红细胞生成素和重组细胞因子对动员后外周血造血祖细胞、红系爆式祖细胞和粒巨噬系祖细胞的集落形成和自我更新的作用

本研究探讨红细胞生成素（EPO）和重组细胞因子（G－CSF，SCF，IL－3和GM－CSF）对患者和健康供者动员后的外周造血祖细胞的红系爆式祖细胞（BFU－E）和粒巨噬系祖细胞（CFU－GM）的集落形成和自我更新的作用。为了更好的了解上述那一种细胞因子和如何联合对干细胞的扩增更为有效，采用甲基纤维素半固体培养法，观察在单独用EPO、G－CSF的基础上，比较联合SCF，IL－3和GM－CSF对BFU－E和CFU－GM的作用。结果显示：①在EPO＋IL－3和EPO＋SCF＋IL－3组，外周血BFU－E自我更新显著增加，而EPO＋SCF组则明显增加。②患者与正常供者之间BFU－E的自我更新无显著差别。③G－CSF联合SCR，IL－3和GM－CSF后CFU－GM集落形成显著增加。患者组仅G－CSF本身可使CFU－GM集落形成显著增加，而G－CSF＋SCF和GMix组CFU－GM集落形成明显增加。④当G－CSF联合SCF，IL－3和GM－CSF可能显著增加CFU－GM的自我更新（AUC）。GMix是CFU－GM的集落形成和祖细胞扩增的较佳组合。⑤正常供者比患者有较高的AUC即自我更新，特别是在G－CSF组比患者具有显著差异（P＝0．0067）。     

红细胞造血过程中因子调控及胞内信号转导

由髓系造血干／祖细胞开始的红细胞造血经历了大约3个阶段．首先是定向分化为红系爆式集落形成单位（BFU—E），然后分化为红系祖细胞集落形成单位（CFU—E），最后逐渐成熟，成为形态上可辨认的幼稚红细胞到去核红细胞。该过程受到多种因子调控并伴有复杂的胞内信号转导。现对该方面研究进展综述如下。     

成骨生长肽对红系造血祖细胞的体外促增殖作用

目的：通过研究人工合成成骨生长肽(sOGP)对红系造血祖细胞的体外促增殖作用，初步探索sOGP促造血活性的作用环节。方法：将正常小鼠和人骨髓有核细胞在标准红系祖细胞基础培养基中进行培养，设定sOGP的不同浓度梯度，于培养48h后计数小鼠CFU—E集落数，培养第4天与第14天计数人CFU—E、BFU—E集落数，将数据与空白对照组及EPO阳性对照组进行比较。结果：sOGP能够有效促进小鼠CFU—E及人CFU—E、BFU—E的体外增殖，量效关系明显，其有效作用浓度范围为10^-16～10^-10mol／L，高峰浓度约为10^-14～1011^-12 mol／L，呈低浓度、广范围及双相作用的特点。但是，sOGP对红系造血祖细胞的体外促增殖效果要弱于阳性对照药EPO。结论：sOGP能够在体外有效地促进红系造血祖细胞的增殖，可能是通过对骨髓基质细胞的作用而促进造血和造骨。     

黄芪注射液影响贫血小鼠粒单系、红系造血及作用机制的探讨

目的：研究黄芪注射液对贫血小鼠粒单系和红系血发生的影响,并探讨其作用机制。方法：制备贫血小鼠模型,随机分为给药组和对照组,采用造血祖细胞体外培养等实验血液学技术。结果：一定浓度的黄芪注射液体内作用可使贫血小鼠血清集落刺激因子（CSF）水平明显升高,刺激贫血小鼠粒单系、红系造血祖细胞增殖和分化以及骨髓基质细胞增殖,使降低的骨髓有核细胞（BMC）数以及外周血象明显回升,黄芪注射液和造血细胞直接一起孵育对粒单系祖细胞（CFU－GM）和红系祖细胞（CFU－E、BFU－E）的产率无明显影响。结论：一定浓度的黄芪注射液体内作用可促进贫血小鼠粒单系和红系造血功能恢复。     

低剂量辐射对造血系统兴奋效应的研究

目的 探讨低剂量辐射对造血系统的兴奋效应。方法 采用深部X线对小鼠进行低剂量辐射,甲基纤维素半固体培养造血祖细胞,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中GM－CSF、IL－3水平变化,脾组织切片原位杂交、脾细胞RNA狭缝杂交、Northern blot检测GM－CSF、G－CSF和IL－3的mRNA表达水平。结果 ①受照后小鼠造血细胞体外培养中CFU－GM和BFU－E数量明显增多;②血清中GM－CSF水平升高;③GM－CSF、G－CSF的转录升高。结论 低剂量辐射对造血系统有兴奋效应,这种兴奋效应可能与造血刺激因子升高有关。     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症病人骨髓粒-巨噬细胞系祖细胞的特点

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是后天的细胞膜缺陷性疾病。这种缺陷累及红细胞、粒细胞和血小板,还累及骨髓造血祖细胞。本实验采用造血祖细胞体外培养技术研究PNH病人骨髓粒-巨噬细胞系祖细胞(CFU—GM)的增殖能力;骨髓细胞经新鲜酸化AB型血清处理后培养的CFU—GM的增殖能力;以及CFU—GM对粒-巨噬细胞系集落刺激因子(GM—CSF)的反应能力,以     

FL与SCF、IL-3、GM-CSF及EPO协同调控脐血造血干/祖细胞的体外扩增

目的　探讨造血细胞因子的不同组合对脐血造血干 /祖细胞的扩增作用。方法　应用免疫磁珠法分离纯化脐血CD3 4+ 造血干 /祖细胞 ,在体外液体培养体系中经各种不同细胞因子组合扩增 1周 ,用流式细胞仪检测CD3 4+ 造血干 /祖细胞并进行甲基纤维素法半固体培养 2周 ,在倒置显微镜下计数集落产率。结果　在FL、SCF、IL 3、GM CSF、EPO造血细胞因子的不同组合下脐血造血干 /祖细胞得以扩增 ,以IL 3+SCF +FL +EPO组的扩增效率最高 ,其有核细胞数、CD3 4+ 细胞及CFU GM、BFU E集落分别扩增 46 2± 175、3.47± 1.6 4、2 6 4± 10 5和 12 8± 6 7倍。结论　FL对扩增CD+ 3 4细胞具有较强的协同作用 ,合理的细胞因子组合扩增的脐血造血干 /祖细胞可成为异基因造血干细胞移植的主要来源。     

脐血造血干/祖细胞冷藏效果的比较研究

目的：探讨脐血细胞和1.064g/L ficoll分离的脐血造血干／祖细胞（简称1064脐血造血干／祖细胞）在不同冷藏条件下的效果。方法：21例脐血和12例1064例脐血造血干／祖细胞在4℃保存；16例1064脐血造血干／祖细胞分别冷藏在－80℃和－196℃，观察不同时间造血细胞活性；单个核细胞（MNC）采用自动血细胞分析仪测定，CD34^ 细胞采用流式细胞技术（FCM）测定，体外造血细胞培养技术分析粒－单系祖细胞（CFU－GM）和红系祖细胞（CFU－E)产率，台盼蓝着色法判断造血细胞活率。结果：脐血细胞在4℃保存第1、2d时，MNC、细胞活率、CFU－GM和CFU－E产率均无明显改变，第3d-5d CFU-GM和CFU－E产率明显下降；1064脐血造血干／祖细胞在4℃保存第3d出现CFU－GM和CFU－E的下降，至第5d下降更显著；1064脐血造血干／祖细胞冷藏在－80℃和－196℃，在半年内CFU－GM、CFU－E、CD34^ 细胞及细胞周期无显著变化，在－80℃冷藏一年时，CFU－GM、CFU－E和CD34^ 阳性细胞下降显著，而－196℃储藏一年时，上述指标及细胞周期无明显改变，98％以上的细胞处在G0－G1期。结论：脐血细胞4℃保存时间不宜超过3d；1064脐血造血干／祖细胞于－80℃和－196℃冷藏在半年内效果一致；－196℃长期冷藏脐血造血干／祖细胞是一种最可靠的方法，但－80℃冷藏脐血造血细胞是一种值得会尝试和实用、费用低的有效方法。     

血管紧张素Ⅱ对脐血CD34+细胞体外扩增的作用

血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )是肾素 血管紧张素系统的一种主要生物活性物质。为了研究它在造血系统中的影响 ,本实验通过体外细胞培养的方法 ,探讨AngⅡ与不同的细胞因子联合刺激脐血CD34+ 细胞生长和分化的作用。研究结果发现 ,悬浮培养体系中的AngⅡ可同时刺激BFU E和CFU GM的扩增 ,BFU E和CFU GM的数量在一定范围内随AngⅡ浓度 (0 0 1- 0 1μmol/L)的升高而增多 ;在半固体培养基中的AngⅡ则仅刺激CFU GM的形成 ,却不影响BFU E ;悬浮培养体系中AngⅡ与细胞因子SCF +G CSF +GM CSF +IL 3联合可使CFU GM的扩增倍数由 2 3± 0 8升高到 7 8± 1 9倍 ,与SCF +EPO +TPO +IL 3联合 ,BFU E的扩增倍数由 3 1± 1 8提高到 9 2± 2 3倍。结论 :AngⅡ与其他细胞因子联合可刺激脐血造血干 /祖细胞体外扩增。     

骨髓增生异常综合征造血细胞生物学指标检测的意义

目的 研究骨髓增生异常综合征（MDS）造血细胞的生物学特性改变及与疾病进展的关系。方法对37例MDS患者骨髓细胞进行染色体核型分析、CFU－GM体外半固体琼脂培养、增殖细胞核抗原（PCR）表达、细胞周期分析以及造血克隆性检测,观察其对MDS疾病进展的关系。 结果 （1）MDS染色体异常检出率31％,随访过程中染色体核型正常的9例中有2例,异常的5例中有3例转化为急性髓系白血病（AML）。（2）MDS患者骨髓细胞体外CFU－GM集落产率减少、集簇产率增加。43％的患者CFU－GM产率极低或无生长。随访中9例CFU－GM集簇生长为主的患者中6例疾病进展或转化为AML;6例集落、集簇不生长和3例生长基本正常者中仅1例转化为急性白血病。（3）MDS患者骨髓细胞PCNA表达明显升高,RAEB／RAEB－t的PCN表达较RA／RAS高。（4）MDS患者骨髓细胞溴脱氧尿嘧啶（BrdU)标记指数减低（5．07％）,DNA合成期时间和潜在倍增时间延长,分别为8．57h和8．69d,并与病程进展关。（5）7例女性HUMARA等位基因为杂合子的RA患者中,2例为多克隆造血,5例为单克隆造血。3例RAEB和1例MDS／AML均为单克隆造血。结论 随着MDS病程进展,骨髓中原始细胞增多,造血细胞生物学特性呈现以下的演变趋势,造血转变为单克隆性;体外培养CFU－GM接近于白血病性生长特征;PCNA表达增高;细胞周期延长。     

Erythroid progenitors differentiate and mature in response to endogenous erythropoietin

We reported previously that stimulation of glycoprotein 130 (gp130) by a combination of human IL-6 and soluble IL-6 receptor (sIL-6R) could support proliferation, differentiation, and terminal maturation of erythroid cells in the absence of erythropoietin (EPO) from human CD34(+) cells in culture with stem cell factor (SCF). This observation suggested that differentiation of hematopoietic stem/progenitor cells to erythroid cells progressed according to an intrinsic program and that EPO receptor (EPOR) could be replaced by other cytokine receptors. In other words, EPOR appeared to be dispensable for erythropoiesis. Here we examined the role of EPOR in erythropoiesis stimulated by SCF, sIL-6R, and IL-6. Surprisingly, reduction of EPOR expression using antisense oligodeoxynucleotides suppressed erythropoiesis stimulated not only by SCF and EPO, but also by SCF, sIL-6R, and IL-6. EPO mRNA was detected in erythroid cells but not myeloid cells cultured in the presence of SCF, sIL-6R, and IL-6. Furthermore, high concentrations of anti-EPO-neutralizing antibody abrogated erythropoiesis in cultures without exogenous EPO. Based on these results, we suggest that erythroid progenitors themselves secrete EPO and that they have the potential to differentiate and mature in response to this endogenous EPO.     

不同组合细胞因子与人参总皂苷对体外培养CD34^＋细胞分化的诱导效应

背景:造血生长因子可分别作用于不同的造血细胞和细胞的不同分化阶段。红细胞生成素可促进晚期红系祖细胞的增殖分化,白细胞介素3为多潜能集落刺激因子,对多种造血细胞的分化成熟具有促进作用。目的:观察细胞因子的不同组合及人参总皂苷对CD34 细胞体外定向诱导分化为红系血细胞的影响。设计:观察对比实验。单位:重庆医科大学。材料:实验于2002-07/2004-01在重庆医科大学组织胚胎学教研室、基础医学研究所、重庆市生物化学与分子药理学重点实验室完成。正常人骨髓细胞来自第三军医大学大坪医院胸外科无血液系统疾病患者手术摘除的肋骨,所有患者知情同意。人参总皂苷和试剂由重庆中药研究所惠赠。胎牛血清、FITCCD34 抗体、FITC标记同型对照小鼠IgG1为BectonDickinson公司产品,CD71 抗体为SantaCruz公司产品,血小板生成素、Flt-3配基、干细胞因子、白细胞介素-3为SantaCruz公司产品,红细胞生成素为Amgen公司。方法:应用阴性分选策略,以StemsepTM系统从正常人骨髓细胞中分离CD34 造血干/祖细胞。经造血细胞因子不同组合(白细胞介素3 红细胞生成素、干细胞因子 白细胞介素3 红细胞生成素、Flt-3配基 血小板生成素 干细胞因子 白细胞介素3 红细胞生成素)进行液体培养,并以干细胞因子 白细胞介素3 红细胞生成素为对照组,在其中加入终浓度分别为10,20,50,70,100mg/L人参总皂苷为加药组,检测细胞总数、CD71 细胞比例;在CD34 细胞培养体系中加入不同剂量的人参总皂苷(剂量同前)为药物组,以不加人参总皂苷为对照组,通过甲基纤维素半固体培养法检测人参总皂苷诱导CD34 造血干/祖细胞向红系祖细胞(早期红系祖细胞、晚期红系祖细胞)增殖与分化能力。主要观察指标:①不同的细胞因子组CD34 细胞体外增殖情况。②人参总皂苷对CD34 细胞定向诱导分化为红系血细胞的影响。③人参总皂苷对CD34 细胞形成红系祖细胞能力的影响。结果:①各因子组合中以Flt-3配基 血小板生成素 干细胞因子 白细胞介素3 红细胞生成素细胞因子组合诱导CD34 细胞分化为红系血细胞的能力最强,2周时CD71 细胞比例为(61.20±5.31)%。②人参总皂苷20mg/L是液体培养诱导CD34 细胞向红系分化的最佳浓度,与干细胞因子 白细胞介素3 红细胞生成素协同作用CD34 细胞2周后,CD71 细胞比例从(48.39±5.07)%增加到(56.20±1.40)%。③人参总皂苷10～50mg/L均能提高CD34 细胞形成早期红系祖细胞、晚期红系祖细胞的集落产率。结论:含有Flt-3配基 血小板生成素 干细胞因子 白细胞介素3 红细胞生成素的细胞因子组合,可诱导CD34 细胞定向生成大量的红系细胞;人参总皂苷能促进CD34 细胞定向诱导分化为红系血细胞。     

移植GM—CSF基因修饰的骨髓细胞对小鼠造血恢复的影响

探索粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因修饰的骨髓细胞促进照射鼠骨髓移植后造血功能恢复的可行性。通过基因转移造血细胞进行骨髓移植的小鼠模型动态观察移植鼠外周血细胞数量、肝脾及骨髓形态学,CFU-S,CFU-GM及血清GM-CSF活性的变化。结果表明,实验组小鼠外周血白细胞与中性粒细胞计数,CFU-S及脾脏CFU-GM明显高于对照组(P<0.05),而各组间骨髓CFU-GM计数无显著性差异(P>0.05);组织学显示实验小鼠肝脾造血组织明显增多,而各组间骨髓象改变不大,并且血清GM-CSF活性也较对照组明显升高(P<0.01)。结论提示,给γ射线照射小鼠移植GM-CSF基因修饰的骨髓造血细胞能显著加快造血恢复的过程。     

Preservation of immature hematopoietic progenitor cells responding to interleukin 3 in marrow treated with 4-hydroperoxycyclophosphamide

The toxic effects of 4-hydroperoxycyclophosphamide (4HC) on different human hematopoietic progenitor cells were determined. Day 7 colonies supported by granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), day 10 colonies supported by granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) were counted. Approximately 2 X 10(2) granulocyte-macrophage colonies per 5 X 10(4) bone marrow (BM) mononuclear cells were formed in each assay system. A combination of interleukin 3 (IL3) and erythropoietin (EPO) induces 3 types of day 14 colonies; erythroid burst-forming units (BFU-E, 40 +/- 29/5 X 10(4) BM cells), granulocytes-macrophage colony forming units (CFU-GM, 143 +/- 29/5 X 10(4) cells and mixed colonies (CFU-GEMM, 24 +/- 13/5 X 10(4) cells). After treatment with 4HC, all the colonies were reduced. However, the recovery rate of day 14 colonies supported by the combination of IL3 and EPO (mean 12.1%) was significantly higher than the recovery rate of both day 7 colonies supported by G-CSF (mean 1.0%) and day 10 colonies supported by GM-CSF (mean 4.0%). The recovery rate of colonies supported by IL3 and EPO as also higher than that of day 14 colonies supported by GM-CSF and EPO. Immature pluripotent hematopoietic progenitor cells supported by IL3 and EPO appeared less sensitive to 4HC treatment than those supported by G-CSF and GM-CSF. Colony forming assays using IL3 may be useful in order to predict the hematological reconstitution after autologous bone marrow transplantation with 4HC treated graft.     

Erythroid Precursors in Congenital Hypoplastic (Diamond-Blackfan) Anemia

To explore the etiology of congenital hypoplastic anemia (CHA) or the Diamond-Blackfan anemia, erythropoietin responsive committed erythroid precursors were enumerated by the plasma clot method. These included blood and marrow erythroid burst-forming units (BFU-E) and marrow erythroid colony-forming units (CFU-E). The peripheral blood nucleated cells of 11 patients and the marrow cells of seven of these patients were examined. Studies were repeated in several patients during relapse and after induction of remission. BFU-E were undetectable in the marrow and blood of all but one relapsed patient, and the numbers of marrow CFU-E were depressed in all relapsed patients. Blood BFU-E remained low in all of the patients in remission. No evidence was obtained for suppression of normal CFU-E or BFU-E by CHA lymphocytes. Erythropoietin dose-response curves performed in two patients revealed a 10-fold increase in erythropoietin requirement for marrow CFU-E colony growth. This marked unresponsiveness to erythropoietin was strikingly improved by steroid therapy in one patient. We suggest that CHA is the result of a qualitative and/or quantitative deficiency of BFU-E. If BFU-E are produced, they must be relatively unresponsive to erythropoietin. The abnormal BFU-E give rise to erythropoietin unresponsive CFU-E and, thence, to proerythroblasts that are, in turn, trapped in that early stage of development because of their poor erythropoietic response. Hence, red cell production is deficient. Steroids appear to improve the erythropoietin response of CHA erythroid precursors.     

Three-lineage hemopoietic precursor cells and effectiveness of recombinant human erythropoietin in patients with myelodysplastic syndromes.

Four-stem-cell assays, which evaluate megakaryocytic (CFU-Meg), immature and mature erythropoietic (BFU-E, CFU-E), and granulocyte-macrophage (CFU-GM) colony formation, were performed in nine patients with myelodysplastic syndromes (MDS). The CFU-Meg, BFU-E, and CFU-E colony growths were disturbed more often than the CFU-GM colony formation. A CFU-E increase was not recognized in most MDS patients, but a dose-dependent increase of bone marrow CFU-Es in response to erythropoietin (EPO) was recognized only in two refractory anemia (RA) patients whose CFU-Es were more than one tenth of normal controls. One patient with RA and the other with chronic myelomonocytic leukemia (CMML), both of whose bone marrow CFU-Es did not increase at the higher dose of EPO in vitro, were treated with recombinant human EPO (rHuEPO), resulting in no effects. The responsiveness of patients with MDS to various recombinant hemopoietic factors might be predicted by both the residual degree of bone marrow hematopoietic precursor cells and the response of stem cells to the higher doses of each hemopoietic factor.     

IL—6基因转染的骨髓基质细胞系对骨髓移植小鼠造血功能恢复？…

目的：探讨白细胞介素６（ＩＬ－６）基因转染的骨髓基质细胞系ＱＸＭＳＣ１ＩＬ－６对骨髓移植后造血功能的重建作用。方法：将骨髓造血细胞和骨髓基质细胞系一起经尾静脉注射给同系小鼠，建立骨髓移植（ＢＭＴ）模型。小鼠的造血功能用脾结节（ＣＦＵ－Ｓ）、粒－单系祖细胞（ＣＦＵ－ＧＭ）、红系祖细胞（ＣＦＵ－Ｅ、ＢＦＵ－Ｅ）测定及外周血各项血液学指标来确定。结果：ＷＸＭＳＣ１ＩＬ－６转基因骨髓基质细胞可明显增强ＢＭ     

IL-6基因转染的骨髓基质细胞系对骨髓移植小鼠造血功能恢复的促进作用

目的:探讨白细胞介素6(IL-6)基因转染的骨位基质细胞系QXMSC, IL6对骨髓移植后造血功能的重建作用。方法:将骨髓造血细胞和骨髓基质细胞系一起经尾静脉注射给同系小鼠,建立骨髓移植(BMT)模型。小鼠的造血功能用脾结节(CFU-S)、粒-单系祖细胞(CFU-GM)、红系祖细胞(CFU-E、BFU-E)测定及外周血各项血液学指标来确定。结果:QXMSC_1 IL-6转基因骨髓基质细胞可明显增强BMT小鼠形成的CFU-S、CFU-GM、CFU-E和BFU-E数,促进外周血象的恢复。结论:QXMSC_1 IL-6细胞可明显促进小鼠骨髓移植后早期造血功能重建。