幽门螺杆菌vacA毒性片段与cagA融合基因的构建与表达

目的　构建幽门螺杆菌空泡毒素 (VacA)毒性片段和细胞毒素相关蛋白 (CagA)的融合基因 (vlc) ,在原核细胞中表达 ,为Hp双价融合蛋白候选疫苗的研究提供材料。 方法　用GeneSOEing技术将vacA毒性亚单位片段 (v)与cagA保守片段 (c)用疏水性多肽接头 (Gly4Ser) 3 进行拼接 ,构建融合基因vlc,将vlc定向插入原核表达质粒pQE30 ,经DNA测序分析确认后 ,转化E .coliDH5a ,IPTG诱导表达 ,Westernblot分析其抗原性。结果　DNA序列分析表明融合基因的连接顺序、方向正确 ,有一个碱基发生了无义突变。工程菌诱导后可表达相对分子量为 5 8× 10 3 的融合蛋白 ,与预期分子量一致 ,约占菌体总蛋白的 8%。Westernblot显示融合蛋白具有良好的抗原性。结论　融合基因vlc构建成功 ,表达的融合蛋白具有良好的抗原性 ,有望进一步进行免疫保护性机制的研究和Hp疫苗的制备。     

幽门螺杆菌47kDa微孔蛋白基因的克隆表达及特性鉴定

目的对人幽门螺杆菌(H.pylori)编码47kDa外膜微孔蛋白基因omp47克隆表达及特性鉴定,探索研制H.pylori疫苗的新途径。方法培养和收集H.pylori标准菌株NTTC11637及临床菌株,采用酚∶氯仿抽提、纯化基因组DNA。设计上下游引物,并以该基因组为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增omp47基因片断。将目的基因和与克隆载体PGEM-T连接后,转化至E.coli DH5α及BL21,碱裂解提取质粒经BamHI和XhoI双酶切鉴定并进行序列分析。重组蛋白采用IPTG诱导表达后,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定、镍亲和层析纯化检测抗原活性。结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片断为1284bp,编码427个氨基酸。与GenBank公布的H.pylori标准株26695、43504及J99序列比对,核苷酸同源性高达94%~96%,编码氨基酸同源性96%~99%。经SDS-PAGE检测,电泳图谱上显示一条相对分子量为47kda的新生蛋白带。Western blot检测表明重组蛋白有较好的抗原性。结论成功克隆了外膜微孔蛋白OMP47的编码基因,为H.pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

幽门螺杆菌VacA重组蛋白对SGC7901胃癌细胞的作用

目的:研究幽门螺杆菌空泡毒素(VacA)编码基因在大肠杆菌中的表达产物对SGC7901胃癌细胞的作用.方法:常规培养pET32a-vacA-E.coliBL21(DE3)工程菌株,IPTG诱导重组蛋白表达,产物纯化后作用于胃癌细胞,倒置显微镜及电镜等检测细胞生长情况.结果:重组蛋白作用于胃癌细胞后,倒置显微镜下观察,细胞生长受抑制,其细胞空泡毒作用减弱甚至消失,电镜下可见10%-20%左右细胞呈现轻度空泡变,仅少数细胞空泡变明显,细胞表面微绒毛消失,少量细胞体积减小,并出现了早期核着边固缩等凋亡改变.结论:重组VacA蛋白对胃癌细胞的生长具有抑制作用,空泡毒作用减弱.     

幽门螺杆菌感染与胃窦炎症病理变化的关系

目的 明确幽门螺杆菌感染（H.pylori)与胃窦炎症病理变化的关系。方法 通过胃镜活检取得胃窦组织标本，在快速尿素酶试验阳性和甲苯胺蓝染色中等阳性的病人中筛检出128例患者，其中包括慢性浅表性胃炎（CG）患者68例，十二指肠球部溃疡（DU）患者30例，胃溃疡（GU）患者30例，对患者的血清进行免疫印迹试验，检测患者的细胞毒素相关蛋白A（CagA)、空泡毒素相关蛋白A（VacA)抗体的情况。结果 胃窦炎症积分在CG、DU、GU患者胃窦炎症均表现为活动性，但是没有明显差异；CagA在所有病例中具有普遍易感性。在GU中出现8例胃窦萎缩，其中4例表现为CagA和VacA均阳性。在DU中未见胃窦萎缩。结论 H pylori相关性胃病中胃窦炎症多表现为活动性，但是没有明显差异。CagA在所有病例中具有普遍易感性，胃窦萎缩多出现在GU患者中并与CagA和VacA均阳性相关。     

幽门螺杆菌重组VacA蛋黄抗体的体外活性

目的:制备幽门螺杆菌(Helicobacter pylon)重组VacA的鸡蛋黄抗体IgY(VacA-IgY),了解其理化特性和生物学活性,评价其抗H pylori感染的作用．方法:以纯化的重组VacA免疫产蛋鸡,水稀释法提取蛋黄抗体(VacA-IgY),硫酸铵沉淀法纯化IgY．将一定浓度的VacA-IgY在不同温度的水浴中维持一定时间,评价其耐热性;在不同 pH的Tris-HCI中孵育一定时间,评价其耐酸性;加入胃蛋白酶并作用一定时间后,评价其对酶消化的耐受作用．以上评价均采用ELISA 法测定抗体效价变化．采用Hela细胞体外培养 MTT法分析VacA-IgY对H pylori细胞毒活性的中和作用．结果:本实验制备的VacA-IgY在70℃水浴 15 min后活性保持约50％;在pH≥5时,抗体活性几乎无改变,pH<5时,抗体活性下降较快,pH2．0左右,抗体活性几乎丧失;pH4．0时, 60 kU／L胃蛋白酶作用1 h,抗体活性几乎无变化,2 h后活性仍保持50％以上．VacA-IgY能浓度依赖性地中和H pylori菌体蛋白的Hela细胞毒活性．20 mg／L超声提取物即可降低1／2的 Hela细胞增殖能力,80-320 mg／L的VacA-IgY 能完全中和H pylori菌体蛋白的Hela细胞毒活性(P<0．01)．结论:成功制备了重组VacA的IgY,且具有较好的耐热性、耐胃酶消化和一定的耐酸性; 在其体外具有中和H pylori细胞毒活性的作用．     

高效表达幽门螺杆菌cag A蛋白工程菌的构建

幽门螺杆菌 (Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ,Ｈｐ)是引起人类慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要病原菌 ,并与胃癌的发生密切相关。对Ｈｐ毒力因子进行的研究表明 :尿素酶、空泡毒素 (ＶａｃＡ)及细胞毒素相关蛋白Ａ(ＣａｇＡ) ,是引起人类严重胃部疾患的主要致病因素[1] 。其中ｃａｇＡ基因已被克隆并进行了序列分析[2 ] 。研究还证实ｃａｇＡ基因的存在是产生有活性的空泡毒素所必须的 ,并能促进细胞因子ＩＬ 8的释放及激活转录因子ＮＦ κＢ ,加重胃黏膜的组织损伤 ,故而目前认为含ｃａｇＡ基因的Ｈｐ菌株是高毒株[3 ] 。我国人群…     

靶向siRNA抑制幽门螺杆菌vacA表达

目的:观察靶向siRNA能否抑制幽门螺杆菌(H pylori)vacA基因表达．方法:合成靶向H pyiori vacA基因5对特异 siRNA(实验组:vacA-S1,vacA-S2,vacA-S3, vacA-S4,vacA-S5)和1对非特异siRNA(对照组)．通过电穿孔法使siRNA转化至H pylori内,观察转化效率和转化1,6,12,24,48 h mRNA和蛋白表达的抑制率,并将PCR产物克隆和测序. 结果:电穿孔转化效率平均为89％．vacA-S2、 vacA-S4组在转化1 h vacA mRNA表达抑制率达最大值,1,6,12 h抑制率分别为65％和77％,43％和50％,17％和9％,24和48 h时 vacA mRNA表达无抑制效应,与vacA-S1、 vacA-S3、vacA-S5、vacA-S6组相比有显著差异 (P<0．05),因为vacA-S1、vacA-S3、vacA-S5、 vacA-S6组转化后各时间点mRNA表达无变化．vacA-S2和vacA-S4组在转化1,6,12,24 h时 vacA蛋白表达抑制率分别为26％和17％,47％和40％,70％和75％,33％和30％,与vacA-S1、 vacA-S3、vacA-S5、vacA-S6组相比有显著差异 (P<0．05);转化48 h则无抑制效应．PCR产物克隆和测序与相应报道序列比较,同源性为99％．结论:靶向siRNA可以通过电穿孔法转化并特异地抑制H pylori vacA基因表达.     

幽门螺杆菌vacA基因型和cagA基因及其表达产物

幽门螺杆菌（Ｈｐ）的ｖａｃＡ基因和ｃａｇＡ基因分别表达ＶａｃＡ和ＣａｇＡ蛋白两种毒力因子。两种毒力因子之间有着相互的关联，在Ｈｐ引起的胃肠疾病中具有重要作用，Ｈｐ感染的临床发病与Ｈｐ的ｖａｃＡ基因型，具有ｃａｇＡ基因Ｈｐ以及ＶａｃＡ和ＣａｇＡ蛋白的表达有着密切的关系。     

幽门螺杆菌5种候选疫苗抗原基因的克隆、表达及抗原性的鉴定

目的:构建含人Hpylori5种候选疫苗抗原Lpp20,HspA,UreaseA,CagA,UreaseB的编码基因的重组质粒并研究其抗原性.方法:应用PCR技术从Hpylori染色体中扩增编码Lpp20,HspA,UreaseA,CagA,UreaseB的基因片段,将其T-A克隆和测序,并与GenBank公布的其他Hpylori菌株基因序列比较,再将目的基因克隆至融合表达载体pGEX-4T-1上中进行表达,用GST亲和层析对其进行纯化,纯化产物用于对29株小鼠抗Hpylori-全菌单克隆抗体(mAb)的鉴定及与Hpylori感染患者血清进行Westernblot分析.结果:扩增的Lpp20,HspA,UreaseA,CagA,UreaseB基因全长分别为528bp,351bp,675bp,855bp,1704bp(GenBank登录号分别为DQ106902,DQ141574,DQ141577,DQ141575,DQ141576),与GenBank公布的其他菌株的核酸序列的同源性在95%-99%,表达Lpp20,HspA,UreaseA,CagA,UreaseB融合蛋白的相对分子质量分别约为48000,41000,52000,60000,91000Da,29株小鼠抗Hpylori全菌mAb中针对Lpp20,HspA,UreaseA,CagA,UreaseB抗原的分别为4,5,5,1,6株,5种抗原的纯化产物均可被Hpylori感染患者血清特异性识别.结论:重组表达的Lpp20,HspA,UreaseA,CagA,UreaseB均具有较好的抗原性.     

幽门螺杆菌VacA N端真核表达载体的构建、鉴定及其诱导巨噬细胞空泡化和凋亡的观察

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)空泡毒素(Vacuolating cytotoxin,VacA)基因的真核表达载体pDsRed-Monomer-C1/vacA,并在THP-1巨噬细胞中表达,为研究VacA单一毒力决定簇的致病性奠定实验基础。方法用Primer 5.0软件设计引物,以HP基因组为模板,PCR扩增vacA目的基因片段,克隆入真核表达载体pDsRed-Monomer-C1中,经酶切、PCR鉴定及测序鉴定后,转染THP-1巨噬细胞中,荧光显微镜和Western-blot检测VacA蛋白在细胞中的表达;电镜观察巨噬细胞(MΦ)的空泡样变和凋亡;流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果PCR扩增得到了大小约为1 428bp的目的片段,双酶切及测序鉴定证明成功构建了HP真核表达重组载体;转染后24h,重组质粒组部分细胞中有聚集的荧光颗粒,部分细胞发生空泡样变和凋亡改变;细胞凋亡率明显高于空质粒组和阴性对照组(P<0.001),细胞核因子-κB(nuclear factorkappaB,NF-κB)的抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)抑制细胞的凋亡。结论VacA蛋白瞬时高表达促进THP-1巨噬细胞空泡样变和凋亡。NF-κB可能参与调节VacA诱导的巨噬细胞凋亡。     

幽门螺杆菌VacA蛋白的纯化

目的对幽门螺杆菌(Hp)相对分子质量(Mv)95×10~2的VacA蛋白进行分离纯化。为进一步研究VaGA的作用机制奠定基础.方法采用经硫酸铵沉淀及透析后得到的Hp ccUG17874菌株浓缩上清,应用吸附层析、疏水层析、阴离子交换层析及凝胶过滤等液相层析方法进行VacA蛋白的纯化.每步层析后得到的样品均检测蛋白浓度及空泡毒素活性并行SDS-PAGE电泳检测蛋白成分.结果纯化蛋白的Mr为95×10~3,电泳纯,具有明显的空泡毒性,比活力达20480,与上清原液相比纯化倍数提高了4550倍,产率约为5μg/L.结论采用吸附层析、疏水层析、离子交换层析及凝胶过滤的纯化流程,可以成功分离纯化Hp液体培养上清液中的VacA,纯化的VacA蛋白可用于Hp致病机理的研究.     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌(简称Hp)HspA-UreB融合蛋白,并探索其免疫反应性,为Hp基因工程疫苗的研制奠定基础。方法用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的hspA和ureB基因,分别克隆入pNEB193中。测序后,回收两种基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接插入原核表达载体pMAL-C2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体中;重组质粒转化大肠杆菌TB1后,经IPTG诱导3h,SDS-PAGE电泳显示在119kDa处出现一条特异蛋白带,即麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合表达形式,约占细菌总体蛋白含量的31%;该融合蛋白与Hp免疫小鼠血清和Hp阳性病人血清的Westernblot分析结果显示,在119kDa处出现特异杂交带。结论成功地在大肠杆菌中实现了Hp融合蛋白HspA-UreB的高效表达,并证实其具有良好的免疫反应性。     

幽门螺杆菌Mr26000外膜蛋白真核载体的构建及表达蛋白的鉴定

目的　构建含人幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,H pylori) 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因的真核重组载体 ,并在COS- 7细胞中表达 ,为核酸疫苗的开发奠定基础。方法　从原核表达质粒 pET32a(+) / 5 94中 ,酶切H pylori 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因片段 ,将目的基因与同样进行酶切、纯化的载体pcDNA3 1进行连接 ,而后转化并筛选含有目的基因的重组载体pcDNA3 1/ 5 94 ,并在COS - 7细胞中表达 ,以RT -PCR ,Dotblot法检测其表达产物。 结果　经酶切证实插入的基因片段为H pylori 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因 ;采用RT -PCR方法 ,能够从转染COS - 7细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段 ;同时Dotblot法等检测显示 ,该重组质粒能够在COS - 7细胞中表达目的蛋白。结论　成功地构建了真核重组载体 pcDNA3 1/ 5 94 ,并在COS - 7细胞中表达 ,为H pylori核酸疫苗的研制奠定了良好的基础。     

Construction and identification of a recombinant live attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain carrying Helicobacter pylori heat shock protein subunit B gene

OBJECTIVE: Because Helicobacter pylori is the principal cause of chronic active gastritis and peptic ulcer disease, the present study explored the possibility of constructing a recombinant live attenuated S. typhimurium vaccine strain carrying H. pylori heat shock protein subunit B (HspB) gene. METHODS: A 1640‐bp HspB gene was cloned into a prokaryotic expression plasmid pTrc99A. After sequence analysis, the result was compared with the sequence of H. pylori‐HspB gene and protein provided by the Genebank using BLAST analysis. The identified recombinant plasmid was then introduced into a live attenuated S. typhimurium strain SL3261. RESULTS: Using polymerase chain reaction (PCR) and restriction enzyme digestion, a recombinant pro­karyotic expression plasmid pTrc99A‐HspB harboring the HspB gene was constructed and successfully introduced into a live attenuated S. typhimurium strain SL3261. Most of the H. pylori‐HspB in the recombinant plasmid pTrc99A‐HspB was consistent with the H. pylori‐HspB sequence provided by the Genebank. The exchange of A/T or C/G in the cloned sequence hardly changed the encoded amino acids; the homology for both the genes and proteins of H. pylori SS1 strain was 97%; the homology with other common H. pylori strains J99 and 26695 was 96% for both. CONCLUSION: A recombinant live attenuated S. typhimurium vaccine strain harboring H. pylori‐HspB gene was successfully constructed and verified, which may help in the development of an oral vaccine against H. pylori infection.     

幽门螺杆菌基因hpaA克隆、融合表达和鉴定

目的克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA,构建幽门螺杆菌hpaA基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,鉴定融合蛋白免疫原性,为幽门螺杆菌疫苗研究提供依据。方法利用PCR技术从H.pylori郑州分离株MEL-HP27染色体DNA上扩增出hpaA基因,序列分析后,将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌(E.coliTB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western blot鉴定其免疫原性。结果用PCR方法扩增的hpaA基因长度为783bp,编码260个氨基酸,经酶切鉴定和测序,插入到克隆载体的基因片段与预期目的DNA片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为29kDa,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的26%。结论本研究成功构建了hpaA基因与麦芽糖结合蛋白基因融合原核表达系统,为幽门螺杆菌基因工程组分疫苗的研究奠定基础。     

Helicobacter pylori and pathogenesis of gallbladder cancer

Background and Aim: Gallbladder cancer (GBC) is a rare but leading cause of cancer‐related deaths worldwide. The incidence of GBC is increasing at an alarming rate in the Varanasi region, and its etiology remains obscure. Methods: A total of 108 patients, 54 with GBC and 54 with gallstone diseases (GSD), were examined for Helicobacter pylori (H. pylori) in gallbladder specimens by rapid urease test, biochemical test, histology, culture, serology, polymerase chain reaction (PCR), and partial DNA sequencing. PCR was done using heat shock protein‐60 (Hsp60) gene‐nested primers. Result: Forty (74%) patients with GBC had gallstones. Upon culture, H. pylori colonies were identified in 24 (44%) GBC and 18 (33%) GSD specimens. H. pylori was detected in 20 (37%) GBC and 15 (28%) GSD samples upon histology. Serology was positive in 17 (32%) GBC and 15 (28%) GSD patients. The DNA isolated from GBC and GSD specimens was amplified by PCR with Hsp60‐nested primers in 18 (33%) patients with GBC and 15 (28%) with GSD (P > 0.05). These sequences had 98% similarity with the presubmitted Hsp60 sequences of H. pylori in the National Centre for Biotechnology Information's GenBank. Conclusion: The results revealed that H. pylori was present in a large population, including both GBC and GSD patients, which indicates its endemic presence in the Varanasi region. Thus, it appears H. pylori might not have a significant role in the etiopathogenesis of GBC in our region.     

Diversity of Helicobacter pylori isolates in expression of antigens and induction of antibodies

AIM： To obtain evidence for selection of antigens used in genetically engineered vaccine against Helicobacter pylori （H pylori）. METHODS： Enzyme linked immunoabsorbent assay （ELISA） was established on the basis of recombinant protein antigens rUreB, rHpaA, rVacA, rCagA1, rNapA, rFlaA and rFlaB of Hpylori to detect expression rates of the antigens in bacterial isolates as well as positive rates of the antibodies in sera from H pylori-infected patients. PCR was applied to the detection of carrying rates of the genes encoding antigens in the isolates. RESULTS： The outputs of rUreB, rHpaA, rVacA, rCagA1, rNapA, rFlaA and rFlaB were approximately 35%, 32%, 15%, 23%, 56%, 25% and 20% of the total bacterial proteins, respectively. One hundred and fifty-one strains of H pylori were isolated from 347 biopsy specimens of chronic gastritis, peptic ulcer or gastric adenocarcinoma, with a positive rate of 43.5%. All of the isolates expressed UreB, HpaA, FlaA and FlaB while 52.3%, 92.1% and 93.4% of the isolates expressed VacA, CagA and NapA, respectively. In the sera of 151 Hpylori-infected patients, the positive rates of IgG antibodies against UreB, HpaA, VacA, CagA, NapA, FlaA and FlaB were 100%, 87.4%, 43%, 71.5%, 89.4%, 84.8% and 79.5%, respectively. Furthermore, the expression frequencies of VacA and NapA were found to be relative to the severity of gastric diseases （P = 0.016 and P 〈 0.0001, respectively）. CONCLUSION： UreB antigen is the top option of developing genetically engineered vaccine against H pylori followed by NapA or HpaA.