犬内皮与平滑肌细胞的短期静态联合培养

目的:为获得组织工程化自体血管,观察体外静态培养条件下犬内皮细胞与平滑肌细胞联合培养组织学及形态学的特征。方法:实验于2004-07/2005-06在首都医科大学宣武医院外科院级实验室完成。①实验材料:雄性杂种犬,3个月龄,体质量8～12kg。②实验方法:贴块法及酶解法对犬内皮细胞及平滑肌细胞进行原代分离培养及扩增,将第Ⅱ代平滑肌细胞以1×109L-1的密度种植于胶原膜上培养13d,再将第Ⅱ代内皮细胞接种于生长平滑肌细胞的胶原膜上2d。③实验评估:行苏木精-伊红染色同时扫描电镜和透射电镜观察平滑肌细胞和内皮细胞在胶原载体上联合培养后的形态。结果:苏木精-伊红染色见平滑肌细胞较均匀的分布于支架材料表面及内部;扫描电镜下,平滑肌细胞可以在胶原载体材料上生长,增殖明显并在短期内形成多层细胞。内皮细胞与平滑肌细胞联合培养2d就可在平滑肌细胞层表面获得连续的单层内皮细胞层。结论:在短期静态培养条件下犬的血管平滑肌细胞和内皮细胞可以在胶原载体材料上形成具有两层细胞结构的组织工程化动脉血管组织片。     

羟基磷灰石/聚氨酯复合骨诱导再生膜的细胞相容性及自身降解性能

目的:骨诱导再生膜材料对骨组织损伤后的重建和再生起着屏蔽和诱导的作用.拟进一步验证羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA),聚氨酯(Polyurethane,PU)复合骨诱导再生膜体内外的细胞相容性和降解性能.方法:实验于2007-03/07在四川大学华西口腔医学国家重点实验室及四川大学纳米生物材料研究中心完成.①HA/PU复合膜制备成10 mm×10 mm大小,选择成熟的成骨细胞株MG63,体外细胞培养,在1,4,7 d内观察细胞在膜上的生长和增殖情况,并采用MTT法测定细胞的增殖率,判断其细胞的毒性.②把HA/PU复合膜制备成直径1.5 mm大小,选择健康的SD雌性大鼠3只,在脊柱一侧肌肉内埋植HA/PU复合膜,在1,4,12周后取出.以苏木精一伊红染色和Masson染色,组织切片观察材料的细胞相容性和自身降解性.结果:①HA/PU复合膜上细胞增殖良好,无坏死和悬浮细胞出现,细胞在膜上的增殖能力均高于MG63的增殖能力(P＜0.05),细胞毒性为0级.②组织学切片观察,1-4周时材料在体内依旧是有形固体,材料被周围组织包裹,有巨噬细胞聚集,未见多核细胞,胶原纤维逐渐变得致密.12周时,材料发生降解,有纤维组织长入,周围与组织结合良好,未见有炎症发生.结论:HA/PU复合膜具有良好的细胞相容性和自身降解性能,可作为骨组织诱导再生膜材料.     

内皮祖细胞在膀胱细胞外基质上的生长及分化

背景:传统的组织工程膀胱支架材料本身无血管结构,植入体内后面临血管化不足的问题。目的:观察内皮祖细胞与膀胱细胞外基质的生物相容性。方法:分离培养兔内皮祖细胞,种植于兔膀胱细胞外基质上与其复合培养。将复合生长材料植入兔背部皮下检测其组织相容性。结果与结论:兔内皮祖细胞能够在膀胱细胞外基质表面正常黏附、生长、增殖,细胞形态良好。内皮祖细胞-膀胱细胞外基质植入兔体内后1周时,可见材料周围炎症反应明显,粘连严重,出血较多;苏木精-伊红染色可见组织中较多炎性细胞浸润,胶原及弹性纤维排列松散。植入后8周时可见材料已降解成碎细丝状,与周围组织融合生长在一起,但质地略脆,易出血;苏木精-伊红染色可见组织中已无明显炎症细胞浸润反应,胶原及弹性纤维排列紧密并且有新生血管长入其中。结果表明内皮祖细胞与膀胱细胞外基质具有良好的相容性,复合培养物与体内组织具有良好的相容性。     

内皮祖细胞在膀胱细胞外基质上的生长及分化

背景：传统的组织工程膀胱支架材料本身无血管结构,植入体内后面临血管化不足的问题。目的：观察内皮祖细胞与膀胱细胞外基质的生物相容性。方法：分离培养兔内皮祖细胞,种植于兔膀胱细胞外基质上与其复合培养。将复合生长材料植入兔背部皮下检测其组织相容性。结果与结论：兔内皮祖细胞能够在膀胱细胞外基质表面正常黏附、生长、增殖,细胞形态良好。内皮祖细胞-膀胱细胞外基质植入兔体内后1周时,可见材料周围炎症反应明显,粘连严重,出血较多;苏木精-伊红染色可见组织中较多炎性细胞浸润,胶原及弹性纤维排列松散。植入后8周时可见材料已降解成碎细丝状,与周围组织融合生长在一起,但质地略脆,易出血;苏木精-伊红染色可见组织中已无明显炎症细胞浸润反应,胶原及弹性纤维排列紧密并且有新生血管长入其中。结果表明内皮祖细胞与膀胱细胞外基质具有良好的相容性,复合培养物与体内组织具有良好的相容性。     

组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞的特征

目的:采用组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,并应用光镜、电镜和免疫组织化学方法观察细胞各生长时期的形态变化。方法:实验于2004-02/08在中国医科大学基础医学院药理实验室完成。选择健康清洁级Wistar大鼠30只,体质量150～180g,无菌条件下取全段主动脉中膜组织修剪成1mm×1mm大小的组织块直接贴壁于一次性塑料培养皿中,组织块间距0.5cm,保证细胞从组织块游出后有足够的生长空间并保持局部细胞密度的均匀,发现漂起的组织块及时清理,于37℃孵箱内放置1.5h左右使组织块与壁贴附后,缓慢加入改良Eagle培养液培养3～5d,待有细胞从组织块周围游出后换液。当细胞长满培养皿时即可传代。采用倒置相差显微镜和透射电镜及抗α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学方法观察主动脉平滑肌细胞的形态。绘制主动脉平滑肌细胞生长曲线,观察各生长时期的变化,并评估其培养方法的优点。结果:30只大鼠全部进入结果分析。①技术方法优点:贴块方便,直接一次性贴壁使污染机会少,随组织块生长随时清理漂起的组织块,可减少对其他组织块的毒性作用,并增加已游离出的细胞生长空间。②原代培养血管平滑肌细胞:光镜观察形态多样,大小略有差异,胞体较小,胞质折光性强。③传代血管平滑肌细胞:光镜下观察呈现特征性“峰”、“谷”状生长。电镜下观察:细胞形态不规则,胞浆内有肌丝,纵向平行排列,有密区,具备平滑肌细胞特征。免疫组织化学染色后可见细胞浆中大量平行条状棕黄染色、胞核不着色,所有细胞均染色,呈阳性。④主动脉平滑肌细胞生长曲线:血管平滑肌细胞生长曲线近似“S”形,传代后第1天细胞数有所减少,经过2d潜伏适应期后进入对数生长期,持续两三天进入平台期。结论:组织块贴壁法培养技术具有操作简便,污染机会少,有足够细胞生长空间的优点,经光镜和电镜观察培养出新的主动脉血管平滑肌细胞具有平滑肌细胞特征,免疫组织化学染色也显示所有细胞均呈阳性。传代培养后第2天进入对数生长期,持续两三天进入平台期,可产生纯度高及数量多的平滑肌细胞。     

温固化水凝胶复合细胞外基质与膀胱平滑肌细胞的相容性

目的:选用膀胱平滑肌细胞为实验细胞,评估细胞外基质/温度敏感性水凝胶复合支架材料的生物相容性。方法:实验于2005-02/05在武汉大学人民医院泌尿外科研究室完成。①实验分组:实验分为4组。细胞外基质/温度敏感性水凝胶复合支架组:细胞外基质/温度敏感性水凝胶复合支架种植平滑肌细胞;单纯细胞外基质组:单纯细胞外基质种植平滑肌细胞;阴性对照组:单纯培养平滑肌细胞;空白对照组:无细胞培养液。②实验操作:种植细胞前先用培养液将支架材料预湿,取第3代兔膀胱平滑肌细胞悬液(1×108L-1)50μL缓慢接种于材料上。③实验评估:培养2d后倒置相差显微镜下观察细胞黏附、生长情况以及扫描电镜下观察细胞在材料上的空间生长情况;培养5,10d取细胞外基质/温度敏感性水凝胶复合支架组、单纯细胞外基质组材料,进行细胞计数,观察细胞黏附数量;培养1,3,5,7d时MTT法检测细胞的活力。结果:①相差显微镜下可见细胞外基质/温度敏感性水凝胶复合材料为红染的网状结构,纤维较粗,网孔直径较小,未见到细胞碎片;种植平滑肌细胞后6h,可见细胞紧密黏附于材料表面;种植平滑肌细胞后12h,可见细胞已伸展,有多个突起;培养3d时,贴附于材料的细胞数量增加,细胞增殖明显。②扫描电镜下可见发育良好的细胞附于材料上,伪足沿纤维伸展,附着牢固,细胞间连接紧密,可见到细胞外基质分泌。③膀胱平滑肌细胞在单纯细胞外基质上黏附性良好,黏附率为87.6%,复合温度敏感性水凝胶后的细胞外基质表面黏附能力较之增强,黏附率为96.7%。④细胞活力:细胞外基质/温度敏感性水凝胶复合支架组、阴性对照组细胞活力(A)高于单纯细胞外基质组,差异有显著性意义(P<0.05,0.01),培养1,3,5d细胞外基质/温度敏感性水凝胶复合支架组细胞活力(A)低于阴性对照组,培养7d高于阴性对照组,差异有显著性意义(P<0.05,0.01)。结论:细胞外基质/温度敏感性水凝胶复合材料具有便于细胞黏附和生长的微孔结构,生物相容性好,并且保留的某些成分具有良好的促组织再生作用,是一种理想的组织工程材料。     

反复贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞

目的：原代培养鼠主动脉平滑肌细胞，传统贴块法往往由于血管片成功贴壁数少而导致失败或存在培养周期长的缺点。反复血管片贴壁法能够克服以上弊端，本实验拟进一步验证。 方法：实验于2007—03/06在南昌大学第二附属医院江西省分子中心重点实验室完成。①实验方法：健康Wistar大鼠2只，断颈法处死，分离胸主动脉，清除结缔组织，纵向剖开血管去除内皮细胞，继续用力刮可见血管片分为两层，去掉外层，剩下即为所需的中膜组织，剪细置于无菌培养瓶底，组织块间距不超过0．5cm，瓶底朝上，向培养瓶内加入5．0～6．0mL含体积分数为0．15胎牛血清的培养液后，放在大平皿上使瓶口稍朝上，置于37℃孵箱，一次性培养瓶放置1h（普通培养瓶2～3h）后将其缓慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中。当一些组织块周围细胞生长相当密集以致失去特有的梭形形态时，即可按1：1或1：2进行传代。②实验评估：采用相差显微镜观察细胞的生长形态及生长规律。免疫化学法检测α-平滑肌肌动蛋白的表达。 结果：①细胞生长形态：原代培养第3天，贴附良好的血管片周围细胞呈辐射状生长，形态多样。4～10d细胞数量增多，细胞生长至融汇后相互平行排列成束或放射状，血管平滑肌细胞特征性“峰”、“谷”状生长特点尤为明显。细胞生长相当密集而传代。②α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学检测：胞浆内出现肌丝，纵向平行排列有密区，α-平滑肌肌动蛋白免疫化学染色呈阳性（棕色）。 结论：利用反复血管片贴壁法成功进行大鼠主动脉平滑肌细胞的原代培养，具有简便易行、细胞损失小、培养周期短等优点。     

组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞的特征

目的：采用组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞，并应用光镜、电镜和免疫组织化学方法观察细胞各生长时期的形态变化。方法：实验于2004—02／08在中国医科大学基础医学院药理实验室完成。选择健康清洁级Wistar大鼠30只，体质量150—180g，无菌条件下取全段主动脉中膜组织修剪成1mm&;#215;1mm大小的组织块直接贴壁于一次性塑料培养皿中，组织块间距0．5cm，保证细胞从组织块游出后有足够的生长空间并保持局部细胞密度的均匀，发现漂起的组织块及时清理，于37℃孵箱内放置1．5h左右使组织块与壁贴附后，缓慢加入改良Eagle培养液培养3～5d，待有细胞从组织块周围游出后换液。当细胞长满培养皿时即可传代。采用倒置相差显微镜和透射电镜及抗α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学方法观察主动脉平滑肌细胞的形态。绘制主动脉平滑肌细胞生长曲线，观察各生长时期的变化，并评估其培养方法的优点。结果：30只大鼠全部进入结果分析。①技术方法优点：贴块方便，直接一次性贴壁使污染机会少，随组织块生长随时清理漂起的组织块，可减少对其他组织块的毒性作用，并增加已游离出的细胞生长空间。②原代培养血管平滑肌细胞：光镜观察形态多样，大小略有差异，胞体较小，胞质折光性强。③传代血管平滑肌细胞：光镜下观察呈现特征性“峰”、“谷”状生长。电镜下观察：细胞形态不规则，胞浆内有肌丝，纵向平行排列，有密区，具备平滑肌细胞特征。免疫组织化学染色后可见细胞浆中大量平行条状棕黄染色、胞核不着色，所有细胞均染色，呈阳性。④主动脉平滑肌细胞生长曲线：血管平滑肌细胞生长曲线近似“S”形，传代后第1天细胞数有所减少，经过2d潜伏适应期后进入对数生长期，持续两三天进入平台期。结论：组织块贴壁法培养技术具有操作简便，污染机会少，有足够细胞生长空间的优点，经光镜和电镜观察培养出新的主动脉血管平滑肌细胞具有平滑肌细胞特征，免疫组织化学染色也显示所有细胞均呈阳性。传代培养后第2天进入对数生长期，持续两三天进入平台期，可产生纯度高及数量多的平滑肌细胞。     

血管组织工程支架材料的细胞相容性

背景：胶原与透明质酸均有利于组织培养中细胞的黏附、增殖和分化。目的：观察血管内皮细胞、平滑肌细胞与胶胀,透明质酸膜、明胶海绵的细胞相容性,并筛选最佳种植方法。方法：将第3—5代兔缸管平滑肌细胞种植住胶原／透明质酸膜（或明胶海绵）材料上,连续培养2周后将兔内皮细胞接种在平滑肌细胞-胶原／透明质酸膜（或明胶海绵）复合体上,并砹锐竹纯平滑肌细胞与内皮细胞共同接种组。结果与结论：①光镜和扫描电镜观察：细胞在两种材料上均随着培养时间,接种次数增加而生长加快,其中在胶原／透明质酸膜上的细胞生长更好,细胞连接更致密。②WST-1法检测：胶原/透明质酸膜组平滑肌细胞的黏附术及增殖率均高于明胶海绵组（P〈0．05）,且细胞在材料上的生长随着接种次数的增加有不同程度提高。③3H-TDR掺入法检测DNA合成率：在胶原／透明质酸膜上的细胞DNA合成最高,明胶海绵上的较差。表明胶原／透明质酸膜具有较理想的细胞相容性,采用适当间隔、反复接种的方法可提高细胞的黏附和增殖。     

体外构建人工仿生骨膜

背景：小肠黏膜下层既具有良好的生物相容性和降解性,又富含多种生长因子,能明显促进细胞的黏附、增殖及分化,在国外已被广泛应用于骨与软骨、血管、皮肤、膀胱、平滑肌及胰岛等组织的修复,且已表现出良好的组织工程化细胞支架性能。 目的：探讨兔骨髓间充质干细胞经体外诱导成成骨细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜的可行性。方法：采用贴壁筛选法分离2周龄健康新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,并进行体外扩增培养、诱导分化及鉴定。将经成骨诱导分化的骨髓间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜,观察细胞在生物材料上的附着、生长、增殖情况。 结果与结论：接种5 d后,细胞散在附着于小肠黏膜下层材料上,细胞形态呈圆形,细胞之间无连接;10 d后细胞之间形成桥粒连接,成骨细胞伸出突起,与小肠黏膜下层贴附;15 d后细胞增殖,分泌基质,在小肠黏膜下层表面形成多层细胞组成的复层膜样结构。表明将骨髓间充质干细胞诱导成成骨细胞后与猪小肠黏膜下层复合可构建组织工程骨膜,有可能成为理想的组织工程支架材料。     

Compressed collagen gel: a novel scaffold for human bladder cells

Collagen is highly conserved across species and has been used extensively for tissue regeneration; however, its mechanical properties are limited. A recent advance using plastic compression of collagen gels to achieve much higher concentrations significantly increases its mechanical properties at the neo‐tissue level. This controlled, cell‐independent process allows the engineering of biomimetic scaffolds. We have evaluated plastic compressed collagen scaffolds seeded with human bladder smooth muscle cells inside and urothelial cells on the gel surface for potential urological applications. Bladder smooth muscle and urothelial cells were visualized using scanning electron microscopy, conventional histology and immunohistochemistry; cell viability and proliferation were also quantified for 14 days in vitro. Both cell types tested proliferated on the construct surface, forming dense cell layers after 2 weeks. However, smooth muscle cells seeded within the construct, assessed with the Alamar blue assay, showed lower proliferation. Cellular distribution within the construct was also evaluated, using confocal microscopy. After 14 days of in vitro culture, 30% of the smooth muscle cells were found on the construct surface compared to 0% at day 1. Our results provide some evidence that cell‐seeded plastic compressed collagen has significant potential for bladder tissue regeneration, as these materials allow efficient cell seeding inside the construct as well as cell proliferation. Copyright © 2009 John Wiley & Sons, Ltd.     

Penile urethra replacement with autologous cell‐seeded tubularized collagen matrices

Acellular collagen matrices have been used as an onlay material for urethral reconstruction. However, cell‐seeded matrices have been recommended for tubularized urethral repairs. In this study we investigated whether long segmental penile urethral replacement using autologous cell‐seeded tubularized collagen‐based matrix is feasible. Autologous bladder epithelial and smooth muscle cells from nine male rabbits were grown and seeded onto preconfigured tubular matrices constructed from decellularized bladder matrices obtained from lamina propria. The entire anterior penile urethra was resected in 15 rabbits. Urethroplasties were performed with tubularized matrices seeded with cells in nine animals, and with matrices without cells in six. Serial urethrograms were performed at 1, 3 and 6 months. Retrieved urethral tissues were analysed using histo‐ and immunohistochemistry, western blot analyses and organ bath studies. The urethrograms showed that animals implanted with cell‐seeded matrices maintained a wide urethral calibre without strictures. In contrast, the urethras with unseeded scaffolds collapsed and developed strictures. Histologically, a transitional cell layer surrounded by muscle was observed in the cell‐seeded constructs. The epithelial and smooth muscle phenotypes were confirmed with AE1/AE3 and α‐actin antibodies. Organ bath studies of the neourethras confirmed both physiological contractility and the presence of neurotransmitters. Tubularized collagen matrices seeded with autologous cells can be used successfully for long segmental penile urethra replacement, while implantation of tubularized collagen matrices without cells leads to poor tissue development and stricture formation. The cell‐seeded collagen matrices are able to form new tissue, which is histologically similar to native urethra. Copyright © 2012 John Wiley & Sons, Ltd.     

种子细胞在膀胱重建中的研究进展

膀胱组织工程包括三大要素,即细胞支架、种子细胞和讯息因子,而种子细胞在构建组织工程化器官中有着不可替代的作用,是构建组织器官的基本原材料,选择一种既有良好组织相容性又容易获得的种子细胞成为器官重建工作成败的关键所在.目前常用的种子细胞有膀胱移行上皮细胞、膀胱平滑肌细胞、膀胱移行上皮和平滑肌混合细胞、骨髓间充质干细胞,其中后两种细胞较其他细胞更有优势.种子细胞目前存在的问题:①已分化完全的成熟细胞的来源有限和免疫排斥.②已分化完全的成熟细胞在分化培养过程中只能进行有限的分裂传代,如果达到传代的极限,细胞将衰老并死亡;此外还存在去分化问题.③如何将膀胱移行上皮和平滑肌混合细胞、骨髓间充质干细胞培养成正常膀胱仍需进一步分析.     

Plasminogen activator inhibitor is associated with the extracellular matrix of cultured bovine smooth muscle cells.

The extracellular matrix secreted by cultured bovine smooth muscle cells (BSMC) contains an endothelial type plasminogen activator (PA) inhibitor. When PA is incubated with the matrix, a high molecular weight complex containing a truncated PA inhibitor is released into the supernatant. The inhibitor also dissociates from the matrix by treatment with glycine, pH 2.7, in its intact, functionally active, 45-kD form, whereas treatment of the matrix with thrombin results in the release of a cleaved, inactive, 41 kD PA inhibitor. Bowes melanoma cells but not smooth muscle cells cultured on BSMC matrices decrease available matrix associated PA inhibitor. PA inhibitor incorporated into the extracellular matrix may serve an important role in the regulation of plasminogen activator mediated matrix degradation.     

脱细胞羊膜修复兔尿道组织缺损的可行性

背景:脱细胞羊膜的抗原性低,组织相容性好,在眼科眼表疾病及大面积烧伤中有较多的研究和临床应用,但在泌尿系统中的组织缺损修复较少报道.目的:通过脱细胞羊膜修复兔尿道组织的缺损实验,探讨去细胞人羊膜是否能作为修复尿道组织缺损的一种有效安全的支架材料.设计、时间及单位:随机对照动物实验,实验于2007-04/06在广西医科大学动物实验中心完成.材料:新西兰兔32只由广西医科大学动物实验中心提供.新鲜人羊膜取自广西医科大学一附院产科.方法:脱细胞羊膜的制备:新鲜羊膜先使用1%甲醛-0.2%戊二醛交联保护,再使用0.125%胰酶-0.05 mol/L EDTA消化,最后使用0.5%曲拉通洗涤.32只新西兰雄兔分为3组,实验组12只,对照组12只,假手术组8只.前2组制备尿道缺损模型,实验组以脱细胞羊膜修复兔尿道组织缺损,对照组直接吻合尿道,假手术组仅游离尿道组织,不行尿道手术.主要观察指标:术后10,21,42 d行修复尿道病理组织学检查观察上皮细胞血管及平滑肌细胞生长情况,炎症细胞浸润情况.术后42 d行尿道造影﹑尿动力学检查观察尿道压力变化及膀胱容量和称膀胱质量.结果:①制备好的脱细胞羊膜白色半透明,无细胞及碎片残留.②脱细胞羊膜修复兔尿道组织缺损实验组一病理切片检查:10 d脱细胞羊膜周边已有尿道上皮细胞生长,未见急性排斥反应.21 d脱细胞羊膜处尿道表面已被尿道上皮细胞覆盖,小血管生长,炎症细胞浸润减轻.42 d实验组一少量平滑肌长入,血管生长良好,少量炎症细胞.3组尿动力学结果,尿道最高压,尿道最低压比较均无统计学意义(P > 0.05).称膀胱质量,假手术组和对照组膀胱质量差异有统计学意义(P < 0.05).结论:脱细胞羊膜修复兔的尿道组织缺损,上皮细胞和平滑肌细胞生长良好,未出现排斥反应和毒性表现,尿道通畅无狭窄,证实脱细胞羊膜是一种前景良好的尿道组织修复材料.     

Efficient in vivo vascularization of tissue‐engineering scaffolds

The success of tissue engineering depends on the rapid and efficient formation of a functional blood vasculature. Adult blood vessels comprise endothelial cells and perivascular mural cells that assemble into patent tubules ensheathed by a basement membrane during angiogenesis. Using individual vessel components, we characterized intra‐scaffold microvessel self‐assembly efficiency in a physiological in vivo tissue engineering implant context. Primary human microvascular endothelial and vascular smooth muscle cells were seeded at different ratios in poly‐L ‐lactic acid (PLLA) scaffolds enriched with basement membrane proteins (Matrigel) and implanted subcutaneously into immunocompromised mice. Temporal intra‐scaffold microvessel formation, anastomosis and perfusion were monitored by immunohistochemical, flow cytometric and in vivo multiphoton fluorescence microscopy analysis. Vascularization in the tissue‐engineering context was strongly enhanced in implants seeded with a complete complement of blood vessel components: human microvascular endothelial and vascular smooth muscle cells in vivo assembled a patent microvasculature within Matrigel‐enriched PLLA scaffolds that anastomosed with the host circulation during the first week of implantation. Multiphoton fluorescence angiographic analysis of the intra‐scaffold microcirculation showed a uniform, branched microvascular network. 3D image reconstruction analysis of human pulmonary artery smooth muscle cell (hPASMC) distribution within vascularized implants was non‐random and displayed a preferential perivascular localization. Hence, efficient microvessel self‐assembly, anastomosis and establishment of a functional microvasculture in the native hypoxic in vivo tissue engineering context is promoted by providing a complete set of vascular components. Copyright © 2010 John Wiley & Sons, Ltd.     

成人外周血平滑肌祖细胞与成熟血管平滑肌细胞生物学特性的比较

背景:血管平滑肌细胞是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分.研究表明从外周血获得的平滑肌祖细胞可分化为血管平滑肌细胞.目的:课题特点在于选择成人外周血来源的平滑肌祖细胞,并与成熟血管平滑肌细胞进行细胞形态、增殖潜能等方面异同点的比较.设计、时间及地点:以细胞为培养对象,观察性实验,于2008-10/2009-04在江西省分子医学重点实验室完成.材料:采取6名健康志愿者外周血20mL,6名下肢大隐静脉曲张患者大隐静脉.方法:分离成人外周血单个核细胞,用纤粘连蛋白、血小板衍生生长因子BB和EGM培养基诱导培养;同期用胶原酶消化大隐静脉获得平滑肌细胞,用高糖DMEM培养基培养.主要观察指标:观察细胞形态,用细胞免疫荧光法和反转录-聚合酶链反应法检测α-SMA和calponin1的表达,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖能力.结果:成人外周血中平滑肌祖细胞具有血管平滑肌细胞的生物学特性,表达α-SMA和calponin1,平滑肌祖细胞增殖能力明显强于血管平滑肌细胞的增殖能力.结论:成人外周血中单核细胞在血小板衍生生长因子BB的刺激下可以分化为平滑肌祖细胞,且平滑肌祖细胞较平滑肌细胞增殖旺盛,长时间培养不易老化,具有发展为一种理想的血管组织工程种子细胞来源的可能性.