酸的应用推动了国内外诱导分化研究的进展。苦参是我国常用的传统中药,近年来在传统研究基础上,对有效成分分离纯化、测定...     

端粒酶活性的抑制对顺铂诱导K562细胞凋亡的影响

目的 利用人类端粒酶逆转录酶（hTERT)基因反义寡核苷酸（ASODN）抑制K562细胞端粒酶活性后,探讨顺铂对K562细胞凋亡的影响。方法 采用聚合酶链反应－酶联免疫吸附法（PCR－ELISA）检测端粒酶活性的变化;以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化。琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的DNA断裂;用流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果 hTERT基因ASODN作用于K562细胞后,hTERT蛋白的表达水平及端粒酶活性下降;ASODN作用于K562细胞24h再加入顺铂作用72h,经琼脂糖凝胶电泳即可见到DNA梯形条带,而正义寡核苷酸（SODN）与顺铂联合作用组及单独应用顺铂均未见到明显的DNA梯形条带。hTERT基因ASODN作用于K562细胞24h,再加入5μmol/L顺铂作用48,72h的凋亡细胞百分率（17．43％和20．34％）分别与SODN联合顺铂作用组（7．43％和9．23％）、单用顺铂作用组（5．49％和7．34％）进行比较,差异有显著性（P＜0．01）。结论 以hTERT基因mRNA起始密码区为靶点的ASODN能特异性地抑制K562细胞的端粒酶活性;端粒酶活性的下调可促进顺铂诱导K562细胞凋亡。     

RNA干扰体外抑制肝癌细胞端粒逆转酶基因表达的研究

目的 利用小片段干扰RNA(siRNA)在肝癌细胞内诱导RNA干扰(RNAi)，抑制端粒逆转录酶(hTERT)基因表达，在体外进行RNAi对肝癌治疗的试验研究。方法 构建针对hTERT基因的siRNA(siRNA-hTERT)，转导入肝癌细胞7721，在瘤细胞内诱导RNAi，采用流式细胞分析、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法、免疫组化等技术检测siRNA处理前后细胞增殖及hTERT基因表达变化。结果 siRNA-hTERT对肝癌细胞生长抑制率达37．5％；细胞周期中S期细胞明显减少，G1／G0期细胞显著增加；hTERT基因的mRNA表达由99．4％下调到53．1％，其蛋白表达由86．3％下调到46．6％。结论 RNAi在体外明显抑制了肝癌细胞中hTERT基因的表达和瘤细胞增殖。     

放射性核素示踪技术检测端粒酶活性的研究进展

人端粒酶(telomerase)与人类的衰老与肿瘤发生密切联系;其主要组成成分之一——人端粒酶催化亚单位(hTERT)是端粒酶的限速亚单位,具有重要的临床应用价值与研究意义。检测端粒酶活性,尤其是hTERT活性,不仅有助于临床诊断肿瘤,而且对于进一步开展端粒酶研究具有重要作用。本文综述放射性核素示踪技术检测端粒酶活性的研究进展。     

AGL患者端粒酶亚单位hTERT、hTEP1的表达

目的 检测急性粒细胞性白血病(AGL)患端粒酶亚单位-人端粒酶逆转录酶(hTERT)和端粒酶相关蛋白1(hTEPl)的表达情况，并观察不同的亚单位在AGL发病中的作用。方法 采用RT-PCR法检测31例AGL首治患、24例AGE，复发患、21例AGL完全缓解期患以及18例健康体检外周血白细胞端粒酶亚单位hTERT，hTEPlmRNA。结果 AGL首治患、AGL复发患、AGL完全缓解期患以及健康体检hTERTmRNA的阳性率分别为80．6％、83．3％、9．5％和5．6％。所有标本hTEPlmRNA的阳性率为100．0％。结论 与hTEPl比较，hTERT表达的上调在AGL的发生与复发中具有更重要的作用，而且可用于监测治疗是否有效以及治疗后是否复发。     

hTERT反义寡核苷酸对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及端粒酶活性的影响

目的研究hTERT基因反义寡核苷酸(ASODN)对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长增殖及端粒酶活性的抑制作用,探讨其在瘢痕疙瘩治疗中的作用。方法应用ASODN封闭瘢痕疙瘩成纤维细胞hTERT基因的表达,不同浓度不同时间以ASODN作用于体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞,细胞计数和MTT法检测成纤维细胞生长增殖情况,端粒酶PCR-ELISA法检测不同处理浓度和时间成纤维细胞端粒酶活性。结果 ASODN作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞72h后,成纤维细胞生长受抑,增殖能力减弱,并具有浓度、时间依赖性。端粒酶活性检测显示:ASODN0.5、1.0和1.5μmol/L作用组OD450-690值分别为0.612±0.038、0.535±0.027、0.423±0.023,与空白对照组(0.898±0.058)比较,差异有统计学意义(P<0.05);正义寡核苷酸1.0μmol/L作用组(OD450-690值为0.893±0.042)与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 hTERT基因ASODN能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖,降低成纤维细胞端粒酶活性是其重要作用机制之一。通过抑制端粒酶活性进行抗瘢痕疙瘩治疗可能是一个新途径。     

硼替佐米对K562细胞增殖、凋亡及SHIP基因表达的影响

本研究旨在探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib)对K562细胞的增殖、凋亡及SHIP基因表达的影响。将不同浓度的硼替佐米作用于K562细胞,采用MTT法测定细胞增殖活性,用流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR方法检测SHIP mRNA表达。结果表明,硼替佐米10、20、50和100 nmol/L作用于K562细胞24 h,细胞增殖抑制率分别为(5.76±1.47)%、(10.55±1.59)%、(17.14±2.05)%和(27.69±3.57)%,空白对照组为(1.30±0.10)%;20nmol/L硼替佐米作用于K562细胞24、48、72 h,细胞增殖抑制率分别为(10.55±1.59)%、(16.33±2.53)%、(19.78±1.56)%,24 h组与48 h组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),10、20、50、100 nmol/L硼替佐米作用于K562细胞24h,Annexin V-FITC/PI双标法显示其凋亡率分别为(12.7±0.6)%、(26.9±0.9)%、(32.6±1.2)%、(72.5±1.5)%,均高于对照组(1.0±0.5)%(P<0.05)。RT-PCR法检测结果显示应用硼替佐米作用后SHIP mRNA表达上调明显,与空白对照组比较差异有统计学意义。结论:硼替佐米呈时间、浓度依赖性抑制K562细胞增殖,并能通过上调SHIP基因的表达诱导细胞凋亡。     

质粒介导RNAi靶向hTERT抑制K562细胞端粒酶活性的研究

本研究探讨质粒载体介导的RNAi靶向hTERT对白血病细胞株K562 hTERT基因封闭、端粒酶活性抑制的作用。针对hTERT mRNA化学合成3条siRNA链转染K562细胞,筛选2条高效特异的siRNA链,构建靶向hTERT mRNA的质粒载体pSUPER-U6-Kanr-hTERT-1、pSUPER-U6-Kanr-hTERT-2,在脂质体介导下转染K562细胞;48、72小时后分析靶基因hTERT mRNA的表达量,检测细胞端粒酶活性,同时检测细胞凋亡率。结果表明：3条siRNA链中,48小时目的基因表达抑制,但抑制率有差异,72小时后抑制作用渐消失;转染质粒pSUPER-U6-Kanr-hTERT-1（P-1组）、pSUPER-U6-Kanr-hTERT-2（P-2组）的K562细胞hTERT mRNA表达均下降,P-1组48小时时为0.39±0.13,72小时时为0.57±0.32,P-2组48小时时为0.55±0.20,72小时时为0.88±0.23;端粒酶活性P-1组48小时时为0.42±0.07,72小时时为0.31±0.08;P-2组48小时时为0.49±0.27,72小时时为0.39±0.03;两组均较阴性对照明显下降,且以P-1组作用明显。48小时细胞凋亡率P-1组为18.39±3.08%,P-2组为15.5±3.59%,与阴性对照组7.64±3.73%相比有显著性差异,72小时细胞凋亡率P-1组为13.2±1.18%、P-2组为12.86±3.09%,与阴性对照组8.07±0.19%相比无统计学差异。结论：靶向hTERT的RNAi可抑制目的基因hTERT mRNA表达,进而抑制端粒酶活性。此抑制作用与靶位点选择密切相关,实验中si-hTERT-1优于si-hTERT-2;si-hTERT-3几乎无作用。由质粒载体介导RNAi作用时间明显长于化学合成siRNA,前者72小时甚至更长,后者仅48小时。端粒酶活性被抑制后,48小时的细胞凋亡较对照组有所增加,72小时时与对照组无差别,推测端粒酶活性下调后部分细胞可能被诱导分化。     

切割bcr/abl核酶的逆转录病毒载体构建及其对K562细胞的影响

目的：研究ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因在慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）中的作用以及探索ＣＭＬ基因治疗的可能性。方法：合成针对ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因转录本ｂ３ａ２断裂点“锤头状”核酶的ｃＤＮＡ序列，定向克隆于逆转录病毒载体内，通过脂质体介导的ＤＮＡ转染法，将核酶基因导入Ｋ５６２细胞，并通过克隆分析法、流式细胞术（ＦＣＭ）、逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）、ＤＮＡ电泳及电镜观察等方法检测核酶对Ｋ５６２细胞的影响。结果：①核酶转染Ｋ５６２细胞后４８小时克隆形成抑制率达８５％；②细胞内Ｐ２１０蛋白合成受到明显抑制；③ＲＴＰＣＲ半定量检测ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ表达水平明显下降；④核酶处理组Ｋ５６２细胞发生凋亡，表现为：在ＦＣＭ图谱上可见明显的凋亡峰；ＤＮＡ电泳分析出现典型的梯状ＤＮＡ带；电镜观察呈现凋亡早期形态学改变。结论：核酶基因通过逆转录病毒载体导入Ｋ５６２细胞后可成功表达，使Ｋ５６２细胞ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ及Ｐ２１０蛋白表达水平下降，抑制Ｋ５６２细胞增殖，同时诱导Ｋ５６２细胞发生凋亡。     

硼替佐米对K562细胞增殖、凋亡及其对XIAP表达的影响

目的 研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomi)对白血病细胞株K562细胞的增殖、凋亡及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达的影响.方法 将不同浓度的硼替佐米作用于K562细胞,采用WST-1法测定细胞增殖活性,瑞特-吉姆萨染色观察细胞形态学变化,用流式细胞术、原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测细胞凋亡,RT-PCR法检测XIAP mRNA表达,SP免疫组化法检测XIAP蛋白的表达.结果 5、10、30、50、100 nmol/L硼替佐米作用于K562细胞24 h,细胞增殖抑制率分别为(13.6±0.2)%、(28.7±0.5)%、(55.4±1.1)%、(68.1±1.1)%、(81.4±0.1)%,空白对照组为(1.2±0.0)%(P＜0.05),24 h IC50值为24.6 nmol/L.30 nmoL/L硼替佐米作用于K562细胞12、24、36、48 h,细胞增殖抑制率分别为(29.1±0.9)%、(55.4±1.1)%、(57.8±0.8)%、(59.8±1.2)%,12 h组与24 h组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),但24 h组与36、48 h组比较差异有统计学意义(P＞0.05);30 nmol/L硼替佐米作用于K562细胞24 h,镜下可见细胞核固缩、核边集、核碎裂,胞质中见大量空泡及凋亡小体,对照组细胞形态正常.TUNEL检测法显示凋亡细胞阳性率为49.0%,空白对照组阳性率2.3%(P＜0.05).10、30、100 nmoL/L硼替佐米作用于K562细胞24 h,AnnexinⅤ-FTTC/PI双标法显示其凋亡率分别为(32.2±1.2)%、(53.9±1.3)%和(81.3±2.8)%,均高于对照组(0.3±0.6)%(P＜0.05).RT-PCR法检测结果显示随硼替佐米浓度增高,XIAP mRNA表达下调明显.免疫组化结果显示硼替佐米组XIAP蛋白表达下调,与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 硼替佐米呈时间、浓度依赖性抑制K562细胞增殖,并可能通过下调XIAP的表达诱导细胞凋亡.

Abstract：

Objective To investigate the effect of proteasome inhibitor bortezomib on proliferation,apoptosis of K562 cells and the expression of XIAP. Methods K562 cells were treated with bortezomib at different concentration. Cell proliferation was analyzed by WST-1 assay, cell apoptosis by flow cytometry and TUNEL, XIAP mRNA expression from 5 - 100 nmol/L by RT-PCR, and XIAP protein expression by SP immunohistochemistry. Results K562 cells were treated with bortezomib at different concentrations for 24 h respectively, the cells growth was significantly inhibited with inhibition rates from( 13.6 ±0.2)% to (81.4 ±0. 1 ) %, respectively, being markedly higher than that of control ( 1.2 ± 0. 1 ) % ( P ＜ 0. 05 ). IC50 was 24.6 nmol/L of bortezomib treated for 24 h. When K562 cells were treated with 30 nmol/L of bortezomib for 12 - 48 h, the inhibition rates were (29.1 ± 0. 9) % to (59.8 ± 1.2 ) %, respectively, the differences being statistically significant( P ＜0.05 ) between 12 h group and 24 h group, while there was no statistical difference between 24 h, 36 h and 48 h groups. K562 cells treated with 30 nmol/L bortezomib for 24 h showed nuclear condensation, nuclear margination, nuclear fragmentation, cytoplasmic vacuoles and a large number of apoptotic body formation. The apoptotic cells rate was 83.67% in bortezomib treated group, and 2.33% in untreated group (P ＜ 0.05 ). The expression of XIAP mRNA was decreased in a dose-dependent manner, and the expression of its protein was down-regulated. Conclusion Bortezomib can inhibit the proliferation of K562 cells, and induce apoptosis by down-regulating the expression of XIAP, providing the laboratory evidence for the targeted therapy in acute leukemia.