耐青霉素肺炎链球菌的蛋白质组学研究

目的：观察耐青霉素肺炎链球菌异常蛋白表达,探讨其蛋白组学差异与耐青霉素的关系。方法采用次抑菌浓度法将肺炎链球菌国际标准菌株诱导为耐青霉素肺炎链球菌株;双向电泳分离肺炎链球菌标准株和诱导耐药株的全菌蛋白质;Image Master 2D Platinum 5.0软件对电泳图谱进行分析,寻找表达差异蛋白点;对差异蛋白点进行质谱分析。结果成功诱导耐青霉素肺炎链球菌,并建立肺炎链球菌标准株和耐药株的全菌蛋白双向电泳图谱。标准株和耐药株分别分离出约320,350个蛋白点,发现10个差异蛋白。与标准株比较,ABC转运器、触发因子、DNA聚合酶Ⅲ、氨基酸ABC转运和SP表面蛋白A表达量上调,分子伴侣、脂蛋白、果糖二磷酸醛缩酶、α-烯醇化酶和假想蛋白表达量下调。结论耐青霉素肺炎链球菌蛋白表达异常导致的蛋白组学改变可为深入探讨其耐药机制提供新的研究方向。     

肺炎链球菌表面黏附素A的原核表达及免疫保护性研究

目的 利用基因工程技术获取原核表达的肺炎链球菌表面黏附素A(Psa A)蛋白并初步研究其对小鼠的免疫保护性.方法 根据基因库中psa基因序列设计合成特异性引物,从临床分离到的肺炎链球菌中提取DNA,PCR技术扩增目的 基因psaA,克隆后构建原核表达栽体PET-32a(+)/psaA,将重组质粒转化到大肠杆茵BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达,获得重组蛋白,并通过Western-blot鉴定其免疫活性.将重组蛋白免疫小鼠,观察对肺炎链球茵感染动物的保护作用.结果 经酶切及测序鉴定,克隆出870bp的目的 基因,DNA序列与Gen-Bank中的相应数据符合率为100%;成功构建出原核表达载体pET-32a/psaA;经IPTG诱导,表达出了约57 kD左右的融合蛋白,与预期大小相符,并且具有抗体结合活性;重组PsaA蛋白对肺炎链球菌感染小鼠具有一定保护作用.结论 在原核细胞中成功表达出PsaA蛋白,能在一定程度上抵抗肺炎链球菌感染,为基于黏附素的新型疫苗的研究提供线索.     

肺炎链球菌融合蛋白疫苗研究进展

肺炎链球菌是一种对人类健康危害较大的条件致病菌,目前其疫苗研究已取得了巨大突破,但既往研究主要集中在荚膜多糖疫苗上,存在诸多局限性。近年来,随着生物学技术及基因工程技术的飞速发展,由肺炎链球菌毒力因子及表面蛋白制作的蛋白疫苗研发迅速。其中,将肺炎链球菌不同的表面蛋白质作为免疫原组分构建的融合蛋白疫苗,极大地增强了疫苗的免疫原性,且已取得一定的试验效果,未来进一步研究将有望取代荚膜多糖疫苗。     

肺炎链球菌自溶素基因的克隆、表达及蛋白纯化

 目的 克隆肺炎链球菌自溶素（LytA）基因并在大肠埃希菌中表达及蛋白纯化。方法 用PCR方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将其插入原核表达载体pET32a（+）,构建pET32a(+) - LytA重组质粒,经IPTG诱导使该基因在大肠埃希菌BL21 (DE3)中表达,亲和层析法纯化目的蛋白,将获得的蛋白用Western blot鉴定门结果扩增出的DNA序列与GenBank中的LytA基因序列一致,成功构建了pET32a(+) - LytA重组质粒并在大肠埃希菌中高效表达,所表达的蛋白经Western blot证实为肺炎链球菌自溶素融合蛋白。结论 成功克隆了肺炎链球菌自溶素基因,并将其在大肠埃希菌中表达、纯化,为新型肺炎链球菌疫苗的研制奠定了基础。     

儿童侵袭性肺炎链球菌病临床特征与血清型分布

目的调查某院儿童侵袭性肺炎链球菌血清型分布情况,为肺炎链球菌感染的预防和临床合理治疗提供参考。方法收集2013年7月~2015年6月某院因侵袭性肺炎就诊的患儿分离的肺炎链球菌243株,采用荚膜肿胀试验进行血清型分型。结果 3 066例患儿中分离出肺炎链球菌243株,分离率为7.9%。临床特征显示,侵袭性肺炎链球菌病发病以2岁以下为主,占72.0%;有5个菌株未能分型,其余菌株可分成6个血清型,主要的流行血清型为19F、23F、6B、4、14和19A,7价疫苗覆盖率为92.2%,13价疫苗覆盖率为97.7%。结论某院侵袭性肺炎链球菌临床分离株以19F、23F、6B、4、14和19A常见,7价疫苗覆盖率高,预防感染应选用7价疫苗。     

肺炎链球菌表面蛋白A多价DNA疫苗交叉免疫保护作用评价

目的 评价肺炎链球菌表面蛋白A (PspA)优势家族亚类抗原的肺炎链球菌多价DNA疫苗抵御不同肺炎链球菌来源的异种PspA分子毒力作用的能力.方法 以包含PspA抗原Fam1的Clade1亚类和Fam2的Clade3亚类DNA序列的T载体为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增具有高保护性抗体效价和强交叉反应的PspA优势...     

肺炎链球菌疫苗候选抗原PspA异家族亚类间交叉反应评价

目的：观察肺炎链球菌DNA疫苗候选抗原肺炎链球菌表面蛋白A（PspA）在临床肺炎链球菌自然感染情况下家族分布及异家族亚类间抗原抗体交叉反应情况,探索肺炎链球菌PspA核酸疫苗的抗原组成形式。方法：采集我院42例临床侵入性肺炎链球菌感染菌株,及患者恢复期（第21±3天）的血清样本,同期确诊为非感染性疾病患者36例血清样本为对照组,细菌基因组特异性PCR及测序比对鉴定PspA家族分布,酶联免疫吸附法（ELISA）检测患者血清PspA抗体与PspA蛋白6种亚类抗原的交叉反应情况。结果：42株肺炎链球菌中以PspA家族Faml-Clade2（31.0％）和Fam2-Clade3（47.6％）的菌株为优势分布,所有侵入性肺炎链球菌感染患者血清中针对PspA-Faml特异性抗体水平高于针对PspA-Fam2的特异性抗体水平,血清PspA抗体与PspA蛋白6种亚类抗原的交叉反应发现异家族各亚类间交叉反应弱,但同家族亚类间显著交叉反应以Faml-Cladel和Fam2-Clade3为优势。结论：肺炎链球菌PspA核酸疫苗靶抗原的组成时应同时包括产生高保护性抗体效价和强交叉反应的Faml及Fam2的优势Clade亚类成分才能有效针对广泛的临床致病肺炎链球菌菌株感染的保护。     

肺炎链球菌黏附素A基因疫苗的构建及对小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带的防御作用

目的 探讨肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)基因疫苗的免疫原性及其对小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带的防御作用.方法 PCR技术从肺炎链球菌R6标准株扩增PsaA基因,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-PsaA,脂质体法转染BHK-21细胞,逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹(Western blot)检测重组质粒在BHK-21细胞中的转录和表达.应用PsaA基因疫苗肌肉注射免疫BABL/c小鼠,ELISA检测脾细胞上清IFN-γ分泌,特异性抗体IgG水平及其亚型分布(IgG1/IgG2a).利用BABL/c小鼠肺炎链球菌D39株鼻咽部携带模型,鼻咽部灌洗液菌落计数观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带改变.结果 RT-PCR及Western blot显示重组PsaA蛋白在BHK-21细胞瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清高水平的IFN-γ及特异性IgG抗体(IsG1/IgG2a＜1),小鼠攻击实验证明PsaA基因疫苗免疫组小鼠D39携带菌落计数明显少于对照组(P＜0.01).结论 肺炎链球菌表面毒力蛋白PsaA基因疫苗免疫小鼠激发了抗原特异性的细胞及体液免疫反应,显著减少了小鼠鼻咽部肺炎链球菌的携带,为肺炎链球菌DNA疫苗理想侯选抗原之一.     

反向线性点杂交技术在肺炎链球菌分型中的应用

目的 探讨反向线性点杂交技术在肺炎链球菌分型中的应用.方法 对临床诊断为肺炎的16例5岁以下患儿,从呼吸道吸取物、血和胸水培养分离获得的30株肺炎链球菌菌株应用反向线性点杂交技术进行分型,并与传统的血清学分型方法-夹膜肿胀实验进行比较.结果 反向线性点杂交技术和血清学方法对30株临床分离获得的肺炎链球菌菌株的分型结果完全一致,其分布情况为:血清型19A(n=9),14(n=5),23F(n=4),19F(n=4),6B(n=3),7F(n=2),15B(n=2),9V(n=1).16例肺炎患儿的肺炎链球菌血清型分布情况为血清型19A、14、23F及19F各来自3例患儿,血清型6B、7F、15B及19V各来自1例患儿.其中10例(62.5％)肺炎患儿分离获得的肺炎链球菌菌株涵盖在7价肺炎链球菌结合疫苗中,所有患儿获得的菌株均包含在23价多糖疫苗中.结论 对于肺炎链球菌,反向线性点杂交技术是一种可靠的分子生物学分型方法;在本组研究中,7价肺炎链球菌结合疫苗的涵盖率为62.5％,所有菌株均包含在23价多糖疫苗中.     

保定市致病性肺炎链球菌分子分型研究

目的了解保定市肺炎链球菌血清型分布,为肺炎疫苗的免疫预防提供依据。方法收集2013-2015年保定市3家医院临床分离的非重复性肺炎链球菌210株,采用PCR方法进行鉴定和分型,并对实验结果进行分析。结果210株肺炎链球菌主要菌型有19F、19A、6A/6B,分别达到30.0%、16.7%、11.0%;55株成人肺炎链球菌主要菌型有19F、5、19A血清型(群),分别达到18.2%、16.4%、14.5%;155株儿童肺炎链球菌主要菌型有19F、19A、6A/6B血清型(群),分别达到34.2%、17.4%、14.7%;31株侵袭性儿童肺炎链球菌主要菌型有19F、19A、6A/6B、14和1血清型(群),分别达到25.8%、16.1%、12.9%、12.9%、9.7%。结论肺炎链球菌血清型分布在地区之间、儿童与成人之间及侵袭性与非侵袭性菌株之间存在差异,应综合考虑以上因素,合理选用预防疫苗。     

广东省肇庆市肺炎链球菌分子分型及毒力基因检测

目的 了解肺炎链球菌常见血清型及其5种毒力基因的携带情况,为新型疫苗开发研究和提高临床诊断提供基础科学依据。方法 选取2016年4月—2018年12月肇庆市第一人民医院住院及门诊患者分离200株肺炎链球菌,采用多重PCR分子分型方法进行血清型分型,再用单因子血清对6A/6B型进行细分。利用PCR方法对肺炎链球菌5种毒力基因（ply、pspA、nanA、psaA、lytA）进行检测,使用SPSS 19.0进行统计学分析。结果 200株肺炎链球菌来自男性患者144例,女性患者56例。0~2岁的患者最多（占67.5%）,其次是≥50岁患者为16.5%。标本类型以痰为主,占92.0%。多重PCR法分型率为95.0%,血清型以19F（37.5%）、6B(12.0%)、23F(10.0%)、19A(9.0%)、3(6.5%)、14(6%)、15B/15C(5.5%)为主。5种毒力基因检测阳性率分别为ply 93.5%、pspA 85.0%、nanA 88.5%、psaA 90.5%、lytA 93.0%。8株血培养、1株脑脊液培养及19A、3和35A/35C/42三种血清型的5种毒力基因阳性率均为100.0%。血清型14型和5型的 5种毒力基因阳性率都较低。结论 肇庆市200株肺炎链球菌的血清型以19F、6B、23F、19A、3、14、15B/15C为主,2岁以下的儿童和老年人感染率高。5种毒力基因保守性高,大部分菌株均存在。血清型不同,5种毒力基因的存在也略有不同,可为新型疫苗开发及疾病预防提供有利的依据。     

南京地区儿童患者肺炎链球菌的血清型分布

目的了解南京地区儿童患者的肺炎链球菌血清型的分布,为疫苗研发的血清型选择提供支持。方法采用多重聚合酶链式反应(PCR)方法,对从南京地区儿童中分离的323株肺炎链球菌株进行测定,以确定其血清型。结果南京儿童医院分离的肺炎链球菌共323株,分型检定结果表明,最常见的血清型为19 F,所占的百分比为31.3%,其次为19 A(13.3%),14型(12.7%)和6 A/B(10.8%)。结论南京地区儿童患者所携带的血清型以19 F、19 A、14和6 A/B型最为常见,现有7价疫苗的覆盖率较低约为62%,而13价肺炎结合疫苗(PCV13)的血清型覆盖率较高约为85%。     

123株肺炎链球菌的分离鉴定及分子分型

目的对临床诊断为大叶性肺炎、气管炎、中耳炎、胸膜炎、心内膜炎和败血症等病人进行血液等标本的采集、细菌培养和分型鉴定,为补充河北省肺炎链球菌菌型资料和疫苗的正确选择提供科学依据。方法对分离的123株肺炎链球菌进行分子鉴定和分子分型研究,普通PCR对肺炎链球菌进行种属鉴定,多重PCR方法对菌株进行菌型分析。结果经PCR检测,123株菌的cps A基因扩增均为阳性,阳性标本经多重PCR分型检测,19F和6A/6B型所占比例最大,分别为39. 02%和11. 38%,且型别类型多达20种。结论 123株肺炎链球菌19F和6A/6B型所占比例最大,且菌型丰富,为全省制定肺炎链球菌疫苗使用策略提供了科学依据。     

肺炎链球菌毒力相关基因检测及临床意义

目的:检测肺炎链球菌临床分离株毒力基因存在情况。方法:以临床分离出的91株肺炎链球菌作为研究对象,利用PCR法对肺炎链球菌5种毒力基因实施检测。结果:在全部的91株肺炎链球菌中LytA、PsaA、NanA、PspA、Ply这5种基因的检测阳性率分别为94.5%、85.7%、85.7%、61.5%、82.4%。结论:肺炎链球菌毒力因子是肺炎链球菌致病的基础,5种常见的毒力基因在肺炎链球菌检测中,其阳性率都比较高,此实验为进一步阐明毒力因子的作用机制并应用于指导抗肺炎链球菌新药和新型疫苗研制奠定了一定的基础。     

侵袭性肺炎链球菌148株血清型、耐药性及分子分型研究

目的 研究临床分离的侵袭性肺炎链球菌血清型分布、耐药性及分子流行病学特点,为抗生素的应用和免疫预防提供参考依据.方法 收集2005年1月至2008年8月全国15个地区148株来自血液、脑脊液等侵袭性感染部位的肺炎链球菌.采用琼脂稀释法测定青霉素等抗生素对148株肺炎链球菌的最低抑菌浓度(MIC);采用简易棋盘式肺炎链球菌分型系统和荚膜肿胀实验进行血清分型;多位点序列分型(MIST)技术对53株19群菌株进行基因分型,了解其与国际流行株的关系.结果 血清分型共检出20个血清型/群,主要集中在19A、19F、3、23F、5、6、14和9血清型/群,共计105株,占70.9%,以19A(22.3%,33/148)、19F(16.9%,25/148)最常见,其次为3群(7.4%,11/148)和23F(6.8%,10/148).7价疫苗(PCV7)在2岁以下儿童中的覆盖率为33.3%(12/36).PCV7相关血清型肺炎链球菌对阿莫西林/克拉维酸、红霉素等耐药率均明显高于非疫苗相关血清型菌株(P<0.05).53株19群肺炎链球菌MIST分析共检出9种序列型(ST),其中以ST320(28/53,52.8%)和ST271(12/53,22.6%)为主.结论 我国侵袭性肺炎链球菌血清分型以19A、19F、3和23F血清型为主.侵袭性肺炎链球菌耐药情况严重.     

PspA免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染研究

目的:获取原核表达的肺炎链球菌PspA重组蛋白并研究其作为疫苗的价值. 方法:分离培养肺炎链球菌TIGR4,获取其染色体DNA,采用基因体外重组法将编码PspA抗原表位在内的部分序列克隆到原核表达载体PET-32(a)内,酶切及测序鉴定重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,将获得的重组蛋白用Western Blot鉴定,镍柱纯化并透析除盐. 用重组蛋白免疫动物,观察PspA抗体对肺炎链球菌感染小鼠的保护作用. 结果:DNA序列与GenBank中的数据相符,所表达纯化的蛋白经Western Blot证实为PspA,其抗体在肺炎链球菌感染中对小鼠有保护作用. 结论:重组PspA刺激产生的抗体能够有效抵抗肺炎链球菌TIGR4侵袭性感染,该重组蛋白可作为肺炎链球菌多肽联合疫苗的组成部分之一.     

肺炎链球菌SP2108蛋白的原核表达及免疫原性分析

目的制备纯化的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)SP2108蛋白,分析其在常见S.pn菌株中的保守性,并评价其作为S.pn候选疫苗的可行性。方法利用PCR法扩增全长SP2108基因,将其克隆至原核表达载体p Cold TF中,转化E.coli BL21(DE3)后IPTG诱导蛋白表达,经Ni-NTA树脂纯化获得高纯度的目的蛋白;将纯化蛋白免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体,并用间接ELISA检测效价,Western blot鉴定该蛋白在6种常见S.pn菌株的保守性。从Genebank中找出不同S.pn菌株的SP2108蛋白质氨基酸序列,并用Clustal X 2.1软件分析其序列保守性。结果获得了可溶性形式的SP2108蛋白,该重组蛋白免疫小鼠后可获得高滴度的多克隆抗体;Western blot验证了SP2108蛋白在6株常见S.pn菌株中均有表达;SP2108蛋白在不同型别S.pn中氨基酸序列保守性为100%。结论原核表达并纯化了SP2108蛋白,该蛋白保守性高,免疫小鼠后可获得高滴度的多克隆抗体,可能是一种较好的S.pn候选蛋白疫苗。     

抗链球菌感染口服疫苗将进行临床试用

预防链球菌感染及其并发症风湿热的口服疫苗即将问世。此疫苗是美国田纳西大学研究人员制成的。以前试制预防链球菌感染疫苗常归失败,因为链球菌任何一部分都可引起人体毒性反应。现在,由Edwin Beachcy领导的研究小组可解决这一问题。他们运用遗传工程通过一种无关的减毒型沙门氏菌,生产链球菌M蛋白,此蛋白可诱发对链球菌感染和风湿热的免疫力。无M蛋白基因的减毒沙门氏菌曾用于制造疫苗,预防伤寒。在伤寒发病过程中,沙门氏菌侵入肠道粘膜细胞,由于肠道内无此菌所需的营养物(如芳香族氨基酸),致使其死亡在肠道内,但沙门氏菌在肠内存在的时间足能诱发宿     

苏州地区儿童肺炎链球菌脑膜炎39例临床特征和血清型分析*

目的：分析苏州地区儿童肺炎链球菌脑膜炎及死亡病例的血清型和临床特征,寻找降低儿童肺炎链球菌脑膜炎发病率和死亡率的对策。方法：对苏州大学附属儿童医院2011年1月—2016年12月收治97例化脓性脑膜炎患儿中39例肺炎链球菌脑膜炎菌株进行血清学分型,对其临床特征和实验室结果进行统计分析。结果：97例化脓性脑膜炎患儿脑脊液培养出致病菌依次为：肺炎链球菌39例(40.2%),无乳链球菌19例(19.6%)和大肠埃希菌18例(18.6%)等;总病死率为19.6%(19/97),按照病死率高低依次为：肺炎克雷伯菌60.0%(3/5),肺炎链球菌35.9%(14/39)和大肠埃希菌11.1%(2/18);肺炎链球菌脑膜炎死亡组体温＞40°、早期纳差、早期嗜睡、休克、弥散性血管内凝血、急性肾损伤、呼吸衰竭、抽搐和昏迷的发生显著高于存活组(P＜0.05);肺炎链球菌组分别有17.9%和15.4%出现并发症硬膜下积液和脑积水;肺炎链球菌组首次抗生素使用与药敏结果符合率为20.0%(6/30);39例肺炎链球菌脑膜炎患儿肺炎链球菌疫苗率为0.0%,7价肺炎链球菌疫苗和13价肺炎链球菌疫苗覆盖肺炎链球菌组血清型分别为82.1%和92.3%,对死亡组血清型覆盖率分别是85.7%和92.9%。结论：肺炎链球菌是苏州地区6个月以上儿童化脓性脑膜炎的首要病原体;早期识别高热、纳差和嗜睡等危重症状态及合理选择抗生素对改善肺炎链球菌脑膜炎预后具有重要意义。门诊抗生素选择对肺炎链球菌敏感率低及我国肺炎链球菌疫苗接种率低,是肺炎链球菌脑膜炎高病死率的重要原因。期望通过接种13价肺炎链球菌结合疫苗降低肺炎链球菌脑膜炎的发生率和病死率。     

肺炎链球菌溶菌酶作为肺炎链球菌多价核酸疫苗候选抗原的保护效能评价

目的:肺炎链球菌溶菌酶(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase,LytA)作为肺炎链球菌多价核酸疫苗候选抗原的保护效能评价.方法:PCR技术从肺炎链球菌R6标准株扩增LytA基因序列,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-LytA,免疫印迹(western-blot)检测重组质粒在哺乳动物BHK-21细胞中的表达.与前期构建的肺炎链球菌表画蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA)N端序列基因构建的质粒pcDNA3.1-PspA'核酸疫苗联合或单独肌肉注射免疫BABL/c小鼠,检测各组小鼠血清特异性抗体IgG水平,并观察免疫小鼠肺炎链球菌D39腹腔攻击21d生存情况.结果:ELISA检测发现3组(pcDNA3.1-LytA组,pcDNA3.1-PspA'组,pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA'组)实验组小鼠特异性IgG水平较空质粒对照组显著升高(P＜0.001),pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA'组小鼠抗LytA特异性抗体IgG水平较pcDNA3.1-LytA组明显升高(P＜0.01),但是与pcDNA3.1-PspA'组比较抗PspA特异性抗体IgG水平无显著差异(P＞0.05).小鼠攻击试验提示pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA'组小鼠中位生存时间较pcDNA3.1-LytA组及空质粒对照组显著延长(P＜0.01),但与pcDNA3.1-PspA'组比较中位生存时间无显著差异(P＞0.05),生存曲线相似.结论:LytA联合PspA'的肺炎链球菌多价核酸疫苗免疫效能并不优于单一抗原PspA'的肺炎链球菌核酸疫苗,LytA作为肺炎链球菌多价核酸疫苗的优势候选抗原组分之一有待进一步研究.