人源噬菌体抗体库中血管内皮细胞生长因子抗体的筛选及活性 …

目的 从人噬菌体Ｆａｂ抗体库中选抗人血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）抗体克隆,并对其特异性及活性进行分析,为后续工作奠定基础。方法 从不同人群外周血淋巴细胞提取总ＲＮＡ,经逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）分别扩增轻、重链抗体Ｆａｂ段,用噬菌体表面呈递技术构建抗体库,经过４轮固相筛选及单克隆差异筛选,获得能结合ＶＥＧＦ的抗体克隆。在此基础上通过ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和＾３Ｈ－ＴｄＲ     

人源天然Fab噬菌体抗体库的构建及抗c-Met抗体的筛选?鉴定

目的:构建大容量人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗c-Met特异性抗体并进行初步鉴定.方法:采集20位健康成人的骨髓淋巴细胞.用PCR扩增人Fab片断抗体基因,插入载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab抗体库.以固相化的抗原对抗体库进行6轮筛选后,随机挑选60个克隆用Phage ELISA、BstO I酶切片断分析进行检测,阳性克隆作可溶性表达和鉴定.结果:构建的Fab噬菌体抗体库的库容为1.2×109,从中筛选到1株与c-Met特异性结合的人源抗体克隆,命名为AM2-26.DNA序列分析证明为人免疫球蛋白可变区基因,Western blot证实为人源抗c-Met Fab抗体片段,ELISA特异性鉴定阳性.结论:构建了大容量人源天然Fab抗体库,从中获得1株抗c-Met人源Fab抗体片段,有望为抗肿瘤药物的研制提供新的候选分子.     

人源化Fab段噬菌体抗体库的构建

目的构建人源化Fab噬菌体抗体基因库。方法利用反转录PCR和PCR技术从B细胞淋巴瘤患者外周血淋巴细胞中扩增人IgG抗体重链Fd基因及κ、λ轻链基因,将之克隆入噬菌体载体pComb3,构建人源性Fab噬菌体抗体库,并进行鉴定。结果构建完成了库容量为6.0×108的噬菌体抗体库。结论成功地构建了人源化噬菌体抗体库,为下一步抗CD20抗体的筛选和表达奠定了基础。     

新式SOE PCR高效组装人单链抗体在高容量人天然噬菌体抗体库中的应用

目的探讨新式SOEPCR高效组装人单链抗体在高容量人天然噬菌体抗体库中的应用。方法通过引物设计的改变,将6种人VH基因和11种人VL基因利用两步法直接互相两两连接为人scFv基因,并且与传统的SOE法进行对比。scFv基因用于构建噬菌体单链抗体库。结果新式SOEPCR法成功的将6种人VH基因和11种人VL基因连接成66种不同的人scFv基因,与传统的SOEPCR法相比,效率高且方法简便,经过约130次电转化后,抗体库的总库容为5·58×109。结论成功地改进了传统的SOEPCR方法,高效组装了66种不同的人scFv基因,提高了抗体库的多样性。     

单链噬菌体抗体库的建立

单链噬菌体抗体库的建立孟繁平１杨康鹃２郑承勋１１延边大学医学院微生物学教研室２延边大学医学院生物学教研室关键词抗体；噬菌体；抗原中图法分类号Ｒ３９２．１在机体的免疫系统中，Ｂ细胞受抗原刺激后一方面分化成短命的浆细胞产生抗体，另一方面分化成长命的记忆细...     

抗广州管圆线虫噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的以广州管圆线虫感染的小鼠脾细胞为源,构建抗广州管圆线虫抗体库,并筛选可用于广州管圆线虫病早期诊断的目的抗体。方法提取感染广州管圆线虫的小鼠脾细胞RNA,并逆转录合成cDNA第一链,PCR扩增出抗体轻链和重链基因,将轻、重链基因先后连接到表达载体pComb3上,转化大肠杆菌XLI-Blue,构建组合文库。用广州管圆线虫排泄分泌抗原(EsAg)作为筛选抗原,进行富集筛选,用ELISA法鉴定阳性克隆。结果成功构建了小鼠抗广州管圆线虫噬菌体抗体文库,库容为2.32×106,滴度为1.7×1013cfu/ml。筛选到了抗广州管圆线虫排泄分泌抗原特异性抗体克隆5株,用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行初步鉴定,具有一定的特异性。结论构建的抗广州管圆线虫噬菌体抗体库达到了要求,为研制广州管圆线虫金标诊断试剂盒奠定了基础。     

人源日本血吸虫Fab抗体库的构建及抗独特型抗体的筛选、鉴定

目的:构建人源日本血吸虫Fab抗体库,筛选出日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定。方法:以3名晚期血吸虫患者切除的脾脏为源,构建人源日本血吸虫Fab抗体库。并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达。结果:构建了人源日本血吸虫Fab抗体库,库容为4.3×106,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断。经过5轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取60个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(A3、B6、C4、C17),其中B6经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确。结论:成功构建了人源日本血吸虫Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体B6,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础。     

尘肺病噬菌体单链抗体库的构建及鉴定

目的:构建具有良好多样性的人尘肺病噬菌体单链抗体( ScFv)库.方法:收集25例尘肺病患者外周血标本共50 mL,密度梯度离心法分离淋巴细胞,Trizol法提取总RNA,逆转录后参考文献设计并合成半巢式PCR引物,扩增抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,Linker连接VH和VL,继而连接到噬菌体载体pCANT...     

大容量天然人源Fab抗体库的构建及日本血吸虫抗独特型抗体的筛选、鉴定

目的:构建大容量天然人源Fab抗体库,筛选全人源日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定。方法:采集15位健康成人的骨髓淋巴细胞,构建天然人源Fab抗体库。并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达。结果:构建了2×109大容量天然人源Fab抗体库,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断。经过6轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取80个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(C12、C19、D1、D2),其中C12经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确。结论:成功构建了大容量天然人源Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体C12,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础。     

人源性噬菌体抗体库的构建及抗HFRS病毒抗体的筛选

构建人源性Ｆａｂ噬菌体抗体基因库并筛选可表达与肾综合征出血热病毒抗特异结合之Ｆａｂ抗体的重组克隆。方法利用逆转录,聚合酶链反应等技术从ＨＦＲＳ恢复期患者外周血淋巴细胞中扩增出人ＩｇＧ抗体重链Ｆｄ基因及ｋ轻链基因,将之克隆入噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３,构建人源性Ｆａｂ噬菌体抗钵基因库,并利用噬菌体表面呈现技术,对此抗体库进行淘筛、富集。结果（１）成功地构     

人源甲状腺髓样癌噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的：应用噬菌体抗体展示技术,构建大容量天然人源甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma,MTC）噬菌体单链抗体库。方法：提取ＭＴＣ病人癌周淋巴结总RNA,通过RT-PCR方法获得抗体可变区基因VH和VL基因片断,以它们为模板分别扩增VH-Linker和VL-Linker,再用剪切重叠延伸ＰＣＲ技术将之拼接组装成单链抗体可变区基因片段（single chain fragment variable,scFv）后引入酶切位点SfiⅠ和NotⅠ。将scFv基因克隆入噬菌粒栽体pCANTAB-5E后经电转入大肠杆菌Ecoli TG1,之后经辅助噬菌体M13K07超感染,构建人源MTC噬菌体单链抗体库。PCR鉴定scFv片段阳性插入率,1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆双酶切产物。结果：MTC周围淋巴结总RNA的琼脂糖电泳结果可见清晰的28 S、18 S条带;VH基因的大小约为370 bp,VL基因为350 bp,组装后的scFv基因约为750 bp。用pUC19标准质粒测定转化效率达到108 cfu/μg,scFv的阳性插入率为87.5％（21/24）。结论：成功地构建了人源MTC噬菌体展示文库,为进一步筛选具有MTC细胞特异性的人源噬菌体单链抗体奠定了实验基础。     

噬菌体抗体库的构建及抗AFP人单抗的筛选

目的 运用噬菌体抗体库技术,制备人源性抗ＡＦＰＦａｂ段,为进一步的研究和临床运用打下基础。方法 用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增人免疫球蛋白重链Ｆｄ及к链基因,构建噬菌体抗体库,筛选出人抗ＡＦＰＦａｂ片断,用ＥＬＩＳＡ检测其特异性结果 初步克隆出人抗ＡＦＰＦａｂ,该Ｆａｂ具有结合ＡＦＰ的活性。结论噬菌体抗体库技术绕过了细胞杂交这一步骤,较好的解决人体杂交瘤低效的难题,为人源性单抗的制备开辟了广阔的前景。     

用于大容量人源天然噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定

目的构建一个应用于大容量Fab段天然噬菌体抗体库的表达载体。方法用定点突变技术将表面呈现噬菌粒载体pDF上的BssHⅡ酶切位点改为BglⅡ酶切位点,然后分别在抗体轻链和重链位置插入自杀基因SacB,构建含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB;利用抗乙肝表面抗原抗体的基因为模板,PCR扩增重链和轻链基因片段。将PCR扩增的轻链基因和重链基因分别插入载体pDF-D-SacB内,利用电转化的方法将其转入Trans1-Blue大肠杆菌,构建2个初级质粒,再利用初级质粒超感染BSl365菌,使其轻链与重链发生重组,获得重组质粒,进一步获得抗乙肝表面抗原抗体的噬菌体。之后利用该噬菌体感染大肠杆菌Trans1-Blue进行扩增,得到大量抗乙肝表面抗原的噬菌体抗体。最后,通过酶联免疫吸附剂测定检测所获得的抗体。结果通过向pDF重轻链区域插入SacB基因,改造抗体基因克隆位点,构建了pDF-D-SacB载体;经检测,pDF-D-SacB可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,可以在分泌Cre蛋白酶的细菌胞内发生预期的Cre-Loxp介导的定点重组。结论所获得的含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB适用于构建大容量噬菌体抗体库。     

单剂量破伤风类毒素微球在动物体内的药效

目的:研究经破伤风类毒素聚乳酸微球免疫后的动物体内药效.方法:测定破伤风类毒素聚乳酸微球免疫动物后1年中动物血清抗体反应及疫苗制剂的生物利用度.结果:单剂量聚乳酸微球制剂引起高水平的血清抗体效价,具有与疫苗常规的3次免疫相似的药效.混合微球制剂的相对生物利用度为107.09%.1年后3剂破伤风类毒素溶液引起的免疫记忆抗体效价为5.2×106,而混合微球引起的免疫记忆抗体效价为2.6×107.结论:创制了单剂量疫苗制剂,一次注射完成全程免疫,改进了现有疫苗及免疫接种方法.     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT-PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH-Linker-VL片段）,继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中,连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1,构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接,经电转化E.coliTG1和噬菌体的超感染,构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。