聚合酶链反应同时检测五种腹泻致病菌的初步研究

目的探索一种快速、经济、敏感的诊断方法，对常见的腹泻致病菌进行基因检测研究。方法建立一种快速标本处理和多重聚合酶链反应（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ）诊断方法，在一次ＰＣＲ反应中同时扩增５种菌的致病基因：志贺菌及侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒（ｉａｌ）基因、副溶血性弧菌的热稳定直接溶血素（ｔｄｈ）基因、Ｏ１群霍乱弧菌的霍乱毒素Ａ亚单位（ｃｔｘＡ）基因和产不耐热肠毒素大肠埃希菌的不耐热肠毒素Ｂ亚单位（ＬＴ－Ｂ）基因。扩增产物经电泳，出现与已知阳性对照细菌条带大小一致的条带即判断为该标本阳性。结果对一组常规培养生化鉴定法诊断为霍乱的２６份腹泻患者标本检测后，ＰＣＲ法有２４份检测到ｃｔｘＡ基因，ＰＣＲ阴性的２份为非Ｏ１群；另一组５６份粪标本分别检测到了ｉａｌ、ｔｄｈ、ＬＴ－Ｂ基因，ＰＣＲ法较培养法阳性率高。结论该方法具有简便、快速、特异、经济和不需培养等特点，适于临床应用。     

应用增强化学发光法分型检测肠毒素大肠埃希菌

应用增强化学发光法分型检测肠毒素大肠埃希菌蔡庆朱美财王蔚陈友纯肠毒素大肠埃希菌（ＥＴＥＣ）是引起人畜急性感染性腹泻的重要病原体。与人类腹泻密切相关的是不耐热肠毒素ｈ（ＬＴｈ）、耐热肠毒素Ⅰｂ（ＳＴⅠｂ）及耐热肠毒素Ⅰａ（ＳＴⅠａ）三种肠毒素菌株。我们...     

多重PCR快速检测3种致泻性大肠埃希菌方法的建立

目的利用多重聚合酶链反应(PCR)技术,建立一种可以同时快速检测肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR方法。方法根据EPEC的eae基因、EIEC的ipaH基因、EHEC的stx1基因筛选设计引物,建立多重PCR检测体系,并对PCR反应体系和条件进行优化。结果设计的3对PCR引物均能特异地扩增出相应的目的基因,该多重PCR体系能同时检测3种目的菌,特异度强。结论初步建立了一种能够同时快速检测3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR检测方法,可用于食品安全及食物中毒事件的快速筛查。     

PC检测志贺菌和侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒抗原H基因

目的 建立一种志贺菌和侵袭性大肠埃希菌的PCR诊断方法。方法 根据志贺菌和侵袭怀大肠埃希菌的侵袭性质短抗原H（ipaH）基因序列，设计一对引物，优化各种工作条件，建立一种PCR诊断方法。结果 本法特异性好，敏感性可达10CFU，整修实验过程在6－7h内完成。结论 建立的方法在理论和实际应用上都有优越性，可用于临床诊断。     

PCR检测志贺菌和侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒抗原H基因

目的　建立一种志贺菌和侵袭性大肠埃希菌的PCR诊断方法。方法　根据志贺菌和侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒抗原H(ipaH)基因序列 ,设计一对引物 ,优化各种工作条件 ,建立一种PCR诊断方法。结果　本法特异性好 ,敏感性可达 10CFU ,整个实验过程在 6～ 7h内完成。结论　建立的方法在理论和实际应用上都有优越性 ,可用于临床诊断     

肠聚集大肠埃希菌在瑞士腹泻和无腹泻儿童中的流行[英]／Pabst WL，Altwegg M，Kind C，et al．／／Journal of Clinical Microbiology

引起腹泻的大肠埃希菌可分为6种，包括肠聚集大肠埃希菌(enteroadherent estherichia coli，EAEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)、肠致病性大肠埃希菌(enterophathogenic escherichia coli，EPEC)、肠产毒性大肠埃希菌(enterotoxin of escherichia coli，ETEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(enteroinvasive escherichia coli，EIEC)和弥散性粘附大肠埃希菌。EAEC作为儿童腹泻源的重要性仍有争论，     

鉴定大肠埃希菌O157:H7的表型特征探讨

目的探讨大肠埃希菌O157:H7特有的表型特征并应用于鉴定。方法用4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)和山梨醇试验鉴别3株大肠埃希菌O157:H7标准菌株以及大肠埃希菌ATCC 25922(ATCC 25922)、侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)和肠聚集性大肠埃希菌(EAEC),并用全自动微生物鉴定系统VITEK 2-compact等自动化仪器及血清学做进一步鉴定,对健康体检者粪便中检出的大肠埃希菌也进行了鉴定。结果 3株大肠埃希菌O157:H7的MUG和山梨醇均阴性,EPEC O111的MUG阳性、山梨醇阴性,其他大肠埃希菌的MUG和山梨醇均阳性。来自粪便的357株大肠埃希菌中,检出MUG阴性或山梨醇阴性及MUG和山梨醇均为阴性的大肠埃希菌95株。大肠埃希菌O157:H7被VITEK 2-Compact明确筛查出来。仅大肠埃希菌O157:H7与O157血清凝集,试验的其他大肠埃希菌及粪便中的95株大肠埃希菌全部不与O157血清凝集。ATB半自动微生物仪及基质辅助激光解吸-飞行时间质谱仪(VITEK MS)不能鉴定大肠埃希菌O157:H7。结论 MUG和山梨醇发酵试验联合应用,对大肠埃希菌O157:H7有较高的筛查准确率,效果优于其他方法,但必须经血清学鉴定。     

一种鉴别与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌的PCR方法

目的利用基于O抗原翻转酶wzx基因的PCR方法,鉴别与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌和O157大肠埃希菌。方法用微生物鉴定仪对细菌进行生化鉴定,与O157血清凝集,同时扩增wzx基因。结果25株与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌及1株不与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌wzx基因扩增为阳性,8株与O157血清不凝集的弗氏枸橼酸杆菌wzx基因扩增为阴性,20株O157∶H7大肠埃希菌wzx基因扩增为阴性。结论对于可与O157血清发生强凝集的弗氏枸橼酸杆菌,基于O抗原翻转酶wzx基因的PCR方法是一种有效的快速鉴别方法。     

长沙市食品从业人员致泻大肠埃希菌实时荧光多重PCR检测结果分析

目的了解长沙市食品从业人员致泻大肠埃希菌感染、分布及毒力基因携带情况。方法抽取长沙市9个单位258例食品从业人员为研究对象,采用实时荧光多重聚合酶链反应(PCR)检测致泻大肠埃希菌。结果致泻大肠埃希菌感染率为15.5%(40/258),其中肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)占10.9%(28/258),肠致病性大肠埃希菌(EPEC)占3.1%(8/258),肠出血性大肠埃希菌(EHEC)占1.6%(4/258),未检出肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)和肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)。28株EAEC携带uidA基因26株,aggR+pic基因13株,astA基因27株,携带率分别为92.9%、46.4%、96.4%;8株EPEC全部携带eae和uidA基因;4株EHEC中3株携带eae基因,且都携带stx1+stx2基因。结论建立持续监测致泻大肠埃希菌的机制和深入研究其分子流行病学理论,除了为监管部门制订和评价公共卫生措施提供基础数据,对评价食品安全状况,有效控制传染源、保护人民群众健康具有重要意义。     

平板免疫溶血法与ELISA法测定肠毒素的比较

目前，测定产不耐热肠毒素（LT）大肠埃希菌大都采用平析免疫溶血法，我们于1994年7~10月对214例腹泻病人粪便中分离的346株大肠埃菌采用此法，并同时用ELISA法对照测定LT，现总结如下：材料和方法1．LT抗血清购自卫生部生物制品鉴定所，平板免疫溶血法按文献操作。2．ELISA（LT）试剂盒由上海卫生防疫站生产，按说明操作。3．阳性质控菌株LT29，由山东省卫生防疫站菌种室惠赠。大肠O14菌株（阴性对照）购于卫生部生物鉴定所。结果见附表。讨论平板免疫溶血法测定不耐热肠毒素（LT）已在我们实验室应用多年，使腹泻菌阳性检出率有…     

应用ELISA法对腹泻病人大肠埃希氏菌ST和LT肠毒素的检测

产肠毒素大肠埃希氏菌,是引起类似霍乱的急性腹泻病原菌,产生与霍乱相似的肠毒素,称为不耐热肠毒素 LT,或耐热性肠毒素 ST,有的菌株可同时产生这两类肠毒素。其诊断方法主要靠产肠毒素 LT 和 ST 试验来证实,国内目前多以双向琼脂扩散试验测定 LT,以乳鼠灌胃试验测定 ST,亦有采用家兔结扎回肠段试验测定 LT 和 ST,但ST 检测仍无快速准确的好方法。1991年我们采用上海市防疫站,中国腹泻病试制研究中心研制的 ETEC,ELISA 试剂盒检测 LT和 ST,结果报告如下。     

大肠埃希菌和克雷伯菌临床分离株中整合子介导的多重耐药性的相关性分析Ⅰ

目的研究整合子介导的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的多重耐药性。方法采用聚合酶链反应（PCR）对临床分离的135株大肠埃希菌和59株克雷伯菌进行Ⅰ型和Ⅱ型整合酶基因的检测。结果在135株大肠埃希菌和59株克雷伯菌中，大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）率为50．4％，克雷伯菌产ESBLs率为37.3％，共检出105株细菌携带Ⅰ类整合酶基因，72株为大肠埃希菌，占53.33％（72／135），33株肺炎克雷伯菌，占55.93％（33／59）；其中携带Ⅱ类整合酶基因3株，全部为大肠埃希菌，此3株同时携带Ⅰ类整合酶基因并产ESBLs。结论Ⅰ类整合子在大肠埃希菌和克雷伯菌中分布广泛。整合子与大肠埃希菌和克雷伯菌的耐药有关，即整合子阳性菌比整合子阴性菌更容易产生耐药。     

肠聚集大肠埃希菌在瑞士腹泻和无腹泻儿童中的流行

引起腹泻的大肠埃希菌可分为6种,包括肠聚集大肠埃希菌(enteroadherent escherichia coli,EAEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)、肠致病性大肠埃希菌( enterophathogenic esche richia coli,EPEC)、肠产毒性大肠埃希菌(enterotoxin of esche richia coli,ETEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(enteroinvasive esche richia coli,EIEC)和弥散性粘附大肠埃希菌。EAEC作为儿童腹泻源的重要性仍有争论,本文采用 PCR方法检测 EAEC的质粒 pCVD432,从而判定EAEC在瑞士腹泻儿童中的重要性。1.资料与方法:用标准的培养方法和 PCR方法测定 Zu…     

多重实时PCR检测致泻性大肠埃希菌志贺毒素和紧密素基因

目的 建立多重实时PCR检测志贺毒素（stx1、stx2）基因和紧密素基因（eae）的方法。方法 优化多重实时PCR反应条件，检测系列稀释的阳性菌DNA提取物及纯化阳性质粒。检测42株携带已知毒力基因的大肠埃希菌株，并比较其阳性和阴性符合率。对比3种粪便样品处理和DNA提取方法，选出最适方法。同时用该方法对36份腹泻患者粪便标本进行直接检测且对阳性标本进行菌株分离和鉴定。结果 多重实时PCR方法最低可以检测到10^1拷贝／pJ的毒力基因和10。CFU／p．1的DEL933大肠埃希菌。检测42株携带已知毒力基因的大肠埃希菌的阳性和阴性符合率均为100％。粪便样品的DNA提取以BP肉汤增菌6h后煮沸提取效果最好。36份腹泻患者粪便中2份eae阳性，均鉴定为大肠埃希菌。结论 建立的同时检测stx1、stx2、eae基因的多重实时PCR方法，具有较高的敏感性，可用于产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）和肠致病性大肠埃希菌（EPEC）毒力基因鉴定及临床腹泻粪便标本的快速筛检。     

聚合酶链反应检测出血性大肠埃希菌

为建立一种针对出血性大肠埃希菌的特异性聚合酶链反应（ＰＣＲ）诊断方法，根据Ｏ１５７：Ｈ７血清型大肠埃希菌ｈｌｙＡＢ基因的ＤＮＡ序列，设计８个引物，使用３２株Ｏ１５７：Ｈ７血清型。结果表明，引物ＲＨ２８－ＲＨ３０和ＲＨ２６－ＲＨ３１敏感性和特异性好，达１００％。ＲＨ２６－ＲＨ３１产物的分子量较大，为２ｋｂ。ＲＨ２８－ＲＨ３０的产物为３３８ｂｐ，比较适合检验使用。研究还发现，使用煮沸法制备ＰＣＲ模板，方法简便、快速、实用，且对ＰＣＲ反应的特异性和敏感性无影响。ｈｌｙＡＢ基因片段作为出血性大肠埃希菌ＤＮＡ探针的特异性和敏感性是明显的，且实用性好。根据出血性大肠埃希菌独特的ｈｌｙＡＢ基因序列设计的ＰＣＲ引物，在理论和实际应用方面均有其优越性。     

多重PCR方法鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌

目的 建立一种快速检测和鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法。方法 根据六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的毒力基因eae、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、aggR、ipaH、afaD及16S rRNA基因rrs建立多重PCR反应体系,优化引物浓度、PCR反应条件等,评价该方法的特异性和灵敏度,并用该方法鉴定本实验室保存的174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌,将结果与单重PCR、本实验室已建立的鉴定五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法结果进行对比。结果 10对PCR引物均可特异性扩增相应基因片段。该反应体系对174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌的鉴定结果与单重PCR检测结果一致,本研究的多重PCR检测下限可达4.56 101 CFU/反应(1.14 104 CFU/ml)。结论 本研究采用毒力基因及内参照基因建立的多重PCR方法可在一个反应体系中鉴定和区分致泻性大肠埃希菌和志贺菌,为临床快速检测、疾病预防控制实验室筛查、腹泻的暴发溯源等提供了方便快捷的技术支持。     

尿液中大肠埃希菌实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

目的建立实时荧光定量聚合酶链反应（RQ—PCR）检测大肠埃希菌的方法,检测泌尿道感染患者尿液样本,评估应用RQ-PCR法在检测大肠埃希菌尿路感染的意义。方法选择大肠埃希菌β-右旋半乳糖苷酶基因作为检测靶基因设计引物,建立SYBRGREENIRQ—PCR检测体系。结果引物特异性好,标准曲线相关系数在0．990～0．996之间。熔解曲线显示产物特异性较强,无非目的条带和二聚体产生。在最低检测限（10^2拷贝／止）以上,能对大肠埃希菌样本进行检测,且重复性好。结论RQ—PCR是一种快速、敏感、特异、重复性好的定量检测大肠埃希菌质粒DNA方法,可用于定量检测临床患者尿液样本中大肠埃希菌含量。     

1株与志贺氏菌生化相似、抗原相同的大肠埃希氏菌

目的为正确鉴定肠侵袭型大肠埃希氏菌与志贺菌提供参考。方法对采集到的1份感染性腹泻标本进行致病菌分离,对初步鉴定为志贺氏菌的可疑菌进行进一步生化鉴别试验及血清学诊断试验。结果检出1株一般生化特性符合志贺氏菌,并与其诊断血清发生交叉凝集反应的肠侵袭型大肠埃希氏菌。结论肠侵袭型大肠埃希氏菌与志贺氏菌有极其相似的生化特征,相同的抗原成分,在分离志贺氏菌时,为避免鉴定错误应当使用最经典可靠的生化试验方法,以确保菌株鉴定的准确性。     

肠道病原性大肠埃希氏杆菌新的诊断试验

肠道病原性大肠埃希氏杆菌(EPEC)仍然是发展中国家许多地方婴幼儿胃肠炎的一种重要病因。EPEC 被称为引起腹泻的大肠埃希氏杆菌,它属于流行病学的血清型,但其致病机制尚不清楚,认为它是不耐热或耐热的肠毒素,或者具有类似志贺氏菌属的侵袭力。EPEC 诊断试验耗时、价昂、敏感度也不是100%。DNA 探针虽然可用于检测EPEC粘附因子,但不能识别所有的EPEC 菌株。EPEC 粘附于肠粘膜,在刷状缘微纤毛膜上产生一种特有的“附着和脱落”性损伤,这种损伤具有微纤毛损坏和有细菌的粘附以致形成肠细胞膜上的杯状突起,它与微纤毛的稠密聚集有关。这种现象可在活体内EPEC 粘附时及体外组织培养细胞中见到,真到现在,这种损伤只可在电镜下发现。     

2015~2019年北京市海淀区食源性腹泻患者致泻大肠埃希氏菌型别分布和耐药性分析

目的　分析北京市海淀区食源性腹泻患者致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenic Escherichia coli,DEC)的感染状况、型别分布和耐药情况,为致泻大肠埃希氏菌的防控和临床合理用药提供科学依据。方法　对2015~2019年海淀区食源性疾病监测哨点医院送检的1 810份腹泻患者粪便标本直接划线接种在麦康凯培养基上培养,挑取可疑菌落进行生化鉴定、毒力基因测定,对确认为致泻大肠埃希氏菌的菌株进行药敏检测。结果　1 810份粪便标本中检出致泻大肠埃希氏菌214株,检出率为11.8%,各年度的检出率差异有统计学意义（χ2=10.858,P=0.028）。检出的致泻大肠埃希氏菌共有4种型别,其中集聚性大肠埃希氏菌（EAEC）96株（44.9%）,产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）89株（41.6%）,肠道致病性大肠埃希氏菌（EPEC）24株（11.2%）,肠道侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）5株（2.3%）。在12种抗生素的药敏试验中,70株（32.7%）全部敏感,144株（67.3%）耐药;氨苄西林的耐药率最高（54.7%）,其次是四环素（38.8%）和复方磺胺（36.9%）,对3种及以上抗生素的多重耐药率为46.3%。结论　北京市海淀区2015~2019年致泻大肠埃希氏菌感染以EAEC和ETEC为主,耐药菌株的多重耐药谱广。应加强对抗生素的使用管理,延缓耐药株的产生和传播。