核转运蛋白2慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的探索构建针对人类核转运蛋白2(KPNA2)基因的重组慢病毒干扰RNA(sh RNA)载体的方法,研究其对人骨肉瘤细胞株MG63的沉默效率。方法针对KPNA2基因设计小片段干扰序列。加入AgeⅠ酶和Eco RⅠ酶酶切位点,根据设计好的序列合成单链DNA oligo并退火合成双链DNA oligo。将合成好的双链DNA oligo与GV115载体重组,形成GV115-sh RNA慢病毒载体。聚合酶链式反应(PCR)法鉴定筛选出阳性重组子,经测序后包装慢病毒载体。荧光法测定病毒滴度,重组慢病毒感染骨肉瘤细胞株MG63,通过显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达来计算其转染效率。RT-PCR法检测重组慢病毒RNA干扰载体对人骨肉瘤细胞株MG63中KPNA2表达的沉默效率。实验结果数据以均数±标准差(sx±)表示,应用SPSS 13.0统计软件分析,两组均数间的比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计意义。结果经PCR分析和测序证实,成功构建KPNA2基因重组慢病毒RNA干扰载体;荧光法测定病毒滴度为4×108 TU/ml;荧光显微镜下观察GFP,显示细胞感染效率达到80%以上;RT-PCR检测对照组及实验组KPNA2 m RNA表达分别为0.991±0.087 vs.0.216±0.012,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 KPNA2基因重组慢病毒RNA干扰载体构建成功,并有效干扰人骨肉瘤细胞株MG63中KPNA2 m RNA的表达。     

RNA干扰环氧化酶-2抑制人表皮样喉癌细胞系增殖和侵袭的研究

目的构建沉默环氧化酶-2(COX-2)基因重组慢病毒,观察其体外侵袭的抑制作用,从而探讨干扰COX-2抑制喉癌细胞增殖的作用机理,为喉癌的治疗提供新的思路。方法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测COX-2基因在人表皮样喉癌细胞(Hep-2)中的表达情况。利用上海吉凯公司RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体系统,构建针对COX-2基因慢病毒RNAi表达载体。转染Hep-2细胞,干扰COX-2基因的表达,实时定量PCR检测干扰前后基因表达变化。利用生长曲线测定干扰载体转染前后细胞生长速度变化。流式细胞仪检测细胞的生长周期。Boyden侵袭小室法测定体外侵袭力。结果成功构建了COX-2慢病毒RNAi表达载体,并建立了干扰COX-2基因的Hep-2细胞系。实时定量PCR检测COX-2基因在Hep-2细胞系中过表达被显著抑制。生长曲线测定,COX-2基因干扰后细胞增殖明显变慢。流式细胞仪检测细胞的生长周期可见干扰组诱导Hep-2细胞凋亡,转染G0～G1期细胞数量明显上升,S期细胞减少,表明siRNA干扰Hep-2细胞后,细胞由G0～G1期进入到S期受到阻滞,细胞增殖速度下降。体外侵袭实验中,Hep-2-AS侵袭细胞数(31.0±1.8)显著低于Hep-2细胞(104.0±2.6)及Hep-2-P细胞(99.0±2.7),差异有统计学意义(P<0.05)。结论喉癌中过表达的COX-2基因被干扰后表达明显降低并显著抑制细胞的生长速度和侵袭能力。同时验证了COX-2基因RNA干扰在进行抗肿瘤的治疗中潜在的应用前景。     

慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制膀胱癌EJ细胞增殖及转移

目的探讨慢病毒介导的Clusterin（CLU）基因沉默的RNA干扰效果及其对膀胱癌EJ细胞增殖和转移的影响。方法构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,用Westernblot检测其对膀胱尿路上皮癌细胞株EJ的干扰效果,用MTT、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验等方法分别检测CLU沉默后膀胱癌EJ细胞在增殖、侵袭和转移等方面的细胞生物学改变。结果靶向CLU基因的慢病毒干扰载体感染膀胱癌EJ细胞后,CLU基因在蛋白水平的表达明显下降。EJ细胞的增殖、侵袭和转移能力均受到抑制。结论 CLU慢病毒干扰载体可有效沉默膀胱癌EJ细胞内源性CLU基因,抑制膀胱癌EJ细胞的增殖、侵袭和转移。     

OCT4A基因对K562细胞生物学活性的影响

目的:探讨OCT4A基因体外对K562细胞生物学行为的影响及与凋亡相关的分子机制。方法:克隆人OCT4A基因,构建靶向上调及下调OCT4A基因与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组慢病毒表达载体p LVX-OCT4A-Zs Green1、PLB-OCT4A sh RNA,三质粒包装系统包装病毒,并测定滴度。实验分为空白对照、p LVX空质粒、p LVX-OCT4A-Zs Green1、PLB-OCT4A sh RNA和非特异sh RNA共5组。Western-blot检测各组OCT4A蛋白表达。CCK-8法绘制各组细胞增殖曲线。采用Annexin V/7-AAD标记流式细胞术检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞分化抗原CD11b和CD15表达;实时定量PCR检测caspase3、BIM、BCL-x L和BAX m RNA表达变化。结果:成功克隆人OCT4A基因,并成功构建重组慢病毒载体p LVX-OCT4A-Zs Green1和PLB-OCT4A sh RNA。Western blot证实2种病毒感染后可分别有效上调及下调OCT4A蛋白的表达。CCK-8法检测显示,p LVX-OCT4A-Zs Green1组K562细胞体外增殖活性明显升高,而p LVX-OCT4A sh RNA组K562细胞增殖活性显著降低(P0.05)。感染后p LVX-OCT4A-Zs Green1和PLB-OCT4A sh RNA 2组K562细胞凋亡率分别为(3.48±0.52)%和(7.25±0.57)%(P0.05),而OCT4A过表达及抑制后细胞表面分化抗原CD15、CD11b的表达无明显变化。OCT4A上调后Caspase-3、BIM、BAX较对照组均下调,但差异无统计学意义(P0.05),而BCL-x L基因表达则明显升高(P0.01)。结论:成功构建重组慢病毒载体p LVX-OCT4A-Zs Green1及PLB-OCT4A sh RNA,它们可分别有效地上调及下调OCT4A蛋白表达。OCT4A基因可促进K562细胞的增殖、抑制凋亡,其抑制凋亡机制可能与BCL-x L基因上调有关。     

核糖体结合蛋白1干扰慢病毒载体的构建及其对人肝癌细胞的干扰效应

目的构建核糖体结合蛋白1(RPN1)的干扰慢病毒载体,建立下调RPN1表达的肝癌细胞系。方法运用分子克隆针对RPN1基因构建干扰慢病毒载体,通过与病毒包装辅助质粒共感染293T细胞包装病毒,高速离心浓缩病毒,免疫荧光方式测定病毒滴度,感染Huh7.5.1肝癌细胞系,实时荧光定量PCR(RTqPCR)测定病毒干扰效果。结果成功构建并包装RPN1RNA干扰慢病毒,病毒滴度为2×10~9 TU/mL,感染Huh7.5.1细胞后阳性率大于90.0%。相对于阴性对照,RPN1RNA干扰慢病毒组RPN1基因表达敲减效率达到92.4%(P0.05)。结论成功构建并包装了RPN1干扰慢病毒,建立下调RPN1表达的人肝癌细胞株。     

大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定

背景:最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖(NG2)在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达。目的:构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率。方法:选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成OligoDNA,退火形成双链DNA,与HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将重组载体与pHelper1.0载体、pHelper2.0载体通过lipofectamineTM2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩。采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度。将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96h提取细胞总蛋白,采用Westernblot检测NG2的表达。结果与结论:经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi。包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011TU/L。Westernblot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%(P<0.05)。结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

shRNA介导BTLA基因沉默对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

目的 探讨RNA干扰负性共刺激分子B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)表达后小鼠淋巴细胞增殖的变化.方法 构建小鼠BTLA基因小发夹RNA(shRNA)质粒载体pSiencer 3.1-BTLA/shRNA,与H1启动子共同亚克隆至慢病毒载体pLB,包装病毒后转导小鼠脾淋巴细胞,流式细胞术(FCM)检测感染效率及BTLA分子表达水平.以刀豆蛋白A(ConA)及抗CD3单抗刺激BTLA shRNA干扰组为实验组,以未行基因沉默组为对照组,CCK-8法测定各组淋巴细胞增殖水平.结果 成功构建3个pLB-BTLA shRNA慢病毒干扰载体和一个非特异性shRNA载体,并制备高滴度病毒.特异性shRNA干扰组BTLA表达水平较对照组明显降低(约40%).抗CD3单抗刺激BTLA shRNA转染的淋巴细胞后增殖水平(A450值)显著增高(3.80±0.58),与未转染shRNA对照组(2.42±0.72)相比差异有统计学意义(P＜0.05),而ConA刺激后细胞增殖水平shRNA转染组与未转染组相比差异无统计学意义(P＞0.05);组间相比,BTLA基因沉默的小鼠脾淋巴细胞经抗CD3单抗处理后细胞增殖水平较ConA处理组明显增高(P＜0.05).结论 慢病毒载体携带的特异性shRNA可有效干扰小鼠脾淋巴细胞BTLA基因的表达,BTLA基因沉默对淋巴细胞增殖具有促进作用.     

携带TRAIL基因慢病毒载体的构建及其体外感染淋巴瘤细胞效率

本研究目的构建携带人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因的慢病毒载体,并研究其对不同细胞系的淋巴瘤细胞的感染效率。采用分子克隆技术,将针对TRAIL基因mRNA的cDNA片段插入到克隆载体pGM-T,构建pGM-T-TRAIL,然后将测序正确的TRAIL基因克隆至慢病毒表达载体pWPI,构建慢病毒表达载体pWPI-TRAIL。最后利用pWPI/VSV-G/Δ8.2慢病毒包装系统,通过转染293T细胞,制备重组慢病毒plenti-TRAIL,并进行浓缩和滴度测定。将重组慢病毒载体感染不同来源的淋巴瘤细胞系,测定荧光表达评价感染效率,利用RT-PCR和Western blot法评价TRAIL基因的表达情况。结果表明,酶切鉴定及测序结果表明pGM-T-TRAIL和pWPI-TRAIL载体构建成功,滴度测定结果显示浓缩的重组慢病毒plenti-TRAIL浓度可达109IU/ml。感染效率结果显示YTS细胞较DOHH2和Jurkat细胞更易被慢病毒感染(P<0.05)。RT-PCR和Western blot实验表明淋巴瘤细胞后plenti-TRAIL感染后可有效地表达TRAIL基因。结论:成功构建了慢病毒表达载体pWPI-TRAIL,并制备出重组慢病毒plenti-TRAIL。plenti-TRAIL可以有效感染不同细胞来源的淋巴瘤细胞系,同时感染后的淋巴瘤细胞可以有效表达TRAIL基因。     

小鼠单核巨噬细胞Ufm1基因shRNA慢病毒载体构建及鉴定

目的 构建小鼠Ufm1基因RNA干扰慢病毒载体,并实现该基因在小鼠单核巨噬细胞系（RAW264.7）中的稳定表达抑制.方法 根据小鼠Ufm1基因设计两条RNA干扰序列,合成靶序列双链DNA,与pFU-GW-RNAi载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.pFU-GW-RNAi载体、pHelper 1.0载体及pHelper 2.0载体共转染293T细胞包装产生慢病毒颗粒,并测定其滴度,随后感染RAW264.7细胞,建立稳定转染细胞株.将RAW264.7细胞分为空白组、阴性对照组及RNA干扰慢病毒感染组,用Real-time PCR检测Ufm1基因mRNA的表达量.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,shRNA片段完全正确插入慢病毒载体pFU-GW-RNAi中.在荧光显微镜下观察可见,293T细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为9×105 TU/μl.重组慢病毒感染RAW264.7后,用Real-time PCR检测到Ufm1基因mRNA的表达受到抑制.结论 成功构建了小鼠RNA干扰慢病毒载体,并能够在RAW264.7细胞中有效沉默靶基因.     

慢病毒介导的RNA干扰抑制PAR2表达影响结肠癌细胞SW620增殖与迁移

目的构建人蛋白酶激活受体2(protease-activated receptor 2,PAR2)RNA干扰(RNAi)的重组慢病毒表达载体,探讨PAR2在结肠癌细胞SW620增殖与迁移中的作用。方法根据PAR2基因信息,设计4条PAR2 RNAi片段及1条阴性对照片段,western blotting筛选有效干扰片段,于293T细胞进行病毒包装,采用real-time PCR及western blotting检测干扰效率。PAR2激动剂(PAR2-AP)刺激感染后的SW620细胞,通过流式细胞仪、Transwell试验分别检测细胞周期及细胞迁移能力。结果构建的PAR2-RNAi慢病毒颗粒感染SW620细胞后,PAR2 mRNA及蛋白表达均被明显抑制。与对照相比,PAR2-AP不能促进感染后的SW620细胞增殖,细胞各周期比率未见明显差异,迁移试验结果显示穿膜细胞数也未见明显增多。结论成功构建的PAR2-RNAi慢病毒颗粒能显著抑制结肠癌细胞SW620的PAR2表达,进而阻断PAR2-AP对细胞增殖与迁移的促进效应,证明PAR2在SW620细胞增殖与迁移过程中发挥重要作用。     

大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定

背景：最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖（NG2）在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达。目的：构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率。方法：选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成OligoDNA,退火形成双链DNA,与HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将重组载体与pHelper1.0载体、pHelper2.0载体通过lipofectamineTM2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩。采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度。将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96h提取细胞总蛋白,采用Westernblot检测NG2的表达。结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi。包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011TU/L。Westernblot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%（P〈0.05）。结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

白血病人的gfi-1表达及慢病毒介导的gfi-1基因沉默对K562细胞增殖的影响

本研究旨在检测独立生长因子(Gfi-1)在白血病患者的表达水平并探讨慢病毒介导的gfi-1基因沉默对人白血病细胞株K562增殖的影响。采用荧光实时定量PCR及Westernblot方法检测初治白血病患者gfi-1的表达水平,分析其在各型白血病中的表达情况。设计、合成一对针对gfi-1 mRNA的shRNA序列,退火后连接到pLVTHM干扰载体上,与psPAX2、PDM2G共转HEK293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染K562细胞,建立稳定株。应用实时定量PCR和Western blot方法检测K562细胞gfi-1及baxmRNA和蛋白的表达,并与对照组进行比较.结果表明:慢病毒介导的shgfi-1能明显降低gfi-1的mRNA及蛋白水平,而bax的mRNA及蛋白水平则都上调。CCK-8检测发现,与对照组相比,shgfi-1能明显抑制K562细胞的增殖。结论:gfi-1在初治白血病患者中的高表达可能参与白血病的发生发展。gfi-1特异的shRNA干扰可以有效地下调K562细胞gfi-1基因的表达,抑制K562细胞的增殖,gfi-1基因可能是白血病基因治疗的一个有效靶点。     

沉默Toll样受体4基因表达的RNAi慢病毒载体的构建

背景：Toll样受体4（toll-like receptor4,TLR4）是介导内毒素/脂多糖应答的主要受体,在由内毒素诱导的炎性反应的信号通路中发挥着重要作用。目的：构建人TLR4基因的RNA干扰慢病毒载体,并观察其对人脐静脉内皮细胞TLR4在蛋白水平的沉默效应。方法：利用Invitrogen在线软件设计人TLR4基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核苷酸后克隆到线性载体pENTRTM/H1/TO的黏性末端,并进行DNA测序。得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组反应,从而获得干扰TLR4基因真核表达的慢病毒载体。在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助复合体和TLR4基因的真核表达慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人脐静脉内皮细胞,检验其干扰TLR4基因表达的有效性。结果与结论：实验成功构建TLR4基因真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8.7×106U/mL。免疫印迹杂交结果表明,所获得的慢病毒感染人脐静脉内皮细胞TLR4基因在蛋白水平的表达显著降低。实验成功构建了人TLR4基因慢病毒RNA干扰表达载体,并验证了其在人脐静脉内皮细胞上的有效性。     

脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景：慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率。目的：构建并鉴定脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体。方法：针对脯氨酰羟化酶2基因序列设计RNA干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的pGCSIL-GFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA干扰慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果与结论：PCR和DNA测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP载体。说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA干扰慢病毒载体。     

靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索EZH2基因的作用的研究做准备。方法根据EZH2 mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中,经测序证明与设计相同。结论成功构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体,为进一步研究EZH2基因在肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。     

核干细胞因子RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建核干细胞因子基因RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒表达载体并对其在白血病细胞株中的干扰效果进行鉴定,为后期研究奠定基础.方法 针对核干细胞因子基因的序列设计RNAi有效靶点,合成含RNA干扰序列、Loop环、Age I和EcoR I酶切位点,以及终止信号的单链DNA oligo,经退火形成双链DNA,与双酶切线性化的带有GFP荧光标记和嘌呤霉素抗性标记的GV248慢病毒空载体进行连接产生重组慢病毒载体,转化感受态细菌,挑取重组阳性转化子进行菌落PCR反应,并对PCR阳性克隆进行测序.将重组慢病毒载体及其两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0和pHelper2.0共转染293T细胞进行病毒的包装,收集、浓缩病毒液后测定其滴度,并转染HL-60、NB4以及K562等三种人白血病细胞株,倒置荧光显微镜下观察其转染效率,real-time PCR检测核干细胞因子基因的敲减效率.结果 经测序证实正确构建出了核干细胞因子基因的RNAi重组慢病毒载体,包装、浓缩后其滴度为4×108 TU/ml,荧光显微镜下显示其能有效转染进入HL-60、NB4及K562等白血病细胞株中,转染效率均在80％以上;real-time PCR显示转染后核干细胞因子基因mRNA表达水平较阴性对照组显著下降（P＜0.05）,在HL-60、NB4和K562细胞中核干细胞因子基因的抑制效率分别为52.3％、80.5％、62.3％.结论 成功构建出了核干细胞因子基因的RNAi慢病毒载体,其能有效干扰人白血病细胞株HL-60、NB4及K562中的核干细胞因子基因表达.     

慢病毒介导RNAi干扰β-catenin对小鼠骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

本研究通过构建β-连环蛋白（β-catenin）特异的RNAi慢病毒表达载体,探讨阻断Wnt／β-catenin信号通路对骨髓间充质干细胞（MSC）生物学行为的影响。设计3对针对β-cateninmRNA不同位点的shRNA编码序列,分别连接到慢病毒载体质粒PLB中,构建PLB-β-catenin／shRNAl,PLB-β-catenin／shRNA2和PLB-β-catenin／shR-NA3;将重组质粒与慢病毒包装质粒及包膜蛋白质粒共转染293FT细胞,收获病毒颗粒,浓缩后测定病毒滴度,感染Msc细胞,并应用流式细胞术分选GFP阳性细胞,Westernblot和RT-PCR验证其对细胞内β-catenin基因表达的抑制效果,筛选干扰效率最高质粒;CCK-8法检测细胞增殖,Annexin-V／7-AAD法检测干扰后细胞凋亡情况,细胞划痕实验及Transwell实验检测MSC迁移能力。结果表明：构建的特异性慢病毒siRNA干扰组（PLB-β-catenin／shRNA2）能有效抑制β-catenin的mRNA和蛋白表达,并抑制细胞的增殖;而空载体对照组（PLBgroup）和正常对照组（controlgroup）细胞增殖无明显变化,两组之间无显著的统计学差异（P〉0．05）;流式细胞术检测结果显示,采用血清饥饿法处理后,干扰组细胞的凋亡率明显增加,但两对照组之间无统计学差异（P〉0．05）;细胞划痕和Tran-swell实验显示,干扰组MSC的迁移能力明显降低,对照组细胞迁移能力无明显变化。结论：构建的特异RNAi慢病毒能够有效抑制β-catenin基因的表达,减少细胞内目的基因mRNA和蛋白的水平,从而对MSC细胞的增殖、凋亡和迁移能力产生重要影响。     

NOB1影响胶质瘤细胞增殖、凋亡的实验研究

目的 利用RNA干扰（RNAi）在人胶质瘤U251和U87-MG细胞中沉默NOB1基因的表达,探讨NOB1对恶性胶质瘤细胞增殖以及凋亡的影响.方法 构建NOB1基因的短发卡（shRNA）慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒并感染人胶质瘤U251和U87-MG细胞,采用实时定量聚合酶链反应检测NOB1在恶性胶质瘤细胞系中的表达.采用甲基噻唑基四唑（MTT）比色法和克隆形成实验检测细胞增殖和克隆形成能力情况;同时利用PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡情况,观察NOB1基因对U251和U87-MG细胞增殖、凋亡的影响.结果 NOB1基因在人胶质瘤U251、U87-MG细胞系中均明显高表达.NOB1-shRNA慢病毒能有效感染胶质瘤细胞,实验结果显示感染后U251和U87-MG细胞的增殖能力明显下降;U251克隆形成能力明显受到抑制;细胞周期在G0/G1停滞,而且细胞出现显著性凋亡;上述差异均具有统计学意义（P＜0.05）.结论 NOB1在人胶质瘤U251和U87-MG细胞中高表达;降低NOB1基因的表达,可以显著降低胶质瘤细胞的增殖,并促进胶质瘤细胞凋亡;NOB1基因在体外对胶质瘤细胞的发生发展可能具有癌基因的调节作用.     

富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1基因特异性RNA干扰表达载体的构建、鉴定和稳定株筛选

背景：有研究表明富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1（leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains1,LRIG1）基因在神经胶质瘤细胞中呈低表达,LRIG1基因过表达后对神经胶质瘤细胞的LRIG1mRNA和蛋白表达均明显增强和抑制其生物学行为,但却很少有研究从阻断LRIG1基因的表达的角度进行论证。目的：构建针对LRIG1基因的特异性RNA干扰质粒,稳定转染人脑胶质瘤GL15细胞系,观察其对目的基因LRIG1表达的影响。方法：根据GenBank提供的LRIG1基因序列设计2条RNA干扰序列,命名为LRIG1-shRNA1和LRIG1-shRNA2,并设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为pGenesil2-negativeshRNA。合成各自的寡核苷酸链,退火后与pGenesil2质粒载体连接,转化扩增后测定序列。用不同浓度的G418作用于GL15细胞确定G418对GL15细胞的筛选浓度。将3种重组表达载体转染GL15细胞,G418筛选后挑单克隆并扩增获得稳定株。Western blot检测LRIG1蛋白的表达。结果与结论：构建的重组pGenesil2-LRIG1-shRNA质粒经限制性酶切及DNA测序分析证明其序列插入正确。转染pGenesil2-LRIG1-shRNA1（LRIG11）细胞和pGenesil2-LRIG1-shRNA2（LRIG12）细胞LRIG1蛋白表达水平较阴性对照组pGenesil2-negativeshRNA分别下降47.9%（P〈0.01）和32.8%（P〉0.05）。结果证实,实验成功构建了针对LRIG1基因的特异性shRNA表达载体pGenesil2-LRIG1-shRNA1,其转染GL15细胞后可抑制LRIG1的表达。