应用平阳霉素与单克隆抗体Fab′片段偶联物抑制肝癌生长与肿瘤肝转移

目的　研制一种具有抑制肝癌生长和肿瘤肝转移作用的单克隆抗体Fab′片段与平阳霉素（PYM）偶联物。方法　以胃蛋白酶酶解结合二巯基苏糖醇（DTT）还原法制备单抗Fab′片段;以葡聚糖T-40（dextran T-40）为中介体制备Fab′片段和PYM偶联物Fab′-PYM;用间接ELISA法、2,3,5-氯化三苯基四氮唑 （TTC）抑菌效价检测法,克隆形成法及动物移植性肿瘤模型测定Fab′-PYM偶联物在体外的生物学活性与在小鼠体内的抗肿瘤作用。结果　Fab′-PYM与BEL-7402、肝癌22（H22）及HT-29细胞呈免疫学阳性反应, 但与KB细胞无反应;偶联物中PYM的抑菌活性为游离PYM的15%;Fab′-PYM对体外培养的BEL-7402细胞、HT-29细胞和KB细胞的50%抑制浓度（IC50）分别为0.02、0.08及0.50 μmol/L;静脉注射10 mg/kg Fab′-PYM偶联物和PYM皮下接种对小鼠肝癌22的抑瘤率分别为86%和62%;腹腔注射,10 mg/kg Fab′-PYM偶联物和PYM对小鼠脾内接种的结肠癌26肝转移的抑制率分别为91%和62%。结论　Fab′-PYM偶联物具有比游离平阳霉素更强的抑制肝癌生长与肿瘤肝转移作用。     

前列腺癌单克隆抗体与平阳霉素偶联物导向化疗的体外作用

目的 探讨导向化疗对前列腺癌细胞系LNCaP的体外作用.方法 以葡聚糖为中介体制备抗前列腺癌单克隆抗体7E11C5.3与平阳霉素(PYM)的偶联物,用间接ELISA法测定其免疫活性,2,3,5-氯化三苯基四氮唑法测定其抑菌活性.四唑盐法测定其体外细胞毒作用.结果 偶联物中7E11C5.3和PYM的摩尔比为1:54,偶联后单抗的免疫活性降低了10%～20%,偶联物中PYM的抑菌活性为游离PYM的25%,偶联物和游离PYM对体外培养的LNCaP细胞50%抑制浓度分别为(9.41±1.98)μg/ml和(29.92μ7.88)μg/ml.结论 7E11C5.3-PYM偶联物的体外抗前列腺癌作用强于游离PYM.     

力达霉素构建的小型化单克隆抗体免疫偶联物的抗肿瘤作用

目的研制一种具有高效、小型化特点的抗肿瘤单克隆抗体(单抗)免疫偶联物.方法以化学偶联法制备抗肿瘤抗生素力达霉素(LDM)与单抗Fab＇片段的偶联物Fab＇LDM.以非还原型SDS-PAGE法确定偶联物的相对分子质量;ELISA法、四氮唑蓝(MTT)法、克隆形成法及小鼠移植性结肠癌26(C26)模型观察Fab＇-LDM偶联物的抗肿瘤作用.结果 Fab＇-LDM偶联物的相对分子质量(Mr)约为65 000,Fab＇与LDM的偶联分子比为11;偶联物与BEL-7402及C26细胞均呈免疫学阳性反应,但与KB细胞无反应;Fab＇-LDM对靶细胞BEL-7402的杀伤作用比游离LDM强13倍,对C26细胞的杀伤作用比LDM强5.5倍,但对非靶细胞KB的作用与LDM相当.动物试验结果表明,0.05 mg/kg、0.1 mg/kg和0.2 mg/kg剂量Fab＇-LDM偶联物对小鼠移植性结肠癌26的抑瘤率分别达80%、92%和94%,而0.1 mg/kg剂量游离LDM的抑瘤率为77%;同时偶联物治疗组动物生存时间较对照组延长.偶联物的抑瘤作用强于等剂量游离LDM(P＜0.01).结论以高效抗肿瘤抗生素LDM为"弹头"药物,可与单抗活性片段构建成具有良好抗肿瘤作用的小型化单抗导向药物.     

铼-188和平阳霉素联合导向治疗前列腺癌的体外作用

 [目的]探讨前列腺特异膜抗原单克隆抗体7E11C5.3介导铼-188和平阳霉素（PYM）导向治疗前列腺癌细胞系LNCaP的体外作用。[方法]以葡聚糖为中介体制备7E11C5.3-PYM偶联物，间接ELISA法测定免疫活性，2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定抑菌活性。采用2-巯基乙醇直接还原法制备188Re-7E11C5.3标记物，纸层析法测定标记率和放化纯度，直线回归外推法测定免疫活性分数。四唑盐（MTT）法测定体外细胞毒作用。[结果]7E11C5.3-PYM偶联物中7E11C5.3和PYM的克分子比为1∶54，偶联后单抗的免疫活性降低了10%～20%，偶联物中PYM的抑菌活性为游离PYM的25%。188Re-7E11C5.3的标记率为93.16%±2.18%，放化纯度为95.62%±0.48%，免疫活性分数为74.86%±1.86%。7E11C5.3-PYM和188Re-7E11C5.3对LNCaP细胞的抑制作用分别强于游离PYM和188ReO4-；两者单独用药时，其半数抑制浓度（IC50）分别为（10.17±2.06）µg/mL和（23.38±3.73）×104 Bq/mL；两者联合用药时，其IC50值分别为（1.83±0.20）µg/mL和（6.82±0.73）×104 Bq/mL。[结论] 7E11C5.3-PYM和188Re-7E11C5.3联合用药对前列腺癌细胞的抑制作用显著强于单独用药。     

抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其F(ab')2与Fab'片段的抗肿瘤作用

目的 研究抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其F（ab’）2、Fab’片段对小鼠肝癌22（H22）及小鼠lewis癌肺转移的治疗作用。方法 ELISA实验检测3G11及其片段与多种肿瘤细胞及Ⅳ型胶原酶的免疫反应性,明胶酶谱法测定其对HT-1080细胞分泌Ⅳ型胶原酶活性的影响,MTT法测定其对H22细胞的细胞毒作用。用小鼠肝癌22及小鼠Lewis肺癌模型评价单抗3G11及其片段抑制肿瘤生长及抗肿瘤转移活性。结果 单抗3G11及其片段对多种肿瘤细胞及Ⅳ型胶原酶均呈阳性反应,单抗3G11抑制肿瘤细胞HT-1080分泌Ⅳ型胶原酶的活性。单抗3G11对H22细胞有微弱的细胞毒作用。单抗3G1130mg／kg对小鼠移植性肝癌的抑制率为51．8％,F（ab＇）210mg/kg为49．9％,Fab’20mg／kg为39．3％。F（ab’）2片段10mg／kg对小鼠lewis癌肺转移的抑制率为76％。结论 抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其片段对小鼠移植性肝癌22生长以及对小鼠lewis癌肺转移有中度抑制作用,可能用于研制抗体靶向药物。     

单克隆抗体与链黑菌素偶联物的抗肝癌BEL-7402细胞活性

采用活化酯法制备链黑菌素与抗人肝癌单克隆抗体(McAb)3A5的免疫偶联物,该偶联物兼有二者的生物活性和紫外吸收特征。抗体与链黑菌素偶联分子比为1:2～6,蛋白回收率为76％,链黑菌素保留原活性的12.5％,抗体活性基本上完全保持。但随着药物分子偶联数目的增加,抗体活性减小。偶联物在体外细胞克隆生成试验中,对肝癌BEL-7402细胞的抑制作用为游离链黑菌素的63倍,而对与抗原性无关的人咽上皮癌KB细胞的作用则较游离的链黑菌素弱11倍。以上结果表明,该免疫偶联物对靶细胞显示选择性杀伤作用。     

白花丹醌一单壁碳纳米管偶联物的制备及其对人肝癌Bel-7402细胞的抑制作用

目的：制备白花丹醌单壁碳纳米管（plumbagin-singlewalledcarbonnanotubesconjugate,PLB-SWNT）偶联物,考察其在水溶液中的分散性和体外对人肝癌Bel一7402细胞的抑制活性。方法：以聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）作为偶联剂,通过酰胺化和酯化反应将PLB与SWNT偶联,制备PLB-SWNT偶联物,并利用傅里叶转换红外光谱仪和透射电子显微镜（TEM）考察和分析所制备得到的偶联物的组成、结构和形貌,以紫外可见分光光度法（uV—Vis）测定PLB-SWNT偶联物PLB含量,并以MTT比色法、HE染色法和TEM等方法对该偶联物体外抑制Bel-7402活性进行初步研究。结果：①制备得到在水溶液中分散性较好的PLB-SWNT偶联物;②PLB-SWNT偶联物能够抑制人肝癌Bel-7402细胞的增殖。结论：①以PEG和PLB对SWNT进行共价修饰,可以制备分散性良好的PLB—SWNT偶联物;②PLB-SWNT偶联物在体外对人肝癌Bel-7402细胞的增殖抑制效果显著。     

薏苡仁酯和平阳霉素抑制鼻咽癌细胞增殖的相互作用

目的：探讨薏苡仁酯（coixenolide,CXL)和平阳霉素(pingyangmycin,PYM）抑制人鼻咽癌细胞CNE－2Z增殖的联合效应。方法：采用微量细胞克隆形成法检测CNE－2Z的增殖能力和对药物的敏感性，结果：CZL和PYM均以量效方式抑制CNE－2Z细胞的克隆形成，ID50分别是10^-4.758mol/L和10^-5.494mol/L，将CXL和PYM以4：1的剂量（摩尔浓度）比合用，全部效应协同。两药5：1，抑制率≤50％时，协同；＝60％，相加；≥70％，拮抗。6：1，抑制率＝10％时，协同；≥20％，拮抗。结论：CXL和PYM的相互作用可产生多种联合效应，与合用的剂量，剂量比密切相关。     

腺病毒介导反义c—myc基因诱导人肝癌细胞凋亡的分子机制

目的：观察重组腺病毒介导反义c-myc基因（Ad-ASmyc)诱导体外培养不同人肝癌细胞凋亡的差异并探讨其分子生物学机制。方法：Ad-ASmyc感染人肝癌细胞系后，观察细胞生长形态变化，通过细胞生长存活率，流式细胞仪分析、RT－PCR、Western Blot分析Ad-Asmyc对人肝癌细胞系BEL－7402、QSG－7701、SMMC－7721和HCC－9204细胞凋亡诱导、c-myc和bcl-2基因表达的影响。结果：Ad-Asmyc可高效转导4种人肝癌细胞系（BEL－7402、QSG－7－1、SMMC－7721和HCC－9204细胞），镜下可见细胞凋亡的形态学变化并出现“凋亡小体”，细胞存活率分别为对照组的（37．7％、49．3％、51．3％和43．1％），诱导肝癌细胞GI期阻滞和凋亡，4种人肝癌细胞系均为c-myc 、bcl-2RNA及c-myc蛋白水平高表达，但表达水平有差异，Ad-ASmyc作用后，其表达水平均明显下降。结论：重组腺病毒介导的反义c-myc基因能够诱导体外培养人肝癌细胞凋亡，引起人肝癌细胞c-myc、bcl-2RNA及c-myc蛋白表达下调和细胞生长抑制，其诱导凋亡的程度与肝癌细胞内的c-myc表达水平密切有关。     

小干扰RNA抑制肝癌细胞株BEL7402 ICAM-1基因表达的研究

目的研究小干扰RNA（siRNA）抑制肝癌细胞系BEL7402基因ICAM-1表达的可行性。方法根据ICAM-1基因设计shRNA片断，构建pGenesil-1／ICAM-1表达载体，转染BEL7402细胞，实时定量PCR和免疫组织化学方法检测肝癌细胞中ICAM-1基因表达抑制情况。结果该实验已成功构建了针对ICAM-1基因的pGenesil-1／ICAM-1质粒。实时定量PCR检测结果显示，BEL7402细胞经特异性siRNA作用后ICAM-1基因的表达受抑制，其Ct值由28．8降低到21．6，免疫组织化学结果显示：RNA干扰（RNAi）能特异而有效地抑制BEL7402细胞中ICAM-1基因的表达。结论构建的pGenesil-1／ICAM-1重组质粒能有效抑制ICAM-1基因在肝癌细胞株BEL7402中的表达，为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法和材料。     

去甲斑蝥素用于单克隆抗体为载体的肿瘤导向治疗实验研究

用单抗３Ａ５制备与去甲斑蝥素（ＮＣＴＤ）的偶联物。ＥＬＩＳＡ检测结果表明：３Ａ５ ＮＣＴＤ偶联物保持对人肝癌ＢＥＬ ７４０２细胞的免疫反应性。克隆生成法测定结果显示：３Ａ５ ＮＣＴＤ具有比ＮＣＴＤ更强的细胞毒性,两者的ＩＣ５０分别为２．３ｍｇ／Ｌ和４．２ｍｇ／Ｌ。小鼠腹腔内移植Ｈ２２肝癌,腹膜内给药（ｉｐ）,３Ａ５ ＮＣＴＤ（３ｍｇ／ｋｇ）和ＮＣＴＤ（３ｍｇ／ｋｇ）的延长寿命值（ＩＬＳ）分别为１６８％和４２％。裸鼠移植人肝癌ＢＥＬ ７４０２细胞,静脉给药（ｉｖ）,ＮＣＴＤ的肿瘤抑制率为１５％（Ｐ＞０．０５）,３Ａ５ ＮＣＴＤ为６２％（Ｐ＜０．０１）;瘤结周围给药（ｐｔ）,ＮＣＴＤ的肿瘤抑制率为４７％（Ｐ＜０．０５）,３Ａ５ ＮＣＴＤ为７８％（Ｐ＜０．０１）。结果表明,与ＮＣＴＤ相比,３Ａ５ ＮＣＴＤ对裸鼠移植人肝癌和腹腔肿瘤具有更强的治疗作用。以上结果提示单抗与ＮＣＴＤ偶联物在肿瘤的导向治疗中有较好的疗效。     

ANTITUMOR EFFECTS OF MONOCLONAL ANTIBODY FAB’FRAGMENT—CONTAINING IMMUNOCONJUGATES

Objective.Using monoclonal antibody(mAb)Fab‘fragment to develop mAb immunoconjugates for cancer.Methods.Fab‘ fragment of mAb 3A5 was prepared by digestion of the antibody with pepsin and then reduced by dithiothreitol(DTT),while Fab‘ fragment of mAb 3D6 was obtained by digestion of the antibody with ficin and subsequently reduced by β-mercaptoethanol.The conjugation between Fab‘ fragment and pingyangmycin(PYM),an antitumor antibiotic,was mediated by dextran T-40.Immunoreactivity of Fab‘-PYM conjugates with cancer cells was determined by ELISA,and the cytotoxicity of those conjugates to cancer cells was determined by clono-genic assay.Antitumor effects of the Fab‘-PYM conjugates were evaluated by subcutaneously transplanted tumors in mice.Results.The molecular weight of Fab‘ fragment was approximately 53 kD,while the average molecular weight of Fab‘-PYM conjugate was 170kD.The Fab‘-PYM conjugates showed immunoreactivity with anti-gen-relevant cancer cells and selective cytotoxicity against target cells.Administered intravenously,Fab‘-PYM conju-gates were more effective aganist the growth of tumors in mice than free PYM and PYM conjugated with intact mAb.Conclusion.Fab‘-PYM conjugate may be capable of targeting cancer cells and effectively inhibiting tumor growth,suggesting its therapeutic potential in cancer treatment.     

蓖麻毒素及其修饰物在肝癌细胞膜上的分布

目的：探讨３－（α－吡啶二硫基）丙酸Ｎ－羟基琥珀酰亚胺基酯（ＳＰＤＰ）修饰的蓖麻毒素毒癌活性及其机制。方法：用流式细胞仪分析蓖麻毒素及其修饰物在肝癌细胞膜上的分布变化。结果：修饰的蓖麻毒素在肝癌细胞上的分布比未修饰的蓖麻毒素明显增多,结论：ＳＰＤＰ修饰后的蓖麻毒素对肝癌细胞的亲和力增加,提示蓖麻毒素用ＳＰＤＰ修饰可能是改进其抗癌作用的一个有价值的途径。     

亚砷酸抗裸鼠人肝癌作用及机制研究

目的：探讨亚砷酸体内对人肝癌细胞的作用、毒副作用及机制。方法：人肝癌细胞BEL-7402体外培养，取指数生长期细胞裸鼠皮下接种，成瘤后腹腔分别连续注射不同浓度亚砷酸、5—Fu及生理盐水，观察不同浓度亚砷酸治疗组及对照组瘤块大小、抑癌率和裸鼠一般状态的变化，光镜下观察肝肾结构的改变，并进行血常规检测。结果：亚砷酸可明显抑制瘤块增长，2．5mg／Lg亚砷酸10天的抑瘤率为53．42％，5mg/kg亚砷酸5天、10天的抑瘤率分别为79．28％、96．58％，而且无明显肝肾损害，对造血系统无影响。结论：亚砷酸可抑制体内肝癌结节生长，而且对肝、肾及造血系统没有明显的毒副作用。     

舟山眼镜蛇毒及其有效组分体内外抑瘤的作用

目的：观察蛇毒（SV）及其有效组分体内外的抗癌活性,为SV抗肿瘤新药的开发提供实验依据。方法：采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）筛查不同浓度（5—20mg／mL）SV及其7种分离组分对人结肠癌细胞株（HCT-8）、人肝癌细胞株（Bel-7402）、人口腔上皮癌细胞株（KB）、人乳腺癌细胞株（MCF-7）的影响;并用小鼠肝癌（H22）动物移植瘤作为实验动物模型,进一步观察SV及其组分Ⅳ（0．01-0．03mg／kg）对瘤重、脾重、外周血白细胞和体质量的影响。结果：SV、Ⅲ2和Ⅳ的肿瘤抑制作用较为明显,三者的浓度在20μg／mL时,对HCT-8、Bel-7402、KB以及MCF-7具有非常显著的抑制作用,对HCT-8的抑制率分别为84．37％、79．39％和85．78％;对Bel-7402的抑制率分别为89．64％、88．13％和92．08％;对KB的抑制率分别为90．08％、91．30％和93．93％;对MCF-7的抑制率分别为89．88％、89．49％和92．33％。腹腔注射10d后,组分Ⅳ对H22有明显的抑制作用,SV组分Ⅳ3个浓度组的瘤重分别为（0．81±0．20）g、（0．70±0．18）g、（0．61±0．17）g,均明显低于对照组瘤重[（1．19±0．21）g,P〈0．05],肿瘤生长抑制率（IR）分别为31．93％、41．17％和48．73％。Ⅳ各剂量组小鼠脾脏指数较对照组增加,白细胞数与对照组相比无明显变化。结论：SV及其7种分离组分均能有效抑制4种人肿瘤细胞株（HCT-8、Bel-7402、KB及MCF-7）的生长,不同的SV分离组分对同一肿瘤细胞抑制作用有差异;不同肿瘤细胞对同一SV分离组分的反应性也不同。SV分离组分Ⅳ对动物移植性肿瘤小鼠肝癌H22有良好的实验疗效。     

中华眼镜蛇毒组分C对人肝癌细胞株BEL-7402细胞凋亡及端粒酶活性的影响

目的 :研究中华眼镜蛇毒组分C对人肝癌细胞株BEL 74 0 2细胞凋亡和端粒酶活性的影响 ,以探讨其抗肿瘤的作用机制。方法 :用不同浓度的中华眼镜蛇毒组分C分别处理人肝癌细胞株BEL 74 0 2 ,采用MTT法、流式细胞仪法、TRAP -ELISA、透射电镜等观察其对肝癌细胞的细胞毒、细胞凋亡、细胞周期及端粒酶活性的影响。结果 :中华眼镜蛇毒组分C对人肝癌细胞株BEL 74 0 2有明显的抑制作用 ,且呈时间依赖性及剂量依赖性。用流式细胞仪分析发现中华眼镜蛇毒组分C可诱导BEL 74 0 2肝癌细胞发生凋亡 ,肝癌细胞明显阻滞于G0 /G1 期 ,在G1 峰前出现明显的亚二倍体凋亡峰 ,且其凋亡率随蛇毒浓度的升高而呈上升的趋势。用TRAP ELISA法同步测得蛇毒作用BEL 74 0 2肝癌细胞 8h后的端粒酶活性值明显下降 ,其抑制作用与剂量呈正相关 (r =0 .96 4 ,P <0 0 5 )。在电镜下 ,可观察到肝癌细胞出现明显的凋亡特征性改变 :细胞膜完整、核染色质固缩 ,核碎裂、凋亡小体形成。结论 :中华眼镜蛇毒组分C可显著抑制人肝癌细胞株 (BEL 74 0 2 )的增殖 ,在诱导肿瘤细胞发生凋亡的同时也下调瘤细胞的端粒酶活性 ,这可能是FC抗肿瘤的重要机制之一。     

Hepsin蛋白对肝癌细胞生长的影响

目的:探讨Hepsin蛋白对肝癌细胞生长和细胞凋亡的影响。方法:运用RT-PCR技术检测肝癌组织样品肝癌细胞系中Hepsin基因的表达水平,并从原发性肝癌患者的癌组织中扩增Hepsin基因编码区序列,该序列被克隆并构建pCMV-tag-HS表达质粒。将pCMV-tag-HS表达质粒转染人肝癌细胞系HepG2细胞、Bel-7402细胞,观察Hepsin蛋白对肝癌细胞的增殖能力和细胞凋亡效应的影响。结果:Hepsin基因在临床肝癌组织和人正常肝细胞L-02细胞中高表达,在人肝癌细胞系Bel-7402细胞、HepG2细胞和临床肝癌癌旁组织不表达或低表达,Hepsin蛋白可以增强肝癌细胞系的增殖能力,同时抑制肝癌细胞凋亡。结论:Hepsin蛋白促进肝癌细胞生长并抑制肝癌细胞凋亡。