丹参单体IH764-3通过抑制白细胞激活产物减轻人脑微血管内皮细胞的缺氧-复氧损伤

目的探讨丹参单体IH764-3在白细胞介导的脑内皮细胞缺氧-复氧损伤中的作用及机制。方法通过MTT法检测人脑微血管内皮细胞(HBMVEC)的存活;明胶酶谱法检测白细胞MMP-9的释放;荧光定量法检测白细胞内活性氧水平;ELISA法检测白细胞释放细胞因子的水平。结果缺氧-复氧使HBMVEC存活下降,当复氧时加入白细胞激活产物使损伤加重,同时加入IH764-3则具有保护作用。缺氧-复氧使白细胞释放MMP-9增加;细胞内活性氧水平升高;释放的TNF-α、IL-1α、IL-2、IFN-γ增加。IH764-3可呈剂量依赖性减少由缺氧-复氧所致的白细胞分泌MMP-9、ROS和细胞因子增加。结论IH764-3能够减轻白细胞介导的HBMVEC的缺氧-复氧损伤,在脑缺血前及缺血后干预中具有潜在应用价值。     

MMP-9和细胞骨架肌动蛋白参与缺氧缺血诱导的体外血脑屏障模型通透性增加

目的：探讨基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和细胞骨架肌动蛋白（actin）在体外模拟缺氧缺血诱导的血脑屏障（BBB）模型通透性增高中的变化及其机制。 方法: 利用人脐静脉内皮细胞系ECV304与星型胶质细胞（AS）共培养建立体外大鼠BBB模型，模型随机分为正常对照组、缺氧缺血组、BB-1101预处理组。通过γ计数仪检测大分子物质［125I］- 牛血清白蛋白（［125I］- BSA）通透曲线观察BBB通透性的改变，直接免疫荧光和Western 印迹法检测actin表达量及分布的改变，并利用金属蛋白酶抑制剂BB-1101探讨MMP-9是否参与缺氧缺血诱导的BBB通透性增加。 结果: 缺氧缺血刺激后5 h，缺氧缺血组［125I］-BSA的通透量增加、MMP-9表达增加，与对照组比较有显著差异（P<0.01）。直接免疫荧光下观察周边actin丝带模糊，细胞间连接松散，出现裂隙，但表达总量没有变化。BB-1101预处理可以减轻缺氧缺血所致的MMP-9表达增加和对actin连接的破坏，［125I］-BSA通透量低于缺氧缺血组（P<0.01）。结论: 缺氧缺血诱导MMP-9表达增加进而促使actin蛋白重组，是导致BBB通透性增加的机制之一。     

辛伐他汀对不同氧供条件下大鼠脑微血管内皮细胞跨内皮电阻及MMP-9表达的影响

目的:观察在常氧、短暂缺氧、持续缺氧及复氧条件下,辛伐他汀对大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)跨内皮细胞电阻(TEER)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响。方法:原代分离培养SD大鼠BMECs,随机分为常氧组、短暂缺氧组、持续缺氧组、复氧组,各组均实施辛伐他汀0.1μmol/L、1.0μmol/L、10μmol/L3种浓度预处理。观察各组细胞形态学及增殖活性变化;采用TEER评估各组通透性;免疫细胞荧光化学法测定MMP-9蛋白表达。结果:短暂缺氧、持续缺氧及复氧条件下大鼠BMECs细胞受损逐渐加重,MMP-9表达逐渐增加,TEER及细胞增殖活性逐渐下降。辛伐他汀干预能不同程度提高TEER并抑制MMP-9蛋白的表达,使细胞增殖活性提高。但这种抑制MMP-9的作用对短暂缺氧大鼠BMECs的TEER值及细胞增殖活性无显著改善。结论:辛伐他汀能通过抑制MMP-9蛋白的表达来提高持续缺氧及复氧条件下大鼠BMECs的TEER,而对短暂缺氧后TEER的改善作用不明显。     

松弛素保护心肌微血管内皮细胞缺氧复氧损伤的机制

背景：研究报道松弛素可显著改善病理因素导致的心肾功能障碍,抑制心肌肥厚、抗纤维化以及改善缺血再灌注损伤等,但其对内皮细胞缺氧复氧损伤的保护机制尚不明确。目的：探讨松弛素保护心肌微血管内皮细胞缺氧复氧损伤的机制。方法：取生长状态良好的小鼠心肌微血管内皮细胞系(H5V),分3组处理：对照组常规培养33 h,模型组常规培养24 h后给予6 h缺氧+3 h复氧模拟心肌缺氧再灌注损伤,松弛素组常规培养(加180 ng/mL松弛素)24 h后给予6 h缺氧+3 h复氧(加180 ng/mL松弛素)模拟心肌缺氧再灌注损伤。检测细胞通透性与Caspase-3的表达,细胞上清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6水平,RT-PCR检测细胞中钙黏蛋白、Akt1、GSK-3β mRNA表达;Western blot检测细胞中钙黏蛋白、Akt、GSK-3β蛋白表达。结果与结论：(1)与对照组比较,模型组细胞通透性增强(P <0.05),细胞内Caspase-3表达升高(P <0.05);与模型组比较,松弛素组细胞通透性降低(P <0.05),细胞内Caspase-3表达降低(P &l...     

PLGF通过激活Rho/ROCK信号通路介导人脑微血管内皮细胞间紧密连接开放

目的 探讨胎盘生长因子(PLGF)影响人脑微血管内皮细胞(HBMEC)间通透性的分子机制.方法 利用HBMEC构建体外血脑屏障模型,测定跨内皮细胞电阻抗(TEER)及检测HRP通过率,分析PLGF对血脑屏障完整性的影响;用Western blot法及免疫荧光法检测HBMEC间紧密连接相关蛋白质occludin和ZO-1的表达及分布,用蛋白激酶抑制剂干预和Western blot法检测Rho蛋白活性.结果 25 ng/mL PLGF 30 min显著降低体外血脑屏障模型TEER,使其通透性增高(P＜0.05);增加S-occludin表达的同时降低了IS-occludin的表达,使ZO-1蛋白在细胞周边分布减少;此外,ROCK蛋白激酶抑制剂Y27632抑制了PLGF引起的体外血脑屏障透过性增高(P＜0.05),并激活细胞内Rho激酶活性.结论 PLGF通过激活HBMEC内Rho/ROCK信号通路,影响HBMEC间紧密连接完整性,进而改变血脑屏障的通透性.     

Epsin2基因沉默对小鼠内皮细胞体外血脑屏障模型的影响

目的:研究使用小干扰RNA(siRNA)特异性沉默体外血脑屏障模型中小鼠脑微血管内皮细胞系b. End3细胞中Epsin2的表达后对血脑屏障模型的功能及VEGFR2、ZO1、occludin表达的影响。方法:使用化学合成的siRNA特异性干扰b. End3细胞Epsin2的表达,免疫荧光、Western Blot检测转染后细胞Epsin2、VEGFR2、ZO1、occludin的表达。体外血脑屏障模型分为对照组(control)和Epsin2-siRNA干扰组(Epsin2-siRNA),Control组使用正常b. End3细胞建立体外血脑屏障模型,Epsin2-siRNA组使用Epsin2-siRNA转染后b. End3细胞建立体外血脑屏障模型,分别于建模24、48、72 h后进行跨内皮电阻测定,48 h辣根过氧化物酶(HRP)渗透试验测定血脑屏障模型功能。结果:转染后b. End3细胞Epsin2免疫荧光和Western Bolt结果均提示表达下降(P 0. 05)。随着Epsin2的表达下降,VEGFR2表达随之下降,ZO1、occludin表达上升(P 0. 05)。Epsin2-siRNA组TEER值与Control组比,48 h后Control组与Epsin2-siRNA组TEER均升高,但Epsin2-siRNA组升高幅度高于Control组,差异有统计学意义(P 0. 05); 72 h后Epsin2-siRNA干扰组TEER进一步升高且与Control组相比差异有统计学意义(P 0. 05);共培养48 h后Epsin2-siRNA干扰组通透性明显低于Control组,且有统计学差异(P 0. 05)。结论:Epsin2的表达能够影响血脑屏障相关分子的表达,从而影响血脑屏障功能。     

DADLE对SH-SY5Y细胞缺氧复氧损伤的保护作用

目的：探讨[D-Ala2,D-Leu5] enkephalin（ DADLE）对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 细胞的缺氧复氧的保 护作用。方法：将体外培养的SH-SY5Y 细胞分别缺氧6 、12、24 h 和48 h,均复氧4 h 后观察细胞形态改变,采用 MTT法检测细胞生存率,评估细胞损伤程度。在此基础上,于缺氧12 h 期间首先给予DADLE 100 pmol/L 作用于 细胞,评价DADLE能否减轻神经细胞缺氧复氧损伤;继而分别用10 pmol/L、100 pmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L 和100 nmol/L 不同浓度的DADLE溶液处理细胞,研究DADLE保护作用是否具有剂量效应关系。结果：SH-SY5Y 细胞缺氧6、12、24 h 或48 h,复氧4 h 后,细胞生存率分别为（68.1±4.3）％、（52.6±2.8）％、（26.7±1.5）％ 或（3.5±1.7）％。SH-SY5Y 细胞缺氧12 h 期间给予DADLE 100 pmol/L 处理可使细胞生存率上升到（58.7±0.46）%。 5 个给药浓度中,10 pmol/L 和100 pmol/L DADLE可使神经细胞生存率上升,而1、10 nmol/L 和100 nmol/L 则变 化不明显。结论：DADLE对SH-SY5Y 的缺氧复氧损伤具有保护作用,且其保护效果呈现出较小剂量优于较大剂量 的量效关系,本实验中最佳保护剂量为10 pmol/L。     

缺氧、复氧条件下低氧反应元件（HRE）对心肌细胞转染hVEGF165基因表达的调控作用

目的：探讨缺氧、复氧条件下，低氧反应元件(HRE)作为氧条件基因表达控制开关，对心肌细胞转染rAAV-HRE9-hVEGF165基因表达的调控作用。方法:分离新生SD大鼠心肌细胞,采用无血清培养,将在HEK293T细胞进行包装后获得的腺相关病毒转染培养的心肌细胞。实验共分为8组：Ⅰ组（空白对照组）：常氧培养 24 h（氧浓度21％）；Ⅱ组（缺氧对照组）：常氧培养16 h，缺氧8 h（氧浓度1％）；Ⅲ组（转基因对照组）：常氧培养 24 h；Ⅳ组（转基因缺氧1组）：转基因后缺氧8 h；Ⅴ组（复氧1组）：常氧培养16 h，缺氧8 h、复氧4 h；Ⅵ组（复氧2组）：常氧培养16 h，缺氧8 h、复氧8 h；Ⅶ组（复氧3组）：常氧培养16 h，缺氧8 h、复氧12 h；Ⅷ组（转基因缺氧2组）：转基因后常氧培养16 h，缺氧20 h。ELISA法测定培养液VEGF蛋白含量；细胞免疫荧光染色及RT-PCR分别检测细胞内VEGF蛋白及VEGF165 mRNA的表达。结果:95%的培养心肌细胞可见自律搏动，cTn-I染色阳性率为86%；病毒转染率约为87%。Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ组培养液中VEGF蛋白含量显著高于其它各组（P<0.01），细胞免疫荧光VEGF蛋白染色呈阳性；RT-PCR测定显示，Ⅳ、Ⅴ及Ⅷ组可见484 bp目的条带。结论：rAAV-HRE9-hVEGF165可成功地转染原代培养心肌细胞，在缺氧环境下，受HRE的调控，VEGF165 mRNA及VEGF165蛋白可有效表达，而在常氧状态下，目的基因的表达及蛋白合成即行中止。     

腺苷对肺癌脑转移的影响及其可能机制

目的探讨腺苷对肺癌脑转移的影响及其可能机制。方法采用Western blot法检测肺癌细胞内缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)和血脑屏障脑微血管内皮细胞上的紧密连接蛋白ZO-1的表达水平;应用ELISA法测定肺癌细胞培养液内腺苷的含量。采用荧光分析法检测体外血脑屏障模型的通透性改变;用Hemocytometer计数Transwell下室的A549肺癌细胞数。结果肺癌细胞中HIF-1的表达和肺癌细胞培养液内腺苷含量均于肺癌细胞缺氧12 h时达最高水平。与此同时,血脑屏障ZO-1蛋白的表达最低,血脑屏障通透性最大(7. 11),透过血脑屏障模型的肺癌细胞数最多(84. 6)。腺苷引起血脑屏障通透性增加,其变化趋势与缺氧肺癌细胞培养液的作用一致。结论缺氧可引起肺癌细胞释放腺苷增多,增多的腺苷导致血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1表达减少,导致血脑屏障通透性增大,最终引起肺癌脑转移。     

钙敏感受体表达增加诱发内质网应激在缺氧复氧性心肌损伤中的作用

目的：观察钙敏感受体表达增加诱发内质网应激在缺氧复氧性心肌损伤中的作用。方法:乳鼠原代心肌细胞培养4-5 d后，随机分为5组:正常对照组（N组）、缺氧/复氧组（H/Re组）、阻断剂（NiCl2,CdCl2）组、激动剂（GdCl3,NiCl2,CdCl2）组和caffeine组。采用饱和氮气pH6.8的D-Hands液培养细胞3 h，再用含20%新生牛血清的DMEM液培养细胞9 h，复制心肌缺氧/复氧模型。检测血清LDH活力，MTT检测细胞存活率，心肌细胞caspase-12和CaSR 蛋白表达水平Western blotting检测, 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）测定心肌细胞内游离钙的变化。结果:缺氧/复氧组和激动剂组LDH活力、细胞内游离钙浓度均高于对照组;同时，caspase-12和CaSR的表达也明显高于对照组。反之，细胞存活率低于对照组。结论:心肌缺氧/复氧过程中，钙敏感受体表达增多,从而破坏了细胞内钙稳态诱发过度的内质网应激,通过caspase-12等凋亡蛋白表达的增多等途径引起心肌细胞凋亡。     

缺氧状态下体外培养成骨细胞血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达及意义

目的研究缺氧对体外培养成骨细胞血管内皮生长因子（VEGF）和骨形态发生蛋白2（BMP-2）表达的影响及意义。方法采用酶消化法获取人成骨细胞并进行原代培养，倒置显微镜下观察成骨细胞的生长形态；采用Gomori改良钙钴法和免疫组织化学SABC法分别检测原代培养成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（OCN）的表达，进行原代培养成骨细胞鉴定。细胞传至第2代时，按继续培养条件的不同将细胞分为缺氧组（氧分压〈4．8kPa、氧容积比〈5％）和常氧组，在传代培养24、48、72h时分别收集2组细胞，采用免疫组织化学SABC法检测VEGF和BMP-2的表达，应用图像分析系统进行半定量检测，结果以平均灰度值表示，平均灰度值低示表达水平高。结果原代培养成骨细胞可表达ALP和OCN，初步确定经体外培养获得了具有生物活性的成骨细胞。在培养24、48、72h时，缺氧组成骨细胞VEGF表达水平均明显高于常氧组（平均灰度值分别为123．53±7．38 vs 141．21±6．03、116．45±6．34 vs 138．37±5．04、108．11±5．37 vs 136．65±6．54，均P〈0．01），且缺氧组成骨细胞VEGF表达水平随缺氧时间延长而逐渐升高。缺氧组成骨细胞BMP-2表达水平在培养24h时明显高于常氧组（平均灰度值为143．28±2．82 vs 146．91±2．06，P〈0．01），而在培养48、72h时与常氧组比较，差异均无统计学意义。结论缺氧可诱导成骨细胞VEGF的表达上调；而缺氧延长则不利于成骨细胞BMP-2的表达。缺氧对VEGF和BMP的早期表达调控可能与骨修复的启动相关。     

血脑屏障氧糖剥夺体外模型中缺氧诱导因子-1α的表达及血脑屏障通透性的变化

目的研究血脑屏障氧糖剥夺体外模型中缺氧诱导因子-1α和紧密连接相关蛋白claudin-5的表达及血脑屏障通透性变化。方法提取纯化大鼠脑微血管内皮细胞,建立血脑屏障氧糖剥夺模型,模拟在体缺血,在氧糖剥夺不同时间点(0、30、60、120、240min),应用EVOM测定仪测定培养的脑微血管跨内皮细胞内皮阻抗值,分析血脑屏障的通透性;应用辣根过氧化物酶渗漏实验分析血脑屏障的通透性;应用Westernblot法分析大鼠脑微血管内皮细胞的缺氧诱导因子-1α和紧密连接相关蛋白claudin-5的表达。结果与正常对照组相比,氧糖剥夺30min,缺氧诱导因子-1α表达增加,辣根过氧化物酶流量升高;氧糖剥夺60min达峰值;氧糖剥夺120min、240min,逐渐降低,但仍高于正常对照组。氧糖剥夺30min,跨内皮阻抗值降低,claudin-5表达减少,在60min最低;120min、240min表达逐渐升高,但仍低于正常对照组。结论氧糖剥夺30min至240min,缺氧诱导因子-1α和claudin-5表达及血脑屏障通透性改变明显,氧糖剥夺60min达峰值。     

肿瘤细胞化疗后99Tcm-DTPA-DG摄取研究

 目的 探讨 99Tcm 标记二乙三胺五乙酸葡糖胺（99Tcm- DTPA-DG）在恶性肿瘤化疗早期疗效监测中的应用价值。 方法 将体外培养肺癌细胞 A549、结肠癌细胞 HT-29 和乳腺癌细胞 MCF-7 各分为加入化疗药物的化疗组和不加化疗药物的阴性对照组，所选化疗药物分别为顺铂、5-氟尿嘧啶、紫杉醇。化疗药作用 6 h 后，荧光倒置显微镜下观察各化疗组和对照组细胞形态变化，并行磷脂结合蛋白 V（AV）/ 碘化丙啶（PI）双标记染色，采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率，化疗药作用 4 h 后，各化疗组和对照组分别加入 37 MBq/L 的 99Tcm-DTPA-DG 各 0.1 ml，反应 2 h，用 γ 测量仪检测 99Tcm-DTPA-DG 摄取率。 结果 经单用化疗药作用后，3 种肿瘤细胞在荧光倒置显 微镜下观察均可见凋亡小体形成。流式细胞仪检测也均 出现凋亡峰。化疗组和对照组的凋亡率肺癌细胞分别为 43.60% ± 2.82% 和 1.21% ± 0.15%，结肠癌细胞分别为 32.42% ± 2.02% 和 2.04% ± 0.23%，乳腺癌细胞分别为 52.33% ± 2.72% 和 1.31% ± 0.10%，差异均有统计学意义 （P < 0.01）。γ 测量仪检测显示 3 种肿瘤细胞化疗组 99Tcm-DTPA-DG 摄取率均明显低于对照组（肺癌细胞分别为 0.44% ± 0.02%、0.79% ± 0.12%，结肠癌细胞分别为 0.35% ± 0.13%、0.58% ± 0.23%，乳腺癌细胞分别为 0.28% ± 0.05%、0.65% ± 0.18%，均P < 0.01）。结论 99Tcm-DTPA-DG 是一种可望用于肿瘤化疗效果早期评估的靶向分子显像剂。     

BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function

The blood-brain barrier (BBB) is a unique feature of the human body, preserving brain homeostasis and preventing toxic substances to enter the brain. However, in various neurodegenerative diseases, the function of the BBB is disturbed. Mechanisms of the breakdown of the BBB are incompletely understood and therefore a realistic model of the BBB is essential. We present here the smallest model of the BBB yet, using a microfluidic chip, and the immortalized human brain endothelial cell line hCMEC/D3. Barrier function is modulated both mechanically, by exposure to fluid shear stress, and biochemically, by stimulation with tumor necrosis factor alpha (TNF-α), in one single device. The device has integrated electrodes to analyze barrier tightness by measuring the transendothelial electrical resistance (TEER). We demonstrate that hCMEC/D3 cells could be cultured in the microfluidic device up to 7 days, and that these cultures showed comparable TEER values with the well-established Transwell assay, with an average (± SEM) of 36.9 Ω.cm² (± 0.9 Ω.cm²) and 28.2 Ω.cm² (± 1.3 Ω.cm²) respectively. Moreover, hCMEC/D3 cells on chip expressed the tight junction protein Zonula Occludens-1 (ZO-1) at day 4. Furthermore, shear stress positively influenced barrier tightness and increased TEER values with a factor 3, up to 120 Ω.cm². Subsequent addition of TNF-α decreased the TEER with a factor of 10, down to 12 Ω.cm². This realistic microfluidic platform of the BBB is very well suited to study barrier function in detail and evaluate drug passage to finally gain more insight into the treatment of neurodegenerative diseases.     

线粒体钙单向转运体在心肌低氧预处理中的作用

目的：观察线粒体钙单向转运体在低氧预处理心肌保护中的作用及其与线粒体通透性转换孔之间的关系。 方法： 采用Langendorff灌流离体大鼠心脏模型,记录左室发展压（LVDP）、左室压上升/下降最大速率（±dp/dtmax）和左室舒张末期压力（LVEDP）。结扎冠脉左前降支30 min作为低氧,松开结扎复氧120 min。全心停灌5 min复氧5 min两个循环作为低氧预处理。用紫外分光光度法检测复氧5、10、15、20和30 min的冠脉流出液乳酸脱氢酶（LDH）活性。用TTC染色法测心肌梗死面积。 结果： 低氧预处理和低氧后复氧期的前10 min用钌红（5 μmol/L）处理均可促进LVDP、±dp/dtmax和LVEDP的恢复，减小心肌梗死面积，减少LDH释放。复氧期的前10 min用精胺(20 μmol/L)处理可减弱低氧预处理的心脏作用。用环孢菌素A（0.2 μmol/L）处理20 min（复氧前5 min到复氧期的前15 min）则减弱上述精胺在低氧预处理中的心肌作用。 结论： 低氧预处理引起的心肌保护机制可能涉及线粒体钙单向转运体活动及其线粒体通透性转换孔开放的抑制。     

线粒体渗透转换孔在肿瘤坏死因子α诱导的抗心肌缺氧/复氧损伤中的作用

目的：研究肿瘤坏死因子α（TNFα）诱导的抗心肌缺氧/复氧损伤的保护作用是否与抑制线粒体渗透转换孔的开放有关。 方法： 采用离体大鼠心脏灌流方法，结扎冠状动脉左前降支30 min和复氧120 min复制局部缺氧/复氧损伤模型，测定心肌梗死面积、冠脉流出液中乳酸脱氢酶（LDH）含量及各项心室力学指标。 结果： 与单纯缺氧/复氧组相比，1×104 U/L TNFα预处理明显降低心脏缺氧/复氧后的梗死面积和复氧期冠脉流出液中LDH含量，促进左室发展压、左室做功和左室舒张末压力的恢复。线粒体渗透转换孔开放剂atractyloside和钙激活钾通道阻断剂paxilline减弱了TNFα的作用。 结论： TNFα诱导的抗心肌缺氧/复氧损伤的保护作用可能与其抑制线粒体渗透转换孔的开放及促进钙激活钾通道的开放有关。     

NADPH氧化酶亚单位nox-1在心肌细胞急性缺氧复氧损伤时的变化及心肌营养素-1的作用

目的： 探讨心肌细胞急性缺氧复氧损伤时NADPH氧化酶亚单位nox-1的变化及心肌营养素-1的作用。方法: 用改良的方法培养出生1-３ d的乳鼠心肌细胞,分为6组：(1)对照组;(2)缺氧复氧组;(3)缺氧复氧+CT-1组;(4)缺氧复氧+CT-1+LY294002组 (PIK3/Akt 阻断剂);（5）缺氧复氧+CT-1+PD98059组（ERK 阻断剂）;（6）缺氧复氧+CT-1+助溶剂DMSO组。 CT-1 的浓度为10 μg/L。MTS法测定心肌细胞的存活率,四氯四乙基苯丙咪唑基羰化青碘化物（JC1）检测心肌细胞线粒体膜电位(Δψm),二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-CA）检测细胞活性氧（ROS）,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率。Nox-1蛋白采用Western blotting检测。结果: 缺氧复氧培养后心肌细胞凋亡率及细胞内ROS较对照组明显增加,分别是(19.7%±1.4% vs 2.1%±0.5%, 14.07%±1.25% vs 3.54%±0.86%, P<0.05),而心肌细胞存活率显著降低,线粒体膜电位（Δψm）下降;nox-1表达明显升高。CT-1处理的心肌细胞,较缺氧复氧组心肌细胞存活率明显上升 (87.0%±7.3%),而心肌细胞凋亡率及细胞内ROS 显著减少,Δψm水平增加,nox-1蛋白表达下调。而CT-1的这些作用能被PIK3/Akt和ERK阻断剂抑制。结论: 心肌细胞急性缺氧复氧损伤时NADPH氧化酶亚单位nox-1表达上调,而心肌营养素-1能通过下调nox-1表达,发挥对心肌细胞保护作用。     

MK801 blocks hypoxic blood-brain-barrier disruption and leukocyte adhesion

The aim of the present study was to examine the signaling pathways of hypoxia followed by reoxygenation (H/R)-induced disruption of the blood-brain-barrier (BBB) in a co-culture of astrocytes and brain endothelial cells (BEC) in vitro. We analyzed the possible stabilizing effect of MK801, a highly selective N-methyl-d-aspartate receptor (NMDAR) antagonist, on BBB integrity. Levels of reactive oxygen species (ROS), glutamate (Glut) release and monocyte adhesion were measured under normoxia and H/R. BBB integrity was monitored measuring the trans-endothelial electrical resistance (TEER). TEER values dropped under H/R conditions which was abolished by MK801. Glut release from astrocytes, but not from endothelial cells was significantly increased under H/R, as were ROS levels and monocyte adhesion. The oxidative stress was blocked by MK801 and the NAD(P)H-oxidase inhibitor apocynin. We observed that calcium (Ca(2+)) signaling plays a crucial role during ROS generation and monocyte adhesion under H/R. ROS levels were decreased by applying ryanodine, a blocker of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum (ER) and by lowering the extracellular Ca(2+) concentration. Xestospongin C, which blocks IP(3) mediated Ca(2+) release from the ER did not alter ROS production under H/R conditions. These findings indicate that both extracellular Ca(2+) influx and ryanodine-mediated intracellular Ca(2+) release from the ER during H/R contribute to ROS formation at the BBB. Blocking ROS or Ca(2+) signaling prevented H/R-induced monocyte adhesion to BEC. We conclude, that the activation of NMDAR under H/R by Glut increases intracellular Ca(2+) levels, contributes to BBB disruption, ROS generation and monocyte adhesion.     

DegraPol支架上培养人气管软骨细胞体外合成组织工程软骨

 目的　探讨以人气管软骨细胞（HTC）为种子细胞在新型生物材料DegraPol泡沫支架上体外合成组织工程气管软骨的可行性。方法　从肺移植供体（9例）取人气管软骨片段，胶原酶消化，将所获软骨细胞传代培养，将传代至6～8代的HTC种植到DegraPol支架上体外静态培养。种植前行II型胶原免疫组织化学染色。于体外静态培养第2 小时末和第 3、7、21、42 天取HTC-DegraPol复合物用噻唑蓝（MTT）法测定细胞增殖活性；培养3周后取HTC-DegraPol复合物制备组织学检测标本行阿辛蓝染色观察硫酸软骨素分泌情况，并制备扫描电镜标本观察HTC在DegraPol支架中培养后的超微结构。结果 HTC在传代培养中显示稳定的增殖活性并分泌II型胶原。种植到DegraPol支架中后培养2 h和3、7、21、42 d时MTT法测定的A值分别为0.112±0.004、0.151±0.021、0.170±0.035、0.176±0.023和0. 213±0.023（每个时点n=4）。培养21、42 d与培养2 h比较， 活性HTC数量差异均有统计学意义（P<0.05）。阿辛蓝染色显示HTC-DegraPol复合物的基质分泌硫酸软骨素，证实HTC- DegraPol复合物具有软骨样结构。扫描电镜观察显示新生软骨在DegraPol材料表面和中央均有形成，但以表面为主。结论　HTC可以在体外良好扩增并以多孔生物材料DegraPol为支架体外合成组织工程气管软骨，但培养条件应进一步优化。