鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原基因的分子克隆与基因 …

从我国华中、华东、华南、华北、东北及西北等地分离鸡传染性支气管炎病毒流行株，经病毒的病原性、形态结构、理化特性、病毒抗原的特异性检测、有组织嗜性、结构多肽及血清型分析等多方面的鉴定，对来源于我国不同地区的流行毒株免疫原Ｓ１基因进行了分子克隆及基因分型；ＲＴ－ＰＣＲ扩增病毒Ｓ１基因，将Ｓ１基因５’和３‘端分别进行分子修饰之后插入克隆载体ｐＵＣ１８的ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄⅢ位眯，在Ｅｃｏｌｉ中实现了目的     

鸡干扰素基因的分子克隆与序列测定

目的：从接种新城疫Ｆ４８Ｅ９病毒的Ｌａ Ｓｏｔａ疫苗免疫鸡体外有丝分裂原刺激的脾淋巴细胞中克隆鸡干扰素基因。方法：应用逆转录多聚酶链式反应技术扩增,常规平端连接、转化及序列测定技术进行验证。结果：研究表明克隆得到的基因与国外报道的鸡胚成纤维细胞干扰素基因。结论：鸡在该状态下其脾淋巴细胞表达鸡胚成纤维细胞干扰素ｍＲＮＡ。     

番鸭细小病毒免疫原蛋白基因的序列测定与分析

番鸭细小病毒 (ＭｕｓｃｏｖｙｄｕｃｋｐａｒｖｏｖｉｒｕｓＭＤＰＶ)病是近十年来在我国华南、华东等地饲养的番鸭中普遍流行的一种急性传染病。该病毒的基因组有两个阅读框架 ,左阅读框主要编码病毒的非结构蛋白 ;而右阅读框主要编码病毒结构蛋白。其中ＶＰ2结构蛋白具有免疫原性 ,是病毒刺激机体产生保护性抗体的重要抗原蛋白。此外 ,有研究报道 ,细小病毒具有肯定的抑瘤活性。其对人类的多种转化细胞和癌细胞有选择性地杀伤作用 ,而对正常的细胞无可检测的影响。这意味着通过在分子水平上对细小病毒的深入研究 ,将有可能为人类癌症疾病…     

鸡贫血病毒VP2基因的克隆、序列分析及表达

目的：为探讨鸡贫血病毒的分子生物学特征。方法：采用ＰＣＲ方法获得允许贫血病毒的ＶＰ２基因,采用平端连接将其克隆到ＰＵＣ１１９载体上进行测序,采用粘端连接将其亚克隆到ＰＥＴ载体上并进行原核表达。结果：发现ＣＡＶ－ＳＪ１株的ＶＰ２基因共有６５１个碱基,同围外ＴＫ５８０３,２６Ｐ４,Ｃｕｓ－１、８２０２毒株的ＶＰ２基因相比分别有６、７、８、７个碱基的差别,其中３个是ＳＪ１株特有的碱基变化。由基因序列推导     

HIV-1型中国株E、B亚型gag基因的克隆与表达

目的 克隆和表达人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）Ⅰ型中国株Ｅ、Ｂ亚型代表株的结构基因ｇａｇ。方法 在分子流行病学调查的基础上，选择１份经部分ｇｐ１２０基因测序判定为Ｅ亚型和１份经部分ｇｐ１２０基因测序判定为Ｂ亚型的代表性样品。利用套式聚合酶链反应（ＰＣＲ），扩增外周血中的前病毒。获得了结构基因ｇａｇ全长片断，并先后克隆到ｐｌｉｎ８Ｐｒ５５和ｐＦａｓｔＢａｃｌ载体中，我们首次克隆到全长的中国株Ｅ亚型ｇａｇ基     

武汉市新分离2株乙型脑炎病毒E基因分型及序列分析

目的 对2009年武汉市新分离的2株乙型脑炎（简称乙脑）病毒进行基因分型和序列分析,了解本地乙脑病毒株的分子生物学特性。方法 将2009年从三带喙库蚊中分离的两株乙型脑炎病毒用RT-PCR法扩增E基因,将其进行测序,并用DNAstar and MegAlign软件与其他基因型代表株进行比对。结果 16组样品检出两株阳性（WHJX9-09、WHJX10-09）,这两株阳性均属于GI型。两株新分离JEV之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.9％和100％。同目前在武汉市使用的疫苗株SA-14-14-2相比,核苷酸同源性分别为87.4％、87.9％,氨基酸同源性为96.9％。共有15个氨基酸发生变异分布在3个不同结构域,中和位点没有变异但是神经毒力位点仍然存在。结论 武汉市本地新分离乙脑病毒基因型为GI型,不同于1988年在武汉检出的GⅢ型的基因型,和疫苗株SA-14-14-2相比,其神经毒力并没有减弱,但疫苗产生的抗体对新出现的GI型乙脑病毒仍有中和作用。因此提高乙脑疫苗的接种率并配合防蚊灭蚊措施对控制乙脑疫情依然至关重要。同时有必要对本市蚊虫及乙脑患者进行长期的病原学监测工作,为乙脑预测预警体系的建立提供科学依据。     

中国狂犬病毒设苗株（5aG株）糖基因的克隆与序列分析

用逆转录－聚合酶链反应方法从中国犬疫苗株病毒感染细胞中扩增得到该株病毒糖蛋白基因，并进行序列测定。结果表明该基因开放阅读框架全长１５７５ｂｐ，编码５０５个氨基酸的成熟糖Ｎ－端１９个氨基酸的信号肽，该基因与其他株系相应基因比较，核酸序列同源性为８８％－９１％，氨基酸序列同源性为８７－９０％，其中膜外区同源性高于膜内区及跨膜区同源性。     

人CD28基因的分子克隆及其痘苗病毒载体介导的真…

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从人Ｊｕｒｋａｔ细胞克隆了ＣＤ２８ ｃＤＮＡ，将ＣＤ２８全编码区基因片段重组入ＰＵＣ质粒，测序证实所获得的为人ＣＤ２８基因。以痘苗病毒天坛株国载体，构建表达人ＣＤ２８的重组痘苗病毒株，并在重组病毒感染的细胞膜上表达人ＣＤ２８膜抗原，拟用该抗原免疫小鼠以制备抗ＣＤ２８的抗体。     

恙虫病立克次体sta58主要抗原基因片段的克隆及表达

作者设计合成一对ＤＮＡ引物，经ＰＣＲ扩增出Ｋａｒｐ及ＣＭＹ株恙虫病立克次体ｓｔａ５８主要抗原基因片段，分别建立其无性繁殖系，构建了表达质粒ｐＢＶＲＫ５和ｐＢＶＲＣ４５，在国内首次应用大肠杆菌成功表达了恙虫病立克次体抗原。其意义在于为我国恙虫病立克次体研究提供特异性核酸探针，为恙虫病基因工程诊断试剂的研制奠定物质基础。     

一个新的蛋白激酶基因DYRK3的克隆及其特征分析

目的分离一个与人的蛋白激酶ＤＹＲＫ２高度同源新的蛋白激酶的全长ｃＤＮＡ，并推测其分类和功能。方法应用与人的蛋白激酶ＤＹＲＫ２高度同源的３′端部分ｃＤＮＡ序列为探针，筛选ｃＤＮＡ文库和ｇＤＮＡ文库，并进行氨基酸序列同源性分析和ＦＩＳＨ定位。结果从人的骨骼肌ｃＤＮＡ文库和睾丸ｃＤ－ＮＡ文库各分离到一个新的蛋白激酶的全长ｃＤＮＡ。骨骼肌来源的ｃＤＮＡ编码５８８个氨基酸的蛋白质，睾丸来源的ｃＤＮＡ编码５６８个氨基酸的蛋白质，前者第２７个氨基酸以后的序列与后者第７个氨基酸以后的序列完全一致。结论推测这两个ｃＤＮＡ是同一基因在骨骼肌组织和睾丸组织中的不同剪接本。由于该基因与人的ＤＹＲＫ２高度同源，故称之为ＤＹＲＫ３基因。ＤＹＲＫ３与丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶酵母Ｙａｋ１，人和果蝇的Ｍｎｂ，人的Ｃｌｋ１等有较高的同源性，也与人的Ｃｄｋ２等其它丝氨酸／苏氨酸激酶有同源性。作者认为ＤＹＲＫ３是属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶ＣＭＧＣ组Ｃｌｋ家族新的一员。该基因定位在１ｑ３２。     

人神经营养素-4成熟蛋白基因克隆

本研究的目的是克隆人神经营养素-4成熟蛋白基因(mhNT-4)并进行序列分析。应用PCR技术,以正常人血淋巴细胞染色体DNA为模板,扩增出人神经营养素-4(hNT-4)成熟蛋白编码基因。将所得基因片段重组于pGEM-T Easy质粒,筛选得到含人mhNT-4基因的阳性克隆。采用Sanger单链末端终止法测出全部的核苷酸序列。所得到的序列与国外文献所报道的结果(GenBank,M86528)完全相同。mhNT-4成熟蛋白基因的成功克隆,为研究其在原核细胞中的表达提供了有利条件。本文结果也提示不同人种间及不同个体间hNT-4成熟蛋白基因是相对保守的。     

人BDNF成熟肽基因克隆及序列分析(英文)

为研究人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的表达及其在治疗 Alzheimer病中的作用 ,本文作者等克隆了其成熟肽基因并进行了序列分析。提取健康成人末梢血白细胞基因组 DNA作为模板 ,应用 PCR技术扩增人脑源性神经营养因子成熟肽基因片段 ,并将其插入 p GEM-T质粒。限制性内切酶鉴定重组质粒并进行序列测定和分析。与 Gen Bank提供的已知序列(M61181)比较 ,所克隆的人脑源性神经营养因子成熟肽基因片段长 3 5 7bp,序列完全相同。人脑源性神经营养因子成熟肽基因的克隆 ,为其在原核细胞中的表达、抗体的制备及神经系统疾病的治疗奠定了基础     

大鼠FEZ1基因的克隆及其在中枢神经系统的表达

轴突成束和延伸蛋白ζ-1(fasciculationandelongationproteinzeta-1,FEZ1),是线虫UNC-76蛋白在哺乳动物中的一种同系物,与轴突向外生长、成束、延伸相关。为了克隆该蛋白的基因并观察其在中枢神经系统(CNS)的表达情况,本研究通过FEZ1的特异引物从SD大鼠脑组织中经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得FEZ1基因;通过RT-PCR法分析FEZ1在生后7d的SD大鼠CNS的不同部位(大脑皮层、嗅球、脊髓)的表达情况。成功获得FEZ1的基因克隆,并观察到生后7d的SD大鼠的大脑皮层、嗅球、脊髓内均有FEZ1表达,且脊髓的表达水平较高。本研究结果为进一步研究大鼠FEZ1基因的生物学活性及在神经系统内的表达和应用奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒G基因的扩增

用未纯化的呼吸道合胞病毒细胞混和物，采用改良胍－热酚法提取病毒ｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增得到大小约９２０ｂｐ的产物。经ＰｓｔＩ酶切表明其中含有ＰｓｔＩ酶切应点，证实其产物确为ＲＳＶＧ基因。此法简便、特异、第三、快速、。由于ＲＳＶ极不稳定，ＲＮＡ甚易降解，此法值得推广应用。     

阴道毛滴虫黏附蛋白ap33基因克隆及其表达

通过提取阴道毛滴虫mRNA ,逆转录合成cDNA ,PCR得到预期长度片段后 ,将其克隆到pUCm-T载体中进行PCR、酶切及测序分析 ,并与GeneBank中核苷酸序列进行同源性分析。再将其克隆至表达载体PET-32a。重组子用酶切、PCR和测序鉴定后 ,转化大肠杆菌并以异丙基 -B- D- 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达。从阴道毛滴虫临床分离株中扩增出 92 7bp的ap33的基因片段 ,构建重组质粒PET- 32a (+) - ap33;IPTG诱导后 ,SDS -PAGE显示表达产物的大小约 5 0kDa。     

EPSTEIN–BARR VIRUS (EBV) INFECTION IN INFECTIOUS MONONUCLEOSIS: VIRUS LATENCY,REPLICATION AND PHENOTYPE OF EBV-INFECTED CELLS

Primary Epstein–Barr virus (EBV) infection may manifest itself as a benign lymphoproliferative disorder, infectious mononucleosis (IM). EBV infection has been characterized in lymphoreticular tissues from nine patients with IM using the abundantly expressed EBV-encoded nuclear RNAs (EBERs) as a marker of latent infection. Expression of the virus-encoded nuclear antigen (EBNA) 2 and of the latent membrane protein (LMP) 1 was seen in variable proportions of cells in all cases. Double labelling revealed heterogeneous expression patterns of these proteins. Thus, in addition to cells revealing phenotypes consistent with latencies I (EBNA2⁻/LMP1⁻) and III (EBNA2⁺/LMP1⁺), cells displaying a latency II pattern (EBNA2⁻/LMP1⁺) were observed. Cells expressing EBNA2 but not LMP1 were also detected; whilst this may represent a transitory phenomenon, the exact significance of this observation is at present uncertain. EBER-specific in situ hybridization in conjunction with immunohistochemistry revealed expression of the EBERs mainly in B-lymphocytes, many of which showed features of plasma cell differentiation. By contrast, convincing evidence of latent EBV infection was not found in T-cells, epithelial or endothelial cells. Double-labelling immunohistochemistry revealed expression of the replication-associated BZLF1 protein in small lymphoid cells, often showing plasmacytoid differentiation. There was no unambiguous expression of this protein in other cell types. These results suggest that B-cells are the primary target of EBV infection and that plasma cells may be a source of infectious virus found in the saliva of IM patients. © 1997 John Wiley & Sons, Ltd.     

大鼠Desert Hedgehog基因的克隆和表达

目的克隆大鼠Desert Hedgehog（DHH）基因,构建其真核表达载体并转染TP67细胞;同时制备DHHcRNA正义及反义探针用于检测其在细胞中的表达。方法提取SD大鼠睾丸总RNA,RT-PCR法扩增DHHcDNA片段,连接于pGEM—TEasy载体,经测序后构建真核表达载体pLXSN／DHH并转染PT67细胞;重组质粒经限制性内切酶NotⅠ和NcoⅠ酶切、回收后,进行转录标记反应,原位杂交检测DHH在嘶7细胞中的表达。结果RT-PCR扩增得到1220bp的片段;成功构建了真核表达载体pLXSN／DHH;制备DHH正义及反义探针浓度分别为150mg／L和80mg／L;DHH在PT67细胞中有表达。结论克隆的DHH基因与大鼠Sertoli细胞的DHH基因相同,成功标记了特异、敏感的DHHcRNA探针,转染的DHH基因能够在PT67细胞中表达。     

B7—1（CD80）基因的克隆及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人Ｂ淋巴瘤细胞系Ｒａｊｉ中克隆到Ｂ７－１（ＣＤ８０）ｃＤＮＡ，并经测序证实，将其插入至真核表达载体ｐＬＸＳＮ中，用脂质体转染小鼠黑色素瘤细胞Ｂ１６，Ｇ４１８筛选，并经流式细胞仪检测，得到了细胞表面表达Ｂ７－１的重组克隆。ＰＣＲ从其基因组ＤＮＡ中扩增到Ｂ７－１基因，提示Ｂ７－１ ｃＤＮＡ已整合至宿主细胞的基因组ＤＮＡ中，本文为研究Ｂ７－１在肿瘤免疫中所起的作用奠定了基础。