以CAT为报告基因的蜡样芽孢杆菌强组成型启动子的筛选及初步鉴定

目的 从蜡样芽孢杆菌基因组中筛选组成型启动子,并对其活性进行鉴定.方法 用Sau3 AⅠ酶切蜡样芽孢杆菌的基因组,回收片段,连接载体pCMR8a,转化DH5α感受态后涂布在氯霉素和卡那霉素的培养基上得到强启动子,并对其进行截短和顺反性实验,并检测其启动蛋白表达情况.结果 成功筛选到一个具有反向启动外源蛋白表达能力的启动子序列,并能够有效表达多种外源蛋白.结论 本实验成功筛选并验证了蜡样芽孢杆菌的一种组成型启动子,能够有效地启动外源蛋白的表达,对实验室中表达某种或某些蛋白和工业生产提供了更多的选择.     

A组轮状病毒结构蛋白基因在马铃薯细胞中的初步表达

目的 在马铃薯细胞中表达轮状病毒结构蛋白。方法采用RT-PCR扩增截短VP4蛋白基因，克隆于植物表达载体paBI221，再双酶切pBI221，将带有CaMV35S启动子、外源基因及终止子的片段转入pSB11，通过三亲杂交方法，制备农杆菌转化载体pSB111-VP4，并对pSB111-VP4作点杂交检测，筛选鉴定重组子，对马铃薯组织细胞进行转化。结果转化细胞经Western印迹检测其免疫活性，具有良好的抗原性。结论为研制轮状病毒重组疫苗、亚单组疫苗、转基因植物口服疫苗做了前期准备。     

水痘-带状疱疹病毒基因启动子分析

目的从水痘-带状疱疹病毒(VZV)主要基因的启动子中找到最容易被VZV感染激活的启动子及其最短有效序列以构建VZV报告细胞系。方法构建18个VZV开放读码框架(ORF)启动子的重组报告质粒,用基因转染瞬时表达分析法比较各启动子在VZV感染早期启动报告基因产物表达的活性;将最容易被激活的启动子从5′和3′端截短后构建截短启动子的重组报告质粒,比较各截短启动子的活性以找到启动子的最短有效序列;应用点定向突变技术将最短有效序列中细胞转录因子的结合序列进行碱基置换突变后比较突变启动子的启动活性。结果VZV感染早期ORF9、ORF61和ORF66的启动子最容易被激活;ORF9启动子的最短有效序列位于-127～-34(93 bp),其上游刺激因子(USF)结合序列的碱基置换突变后启动子活性降低50%;ORF61启动子的最短有效序列位于-227～-52(165 bp),其Pbx-1结合序列的碱基置换突变后启动子活性增强一倍,但NF-κB结合序列的突变对启动子活性无影响。结论ORF9启动子的最短有效序列最适合用来构建VZV报告细胞系。     

人大麻素受体启动子真核报告质粒的构建及活性分析

目的:利用双荧光素酶报告基因体系,根据大麻素受体1(cannabinoid receptor 1,cnr1)启动子序列不同部位的转录活性来初步确定其活性区域,为脊髓缺血耐受保护中cnr1高表达的转录调控的研究奠定基础。方法:从NCBI中获取cnr1基因转录起始点5’端向上约1800 bp的核苷酸序列,按照300 bp的距离间隔,设计6个不同长度的截短体PCR引物,以人全血基因组DNA为模板,分别扩增cnr1启动子区域的截短体片段,并克隆入荧光素酶报告基因pGL3-Basic质粒中。将含有不同截短体的重组质粒分别转染Hela、Jurket和A549细胞后行荧光素酶活性检测。根据不同截短体转录活性检测结果,确定cnr1启动子活性区域。结果:成功将cnr1启动子区6个不同长度(1800、1500、1200、900、600和300 bp)的截短体克隆入荧光素酶报告基因pGL3-Basic质粒。在3种细胞系Hela、Jurket和A549的荧光素酶活性检测均显示600 bp的截短体转录活性最强。结论:成功构建了cnr1启动子的报告基因重组质粒,初步证实-600 bp到-200 bp区为cnr1的启动子的活性区域,从而为进一步研究cnr1的转录调控奠定了基础。     

肝癌靶向性超抗原表达载体的构建与鉴定

目的：设计并构建受AFP基因顺式作用元件调控，并经减毒处理的肝癌特异性超抗原表达载体。方法：用新设计的引物作PCR扩增截短的AFP基因启动子和增强子、linker-CD80tm和SEA（D227A）。将上述片段与逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点连接，构建成为AFP基因顺式作用元件调控的肝癌特异性减毒超抗原表达载体[pLXSN SEA(D227A)-Linker-CD80tm]，并用软件对其开放读框进行分析。结果：成功克隆了截短的AFP基因启动子、增强子、linker-CD80tm和SEA（D227A）。将上述序列连接到逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点，酶切鉴定和DNA序列分析无误。结论：AFP基因转录启动元件修饰的SEA表达载体，在基因转录水平定量、定向、特异性调控强有力的细胞和体液免疫活化剂（SEA），为下一步将其作为基因疫苗治疗肝癌奠定了基础。     

轮状病毒抗原基因在马铃薯细胞中的表达和活性检测

目的 轮状病毒引起的婴幼儿腹泻病，在发展中国家有较高的发病率和病死率，因此，研制安全有效的轮状病毒疫苗成为当务之急。方法 本文采用RT－PCR扩增截短VP4蛋白基因，克隆于植物表达载体pBI221,再双酶切pBI221,将带有CaMV35S启动子、外源基因及终止子的片段转入pSB11,通过三亲杂交方法，制备农杆菌转化载体pSB111-VP4,并对pSB111-VP4作为杂交检测，筛选鉴定重组子，并对马铃薯组织细胞进行转化。结果 Western印迹检测其免疫活性，且具有良好的抗原性。结论 该转化系统的建立，为研制轮状病毒重组疫苗、亚单组疫苗、转基因植物口服疫苗做了前期准备。     

SPA基因启动子的克隆及转录靶向活性分析

目的：克隆大鼠肺表面活性蛋白A（SPA）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性，为进一步研究SPA 基因的表达调控机制和探讨靶向性基因治疗奠定基础。方法:①从GenBank中获取大鼠SPA 基因序列，对其上游基因组序列进行计算机生物信息学分析，推断其上游序列约163bp的区域具有启动子功能。②利用PCR技术扩增SPA 基因上游启动子序列,将其亚克隆入pGL3-basic 中,构建pGL3-SPA 质粒，将其亚克隆于pGL3-control 中，构建pGL3-SPA-enhancer 质粒。③将构建pGL3-SPA质粒、pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-control质粒和pGL3-basic 质粒分别与内参质粒pRL-TK共转染入A549细胞和H441细胞, 用双荧光素酶报告系统检测该质粒在两种细胞中的荧光素酶活性表达。 结果:酶切及测序结果均证实成功克隆了SPA基因启动子序列,并已将该序列正确插入到荧光素酶报告基因系列载体中。重组的pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-SPA质粒转染H441 细胞后可以检测到荧光素酶的高表达。结论:成功构建了含有SPA 基因启动子序列的荧光素酶基因报告系统,证实了它在高表达SPA蛋白的细胞中有较高的转录活性， 为下一步研究SPA 基因功能及其转录调控以及探讨基因治疗的靶向性奠定了基础。     

系列截短和缺失的hTERT启动子报告载体的构建及活性验证

目的 构建系列截短及缺失的hTERT启动子荧光素酶报告载体并验证其活性.方法 PCR扩增系列截短及缺失的hTERT启动子基因,克隆人pGL3-Basic质粒,构建荧光素酶报告载体.分别与pRL-TK内参照质粒共转染HepG2和COS-7细胞,48h后裂解细胞,双荧光素酶分析法检测启动子的活性.结果 成功构建系列截短及缺失的hTERT启动子报告载体,分别命名为pGL3B-895、pGL3B-371、pGL3B-DELS2、pGL3B-349、pGL3B-329、pGL3B-318、pGL3B-306.双荧光素酶报告基因检测结果显示在肝癌细胞和工程细胞中上述报告载体均具有启动子活性.结论 成功构建具有启动子活性的系列截短及缺失的hTERT启动子荧光素酶报告载体,为进一步探讨肝癌发生中人端粒酶逆转录酶表达调控机制提供必要的实验材料.     

以胰岛新生相关蛋白启动子为靶点的基因表达上调剂筛选模型的建立与初步应用

目的建立以胰岛新生相关蛋白启动子为靶点的高通量筛选模型,用于胰岛新生相关蛋白基因表达上调剂的筛选。方法以叙利亚金黄地鼠基因组 DNA为模板扩增胰岛新生相关蛋白核心启动子序列,克隆至 pGL4.17质粒载体构建重组质粒。采用脂质体介导的方法将重组质粒和内参质粒 pRL-TK共转染金黄地鼠胰岛β细胞 HIT-T15,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶的表达活性。对瞬时转染条件进行优化,以豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯作为阳性对照来评价模型的有效性,并利用该细胞模型对本研究所的化合物库进行筛选。结果构建了重组荧光素酶报告基因质粒 pGL4.17-INGAP,并成功转染 HIT-T15细胞株。对模型进行优化后,应用阳性对照对其进行评价,Z＇因子为0.57,适用于进行高通量筛选。用该模型筛选了本所化合物库,其中白藜芦醇显示出较好的上调作用,EC50为1.6μg/ml。结论成功建立了以胰岛新生相关蛋白启动子为靶点的基因表达上调剂筛选模型。     

真核表达载体p4ARE-TK-GFP/Neo的构建及其表达

目的:构建真核表达载体p4ARE-TK-GFP/Neo, 并在HepG2细胞中进行表达.方法:PCR法扩增TK启动子克隆到pEGFP-N1上, 构建表达载体pTK-GFP/Neo.人工合成4个ARE序列, 经退火和磷酸化后插入pTK-GFP/Neo载体的TK启动子上游, 构建由TK启动子启动以及上游有4个ARE调控的真核表达载体p4ARE-TK-GFP/Neo, 将其转染入HepG2细胞株并筛选, 进行稳定表达.结果:成功构建了真核表达载体p4ARE-TK-GFP/Neo, 并建立HepG2细胞稳定表达株.结论:成功地构建了由TK启动子启动以及上游有4个抗氧化反应元件(ARE)重复序列调控的真核表达载体p4ARE-TK-GFP/Neo, 并在HepG2细胞中稳定表达, 为下一步研究ARE的调控作用奠定了基础.     

中国强毒力赖型钩端螺旋体外膜蛋白基因的克隆表达及对大肠杆菌活力的影响

目的:构建表达致病性赖型 017株钩端螺旋体OmpL1外膜蛋白的真核-原核穿梭表达载体,并在原核细胞中表达出目的蛋白。方法:用PCR方法从 017株钩体基因组中钓出OmpL1蛋白基因,酶切纯化后与质粒pBK-CMV连接,通过电泳、限制性内切酶分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒。重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后提取总蛋白以SDS-PAGE检测表达情况,同时监测目的蛋白表达前后各时段宿主菌OD600值的变化。结果:筛选出 5株带重组质粒菌,其中有 4株能在大肠杆菌中表达 37kD的特异蛋白,而且随着该外源蛋白的表达,宿主菌生长各时段的OD600值下降。结论:成功地构建了钩体OmpL1蛋白的穿梭表达质粒,并在大肠杆菌中表达出OmpL1融合蛋白,该异源蛋白的表达导致宿主菌的活力降低。本工作为OmpL1蛋白用于钩体病诊断、疫苗研制和致病机制的研究奠定了基础.     

The 75-kilodalton cytoplasmic Chlamydia trachomatis L2 polypeptide is a DnaK-like protein.

The gene coding for the 75-kilodalton cytoplasmic Chlamydia trachomatis L2 polypeptide has been cloned in Escherichia coli, and the nucleotide sequence has been determined. The cloned DNA fragment contained the coding region as well as the putative promoter. The deduced amino acid sequence of the 1,980-base-pair open reading frame revealed 94% homology with a 75-kilodalton protein from C. trachomatis serovar D and 57% homology with the DnaK proteins of E. coli and of Bacillus megaterium, while amino acid homology with human heat shock protein 70 (hsp70) was 42%. The promoter region was identified by computer search and by primer extension of mRNA synthesized in recombinant E. coli. The promoter region which differed from the putative promoter region in serovar D was shown to be a mixed promoter type in which the -10 region showed a regular TATA box configuration while the -35 region showed high homology with heat shock promoters. This mixed promoter was recognized in E. coli.     

Screening of promoters from rhizosphere metagenomic DNA using a promoter-trap vector and flow cytometric cell sorting

We constructed a facilitative and efficient promoter-trap vector, pCM-EGFP, for capturing and analyzing functional promoters from environmental DNA. The pCM-EGFP vector showed good chloramphenicol sensitivity and no enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene expression. Promoter libraries were constructed for screening promoters responding to naringenin, a key molecule released from plant roots. After electroporation, E. coli transformants were incubated in LB broth containing chloramphenicol (10 μg/ml) to select against transformants with no cloned promoter. E. coli cells were sorted using flow cytometry without naringenin, and then sorted again with high fluorescence after incubation in LB broth with naringenin (1 mM) at 28 °C for 12 h. The inducible properties of approximately 400 sorted cells were evaluated, with most cells showing only strong EGFP gene expression without inducible properties. Two clones (5-4E and 15-3D) displayed naringenin inducibility, and both contained a promoter bounded by a TetR-family regulator. The regulator knock-out mutant of the 5-4E clone lost its ability to be induced by naringenin. In conclusion, the pCM-EGFP vector may be used as an efficient promoter-trap vector and a combination of the vector with flow cytometric cell sorting was demonstrated to be an useful method for screening promoters responding to specific conditions or inducers.     

Virulence gene identification by differential fluorescence induction analysis of Staphylococcus aureus gene expression during infection-simulating culture

We have employed a strategy utilizing differential fluorescence induction (DFI) in an effort to identify Staphylococcus aureus genes whose products can be targeted for antimicrobial drug development. DFI allows identification of promoters preferentially active under given growth conditions on the basis of their ability to drive expression of a promoterless green fluorescent protein gene (gfp). A plasmid-based promoter trap library was constructed of 200- to 1,000-bp fragments of S. aureus genomic DNA fused to gfp, and clones with active promoters were isolated under seven different in vitro growth conditions simulating infection. Six thousand two hundred sixty-seven clones with active promoters were screened to identify those that exhibited differential promoter activity. Bioinformatic analysis allowed the identification of 42 unique operons, containing a total of 61 genes, immediately downstream of the differentially active putative promoters. Replacement mutations were generated for most of these operons, and the abilities of the resulting mutants to cause infection were assessed in two different murine infection models. Approximately 40% of the mutants were attenuated in at least one infection model.