SD大鼠角朊细胞体外培养的实验

目的:观察SD大鼠角朊细胞在体外培养的生长特性。方法:采用dispase酶消化法从SD大鼠仔鼠皮肤获得角朊细胞,在体外进行培养并传代,采用倒置显微镜和MTT法观察细胞的形态学变化和生长曲线。结果:通过酶消化法可以获得较纯的角朊细胞,原代培养10d细胞即可以达到融合,传代后细胞部分发生变性,呈成纤维细胞样,传代次数高,成纤维样细胞比例也相应增高。结论:SD大鼠角朊细胞可以在体外培养分裂增殖,但传代后即发生变     

SD大鼠角朊细胞体外培养的实验

目的：观察SD大鼠角朊细胞在体外培养的生长特性。方法：采用dispase酶消化法从SD大鼠仔鼠皮肤获得角朊细胞，在体外进行培养并传代，采用倒置显微镜和MTT法观察细胞的形态学变化和生长曲线。结果：通过酶消化法可以获得较纯的角朊细胞，原代培养10d细胞即可以达到融合，传代后细胞部分发生变性，呈成纤维细胞样，传代次数高，成纤维样细胞比例也相应增高。结论：SD大鼠角朊细胞可以在体外培养分裂增殖，但传代后即发生变性。     

肾癌细胞株786-O中CD133~＋细胞分选及基因表达谱研究

目的探讨应用免疫磁珠细胞分选方法分离肾癌细胞株786-O中CD133＋的可能性,并分析CD133＋细胞与CD133-细胞的基因表达谱差异。方法应用免疫磁珠细胞分选技术分选肾癌细胞株786-O中的CD133＋细胞,流式细胞仪分析CD133细胞含量,提取RNA用基因芯片技术分析其基因表达谱。结果 786-O细胞中CD133＋细胞占13.70%,磁珠分选收集的CD133＋细胞阳性率可达98.46%。免疫磁珠细胞分选技术可以有效分选肾癌CD133＋细胞,基因表达谱分析可见CD133＋细胞较CD133-细胞有8种基因表达上调2倍以上,23种基因下调2倍以上。结论免疫磁珠细胞分选技术可以有效分离肾癌CD133＋细胞,CD133＋细胞与CD133-细胞表达差异基因分析为后续研究提供了新的思路。     

低浓度活性氧逆转肾癌先天性多药耐药的实验研究

目的探讨低浓度活性氧对肾癌786-O细胞先天性多药耐药的逆转作用及相关机制。方法采用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒确定活性氧H2O2的非细胞毒性剂量,以及对786-O细胞药物敏感性的影响。罗丹明123实验检测细胞P糖蛋白（P-gp）功能,Western blot方法检测经典多药耐药基因（mdr1）产物P-gp的表达。结果在0.00001～0.1mmol/L浓度范围内,H2O2具有明显的促细胞生长作用,且显著增加了阿霉素及长春新碱的细胞毒性,0.02mmol/LH2O2孵育786-O细胞72h后其对阿霉素及长春新碱的药物敏感性分别增加至对照组的5.43及4.47倍,荧光染料罗丹明123的蓄积量显著增加,Western blot检测结果显示0.02mmol/LH2O2可抑制肾癌786-O细胞P-gp的表达。结论低浓度活性氧H2O2可部分逆转人肾癌786-O细胞先天性多药耐药对阿霉素的耐药性,其逆转机制与增加细胞内化疗药物浓度、抑制P-gp的表达有关。     

腰痛患者肌卫星细胞生物学特性及其鉴定

目的：观察腰痛患者肌卫星细胞体外培养的生物学特性,探讨其在慢性腰痛中肌纤维损伤的修复作用。 方法：取腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征所致腰痛患者活体竖脊肌组织块,采用I型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法及差速贴壁法纯化肌卫星细胞,进行原代培养及传代培养,观察细胞形态及其传代能力,绘制生长曲线,结蛋白免疫组化染色鉴定肌卫星细胞。 结果： 纯化后肌卫星细胞生长良好,传代培养后增殖速度较原代培养快,6代以前形态较规则,8代以后逐渐老化,结蛋白鉴定呈阳性。 结论：慢性腰痛患者肌卫星细胞体外培养形态与正常人基本相同,但传代能力减弱,可能与修复受损肌纤维有关。     

CLU基因干扰肾癌786-O细胞差异基因表达的研究

目的:观察CLU基因干扰前后肾癌细胞株786-O的基因表达谱差异,探讨肾细胞癌与CLU基因相关基因及传导通路。方法:CLU基因干扰慢病毒载体及空病毒载体转染肾癌786-O细胞样本与RocheNimbleGen表达谱芯片杂交,比较干扰前后基因表达谱差异,并行GO分析及Pathway分析。结果:六份样本中,共筛选出差异表达基因1731个,其中共同上调基因1154个,共同下调基因577个。差异表达基因中生物进程、细胞成分、分子功能方面均以下调为主。通路分析显示29条通路上调,如细胞黏附、异体排斥、吞噬体。31条通路下调,如mTOR、MAPK、非小细胞肺癌。结论:采用全基因组芯片检测CLU基因干扰后肾癌786-O基因表达谱获得差异表达基因,为以CLU基因为靶点的肾癌基因研究提供了实验依据。     

滋养层细胞的分离培养与鉴定

目的：培养符合实验要求的人绒毛滋养层细胞。方法：胰蛋白酶、胶原酶消化绒毛组织,进行原代培养,用胰蛋白酶消化法进行传代培养并纯化。观察其形态学特征并绘制生长曲线,计算倍增时间。应用光镜、免疫荧光进行细胞鉴定。Tran-swell小室法检测其体外侵袭能力。结果：原代培养滋养层细胞24h贴壁,7~10d首次传代,倍增时间3.42d,细胞表达细胞角蛋白7而不表达波形蛋白。结论：胰蛋白酶、胶原酶消化法可获得符合实验要求的人绒毛滋养层细胞,能建立稳定的人绒毛滋养层细胞体外培养体系。     

体外培养口腔黏膜角化细胞生物学的特性

目的 一个稳定的人类正常口腔黏膜角化细胞体外培养体系对于研究组织工程化口腔黏膜构建及口腔黏膜上皮癌变及阻断有重要意义。研究体外培养的人正常口腔黏膜角化细胞的细胞生物学特性。方法 通过测定细胞生长曲线及克隆形成率了解细胞生长基本规律及其增殖能力，并通过流式细胞仪检测细胞染色休体倍性。结果 细胞接种后第1-3天为静止生长期，第5-10天处于对数生长期，第12天后进入平台期。倍增时间为24-48h；接种密度为200/cm^2时，培养细胞克隆形成率为0.979%。经流式细胞仪检测细胞染色体倍性结果表明原代及传代细胞均为二倍体细胞。结论 体外连续培养的口腔黏膜角化细胞为正常上皮细胞，增殖能力良好。     

犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞可在体外长期稳定培养

背景：体外分离培养获得足够活性良好的种子细胞是构建阴道组织工程的关键。文献报道阴道上皮细胞体外纯化培养和传代较为困难，尤其是体外长期培养犬等大动物的阴道种子细胞尚未见报道。目的：建立体外稳定培养犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞方法。方法：获取犬小块阴道组织，机械分离阴道黏膜上皮，Dispase 酶和胰蛋白酶分步消化收集上皮细胞，接种于无血清角化细胞培养液中培养和传代；机械分离阴道平滑肌组织后采用Ⅱ型胶原酶消化获得平滑肌细胞，在含体积分数10%胎牛血清的 DMEM 培养液中连续培养传代。动态观察上皮细胞和平滑肌细胞生长增殖情况，分别采用特异性抗体行细胞免疫化学染色鉴定。结果与结论：原代培养的上皮细胞24-36 h后开始贴壁铺展，四五天后呈对数生长，七八天可达70%融合，为单一的上皮细胞，呈典型铺路石样，未见成纤维细胞混杂。每四五天可传代1次，连续传代六七次，细胞免疫化学染色角蛋白AEl/AE3抗体阳性。平滑肌细胞原代培养24 h后贴壁呈梭形，此后呈对数生长，4 d后融合呈典型的“峰和谷”样，每三四天可传代1次，连续传代七八次，细胞免疫化学染色示α-肌动蛋白染色阳性。结果证实，犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞可在体外长期稳定培养，可为体外构建组织工程化阴道提供足够的种子细胞。     

用于包装腺相关病毒293细胞的培养

背景:腺相关病毒作为一种主要的基因工程载体,已被广泛应用。但腺相关病毒是缺陷性病毒,需要包装细胞提供E1蛋白。腺相关病毒293细胞作为重要的腺相关病毒特异性包装细胞,能反式产生E1,但腺相关病毒293细胞娇嫩,培养困难,生物学特性易发生改变。因此,有必要建立一种腺相关病毒293细胞的培养方案以满足基因工程的需要。目的:建立一种体外培养腺相关病毒293细胞的方法。设计:开放性实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科。材料:腺相关病毒293细胞株购于Stratagene公司。高糖型DMEM粉(Gibco公司),AAV Helper-Free系统三质粒(Stratagene公司)。方法:实验于2006-10/2007-04在武汉同济医院神经内科实验室完成。在体外将腺相关病毒293细胞复苏,用高糖型DMEM生长培养基培养,当细胞单层融合度达到50%时传代和冻存,并倒置显微镜下观察细胞的生长状态,记录生长曲线。荧光倒置显微镜下观察,根据腺相关病毒293细胞在共转染腺相关病毒系统三质粒后以及被腺相关病毒上清感染后能否激发出绿色荧光,鉴定其包装腺相关病毒的生物学特性。主要观察指标:①腺相关病毒293细胞形态学观察。②生长曲线。③腺相关病毒包装。结果:①倒置显微镜下显示,腺相关病毒293细胞贴壁生长良好,呈现不规则的多角形,胞浆透亮,胞核隐约可见。②生长曲线显示,细胞传代后第1天为生长适应期,2～5d为生长活跃期,6d后细胞进入生长平台期。③荧光倒置显微镜下观察到,腺相关病毒293细胞激发绿色荧光,共转染腺相关病毒系统三质粒成功。腺相关病毒293细胞被腺相关病毒上清感染后激发出绿色荧光,腺相关病毒包装成功。结论:本实验的培养方法简单有用,培养的腺相关病毒293细胞可保持良好的腺相关病毒包装功能。     

胶原酶二步消化法分离培养牛角膜基质成纤维细胞

背景：获得纯度高、活性强、生物学特性更接近体内状态的角膜基质成纤维细胞是角膜损伤后修复研究的基础。目的：探索体外培养牛角膜基质成纤维细胞的新方法。方法：用Ⅰ型胶原酶对牛角膜基质层进行二步消化分离后制成细胞悬液转入培养瓶中培养,取生长良好的细胞进行传代养。采用锥虫蓝染色检测消化分离后细胞即刻存活率;倒置相差显微镜动态观察细胞的生长状态;波形蛋白免疫组织化染色鉴定角膜成纤维细胞;MTT法检测细胞增殖情况;取处于对数生长期的细胞,绘制细胞生长曲线并计算细胞群倍增间。结果与结论：在体外成功分离培养牛角膜基质成纤维细胞,显微镜下观察及波形蛋白免疫组织化学染色后证实所培养的胞为角膜基质成纤维细胞。锥虫蓝染色,细胞即刻成活率达93.5%。细胞生长曲线近似＂S＂形,其群体倍增时间38.70h。说明二步消化法细胞培养技术简便、经济、高效,为原代培养角膜基质成纤维细胞提供了有效渠道。     

贴壁法体外培养大鼠骨髓间质干细胞的生物学特点

目的:观察大鼠骨髓间质干细胞在体外的提取、分离、培养和传代的特征,为进一步的研究工作提供实验基础。方法:实验于2004-06/12在上海第二医科大学附属仁济医院神经病学实验室完成。选取幼年雄性SD大鼠,处死后分离骨髓,采用贴壁法在体外培养、传代、扩增、纯化其骨髓间质干细胞,分别观察原代和传代后第2,4,6,8代的细胞生长情况,并绘制生长曲线和贴壁率曲线。生长曲线:以平均每孔的细胞数(千个)为纵坐标,天数(d)为横坐标;贴壁率曲线:以贴壁率(%)为纵坐标,时间(h)为横坐标。贴壁率又称接种存活率:贴壁率(%)=贴壁细胞数/接种的细胞总数×100%。结果:①骨髓细胞刚接种时呈圆型,24h后可见细胞贴壁,贴壁细胞以单核细胞为主,在72h后逐渐转变为多种形态的细胞。②大鼠骨髓间质干细胞原代细胞第1周生长速度较慢,贴壁时间长,而1周后生长加快;生长曲线及贴壁率曲线显示,传代后7代以内细胞生长速度、贴壁率基本相同;而第8代以后生长速度明显变慢,贴壁率也下降。结论:骨髓间质干细胞有一定的增殖能力,但其增殖不是无限的,为进一步了解和掌握骨髓间质干细胞的生物学特性和研究应用打下基础。     

密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞的形态学观察

目的探讨兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养、鉴定和扩增的方法,同时观察BMSCs的生长特性,为组织工程中种子细胞的选择提供实验基础。方法应用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合分离纯化BMSCs并进行体外扩增,倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况,计数细胞数目,绘制细胞生长曲线。HE染色光镜观察细胞形态,免疫细胞化学方法检测细胞表面标志抗原CD29、CD34和CD44的表达,进行表型鉴定。结果成功地完成了兔BMSCs体外分离培养及扩增。生长特性观察发现,第1～3代细胞增殖能力强,生长旺盛,随着传代次数的增加传代细胞增殖能力逐渐下降。分离培养的BMSCs阳性表达CD29、CD44,阴性表达CD34。结论体外应用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合,可获得高纯度的BMSCs,培养的BMSCs呈纤维状、克隆样生长,第1～3代细胞活性较强,可作为组织工程的种子细胞用于进一步的实验研究。     

体外培养口腔黏膜角化细胞生物学的特性

目的一个稳定的人类正常口腔黏膜角化细胞体外培养体系对于研究组织工程化口腔黏膜构建及口腔黏膜上皮癌变及阻断有重要意义。研究体外培养的人正常口腔黏膜角化细胞的细胞生物学特性。方法通过测定细胞生长曲线及克隆形成率了解细胞生长基本规律及其增殖能力,并通过流式细胞仪检测细胞染色体倍性。结果细胞接种后第1～3天为静止生长期,第5～10天处于对数生长期,第12天后进入平台期。倍增时间为24～48h;接种密度为200/cm2时,培养细胞克隆形成率为0.979%。经流式细胞仪检测细胞染色体倍性结果表明原代及传代细胞均为二倍体细胞。结论体外连续培养的口腔黏膜角化细胞为正常上皮细胞,增殖能力良好。     

大鼠脂肪源性干细胞的分离培养及鉴定

背景：脂肪源性干细胞在体外易于培养,增殖快,具有多向分化潜能。目的：构建一种体外分离培养SD大鼠脂肪源性干细胞的方法,并对其部分生物学特性与表型进行分析。方法：切取SD大鼠腹股沟脂肪垫,应用胶原酶Ⅰ消化,分离大鼠脂肪源性干细胞,进行体外培养、传代,倒置显微镜观察细胞的生长增殖及形态变化,诱导成骨、成脂,分别行碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色及油红O染色,绘制生长曲线及用流式细胞仪检测细胞表面标记。结果与结论：体外培养的脂肪源性干细胞呈梭形,增殖活跃,传代后形态均一,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈＂S＂型。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色阳性;成脂诱导实验组油红O染色阳性;对照组均为阴性。细胞CD29,CD44,CD105表达阳性,CD31,CD45表达阴性。提示SD大鼠腹股沟脂肪垫分离的脂肪源性干细胞在体外易于分离培养和传代扩增,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,并表达间充质干细胞相关的表型。     

大鼠脂肪源性干细胞的分离培养及鉴定

背景:脂肪源性干细胞在体外易于培养,增殖快,具有多向分化潜能。目的:构建一种体外分离培养SD大鼠脂肪源性干细胞的方法,并对其部分生物学特性与表型进行分析。方法:切取SD大鼠腹股沟脂肪垫,应用胶原酶Ⅰ消化,分离大鼠脂肪源性干细胞,进行体外培养、传代,倒置显微镜观察细胞的生长增殖及形态变化,诱导成骨、成脂,分别行碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色及油红O染色,绘制生长曲线及用流式细胞仪检测细胞表面标记。结果与结论:体外培养的脂肪源性干细胞呈梭形,增殖活跃,传代后形态均一,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈"S"型。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色阳性;成脂诱导实验组油红O染色阳性;对照组均为阴性。细胞CD29,CD44,CD105表达阳性,CD31,CD45表达阴性。提示SD大鼠腹股沟脂肪垫分离的脂肪源性干细胞在体外易于分离培养和传代扩增,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,并表达间充质干细胞相关的表型。     

II型胶原酶消化结合组织块贴壁法分离培养兔髓核细胞

背景：椎间盘为负重却缺乏血运的组织,在体外培养过程中存在表型丢失问题,因而容易发生退行性改变,但椎间盘退变的机制尚不明确。 目的：探讨兔髓核细胞分离、贴壁培养、扩增和鉴定的方法,并观察髓核细胞在不同代次的生长特性。 方法：应用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法相结合的方法,分离、纯化髓核细胞并进行体外扩增,用倒置显微镜观察各代细胞的形态、生长状况,计数细胞数量,并绘制细胞生长曲线。苏木精-伊红染色后光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学方法检测细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达情况,并进行细胞鉴定。 结果与结论：成功的实现了兔髓核细胞体外分离、培养及扩增。生长特性观察发现,髓核细胞第1-3代细胞增殖能力强,活力旺盛,但随着传代次数的增加,细胞增殖能力程逐渐下降的趋势。分离培养的髓核细胞阳性表达聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。体外采用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法相结合,可获得高纯度的髓核细胞,培养的髓核细胞呈类圆形或多角形生长,第1-3代细胞生长活性较强。     

贴壁法体外培养大鼠骨髓间质干细胞的生物学特点

目的：观察大鼠骨髓间质干细胞在体外的提取．分离．培养和传代的特征，为进一步的研究工作提供实验基础。方法：实验于2004-06／12在上海第二医科大学附属仁济医院神经病学实验室完成。选取幼年雄性SD大鼠，处死后分离骨髓，采用贴壁法在体外培养、传代、扩增、纯化其骨髓间质干细胞，分别观察原代和传代后第2，4，6，8代的细胞生长情况。并绘制生长曲线和贴壁率曲线。生长曲线：以平均每孔的细胞数（千个）为纵坐标，天数（d）为横坐标；贴壁率曲线：以贴壁率（％）为纵坐标，时间（h）为横坐标。贴壁率又称接种存活率：贴壁率（％）=贴壁细胞数／接种的细胞总数&;#215;100％。结果：①骨髓细胞刚接种时呈圆型，24h后可见细胞贴壁，贴壁细胞以单核细胞为主，在72h后逐渐转变为多种形态的细胞。②大鼠骨髓间质干细胞原代细胞第1周生长速度较慢，贴壁时间长，而1周后生长加快；生长曲线及贴壁率曲线显示，传代后7代以内细胞生长速度、贴壁率基本相同；而第8代以后生长速度明显变慢，贴壁率也下降。结论：骨髓间质干细胞有一定的增殖能力，但其增殖不是无限的，为进一步了解和掌握骨髓间质千细胞的生物学特性和研究应用打下基础。     

兔肌腱细胞的分离、培养及鉴定

背景：肌腱细胞是一种高分化的细胞,其增殖相对缓慢,在体外经多次传代后甚至丧失增殖能力,因此有必要建立肌腱细胞良好的体外分离、培养模式。目的：探讨兔肌腱细胞的分离、培养及鉴定。方法：无菌条件下切取新西兰乳兔趾屈肌腱,显微镜下剥离腱外膜,采用Henderson分步酶消化法分离肌腱细胞,用含体积分数为20%胎牛血清的F-12培养液进行培养、传代。结果与结论：通过不同的酶消化分离可获得较纯肌腱细胞,体外培养细胞表现出良好的细胞增殖能力和传代能力。免疫组织化学染色见分离培养的第2代腱细胞Ⅰ型胶原抗体染色呈阳性,而Ⅲ型胶原抗体染色呈阴性,证明所获细胞为肌腱细胞。提示肌腱细胞能够在体外分离、扩增和传代。     

兔骨髓间充质干细胞生物学特性的实验研究

目的:体外优化获取兔骨髓间充质干细胞并对其进行纯化、扩增,同时对其生物学特性进行研究,获得足量细胞用于材料细胞的相容性研究.方法:抽取新西兰大白兔骨髓,采用密度梯度离心法和贴壁筛选法相结合进行分离培养,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线,测定贴壁率.结果:经密度梯度离心法和贴壁筛选法相结合得到的骨髓间充质干细胞纯度高,性状稳定,生长曲线相似,传代后第12小时贴壁率高达90%;Giemsa染色光镜观察免骨髓间充质干细胞为单核细胞,呈梭形或不规则长多边形.结论:建立兔骨髓间充质干细胞体外分离培养的最适条件,骨髓间充质干细胞增殖能力强,可作为材料细胞相容性研究的受试细胞,并可作为组织工程的种子细胞.