从Hep-2细胞克隆hVEGF165/VEGF121基因及序列分析

目的 从Hep-2(喉鳞癌细胞)克隆hVEGF165、hVEGF121cDNA并重组到克隆载体中，用于下一步构建表达VEGF165、VEGF121的腺病毒载体。方法 设计和合成引物，提取Hep-2细胞的总mRNA，进行逆转录～聚合酶链反应(RT-PCR)，扩增出两个目的cDNA，并将其重组到pGEM-T Easy载体中送测序。结果 从Hep-2细胞的总mRNA中反转录扩增得到588bp和456bp的片段，经重组送测序证实两基因分别与GenBank中的［GI：19909064]及[GI：6631028]提供序列完全一致。结论 从Hep-2细胞我们成功获得VEGF165、VEGF121的cDNA并构建其克隆载体可供进一步研究。     

小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因表达检测及真核表达载体构建

目的 检测及克隆小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因,构建真核表达载体。方法 设计寡核苷酸探针。应用原位分子杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因的mRNA表达,RT-PCR法从A20细胞总RNA中获取mCD99L2基因含编码区全长cDNA,克隆入T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定;设计含酶切位点的PCR引物,PCR获取含mCD99L2基因编码区片段,用限制性内切酶EcoRI和Xho I双酶切取所需目的片段．利用分子克隆技术与pcDNA3．1／MycHisC（＋）质粒重组,对产生的重组子进行PCR、双酶切鉴定,并经过测序证实。结果 原位杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因mRNA呈阳性表达;RT-PCR法成功获得mCD99L2基因编码区全长cDNA序列,DNA序列测序结果与GenBank提供的已知序列（NM—138309）比较,结果完全一致;重组质粒pcDNA3．1．mCD99L2中的插入片段经DNA测序后与GenBank中mD99L2基因相应序列比较,100％同源。结论 小鼠B淋巴瘤A20细胞株存在mCD99L2基因,采用RT-PCR和T．A技术克隆了A20细胞的mCD99L2基因,成功构建了pcDNA3．1．mCD99L2真核表达载体,为下一步探索mCD99L2基因在小鼠B淋巴瘤A20细胞株中的功能奠定了实验基础。     

CD47-shRNA慢病毒载体构建及其介导Hep-2细胞CD47基因沉默效应鉴定

目的构建CD47靶向shRNA慢病毒干扰载体,并观察其对Hep-2细胞CD47基因的抑制效应。方法设计CD47靶点特异性的寡核苷酸序列,利用酶切反应合成含特异性系列线性化的pGCSIL-GFP载体,包装293T细胞产生慢病毒并行滴度测定,再转染人喉癌Hep-2细胞,通过实时荧光定量PCR及Western Blotting检测重组慢病毒对CD47靶基因在mRNA和蛋白水平上的沉默抑制情况。结果阳性克隆PCR及测序证实针对CD47基因shRNA慢病毒干扰载体构建成功,RT-PCR及Western Blotting检测载体在mRNA和蛋白水平上可抑制喉癌Hep-2细胞的CD47表达。结论成功构建针对CD47基因的慢病毒干扰载体,为进一步行喉癌CD47基因功能研究提供了较好的实验工具。     

蛋白激酶CK2α亚基cDNA的克隆与序列分析

目的构建人蛋白激酶CK2α重组质粒,研究CK2结构和功能.方法采用RT-PCR、定向克隆和DNA测序方法进行实验.结果通过BT-PCR从Hep-3B肝癌细胞中获得人蛋白激酶CK2α(Protein Kinase 2α)亚基编码区1136bp的cDNA片段,将扩增基因通过粘端连接克隆到pUCm-T载体中,用PCR和限制性内切酶分析鉴定,表明获得重组质粒pUCm-T-CK2α.通过对CK2α编码区cDNA序列测序证实其与GeneBank中登记号为NM-01895的序列一致.结论成功构建了重组质粒pUCm-T-CK2α,为利用CK2αcDNA作为探针进行深入研究奠定了基础.     

日本血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基全长cDNA的克隆与功能分析

目的对用表达序列标签(EST)策略从日本血吸虫(Schistosomajaponicum)尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行全长cDNA克隆及功能预测。方法将插入于pTriplEx2 质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTn程序搜索,发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit, eIF2α) 基因高度同源。根据该EST序列设计与pTriplEx2 质粒上的5'端测序引物相匹配的PCR下游引物,从该cDNA文库中扩出包含eIF2α全长ORF的cDNA片段。将PCR产物纯化后克隆到pGEM-T载体上,并对此克隆进行测序得到其全长cDNA序列。用NCBI 站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索;用blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较。同时用网上分析软件进行基序和保守区域的搜索。结果发现一个与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源的日本血吸虫新基因,核苷酸与氨基酸水平的同一性分别为87%和79%,编码由327个氨基酸组成的蛋白序列。结论用EST策略筛选到一个日本血吸虫新基因,编码eIF2α亚基,全长编码序列与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源。     

日本血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基全长cDNA的克隆与功能分析

目的 对用表达序列标签(EST)策略从日本血吸虫(Schistosoma japonicum)尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行全长cDNA克隆及功能预测。方法 将插入于pTriplEx2质粒上的cDNA进行测序，测序结果经BLAS Tn程序搜索，发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit，elF2α)基因高度同源。根据该EST序列设计与pTriplEx2质粒上的5′端测序引物相匹配的PCR下游引物，从该cDNA文库中扩出包含eIF2α全长ORF的cDNA片段。将PCR产物纯化后克隆到pGEM-T载体上，并对此克隆进行测序得到其全长cDNA序列。用NCBI站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索；用blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较。同时用网上分析软件进行基序和保守区域的搜索。结果 发现一个与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源的日本血吸虫新基因，核苷酸与氨基酸水平的同一性分别为87％和79％，编码由327个氨基酸组成的蛋白序列。结论 用EST策略筛选到一个日本血吸虫新基因，编码eIF2α亚基，全长编码序列与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源。     

人PPARα受体cDNA全长序列的克隆及测序

目的对人过氧化物酶体增殖物激活受体α(hPPARα)全长cDNA序列进行克隆并测序,为构建含hPPARα基因真核表达载体奠定基础。方法通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从HepG2细胞总RNA克隆hPPARα全长cDNA序列,胶回收目的条带后与pMD19-T载体连接并转化DH5α感受态菌,用BamH I、Sal I双酶切及基因测序筛选鉴定阳性克隆pMD19-hPPARα-T载体中hPPARα基因的完整性和忠实性。结果经酶切和DNA测序证实pMD19-hPPARα-T载体中插入的hPPARα基因序列与GeneBank中提交的序列(NM001001928)一致。结论成功克隆了hPPARα基因,构建了pMD19-hPPARα-T中间载体,为含hPPARα基因真核表达载体的构建奠定了基础。     

一个新的C2H2型锌指蛋白cDNA基因的克隆

目的：从K562细胞中克隆新的锌指蛋白cDNA基因片段。方法：提取K562细胞中总RNA,逆转录后,用CX2C和H－C Link引物进行加端PCR,扩增产物经限制性内切酶酶切后,重组至pGEMTZf( )载体,用末端终止法测定插入片段的序列。结果：测出五个插入片段的序列。与GenBank核酸数据库中的已知序列进行同源性比较分析,发现一个序列为新的cDNA基因片段。该基因编码产物至少含有五个C2H2型锌指结构。结论：从K562细胞中克隆出一个新的C2H2型锌指蛋白cDNA基因片段,为测定该基因的全序列和功能研究奠定了基础。     

大鼠FasL全长cDNA真核质粒的构建及转染HepG2细胞体外诱导细胞凋亡的作用

目的观察HepG2细胞过表达FasL介导细胞凋亡的作用。方法从大鼠睾丸细胞中扩增出rFasL全长cDNA,亚克隆到T载体中,再克隆到pDC315载体中。转染HepG2细胞后用RT-PCR、Wester blot检测rFasL mRNA和蛋白表达,培养48h后收集细胞计数,进行比较分析。结果 rFasL cDNA序列与其在Genbank中的序列完全一致。rFasL真核表达载体转染HepG2细胞后能表达rFasL mRNA和蛋白;转染pDC315-rFasL的实验组HepG2细胞大量死亡。结论成功克隆了rFasL基因并构建其真核表达载体,证明能有效表达于HepG2中,表达FasL的HepG2细胞通过Fas-FasL结合介导周围及自身表达Fas的HepG2细胞凋亡。     

大鼠Kir6.2基因真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的 克隆Kit6.2基因,构建真核表达载体pcDNA3.0/Kir6.2,将重组质粒转染HEK293细胞获得高表达Kir6.2基因的细胞克隆.方法 从SD大鼠脑组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得Kit6.2基因的全长cDNA,插入TI-simple克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pcD...     

靶向FAK的siRNA对喉癌细胞增殖及侵袭能力的抑制作用

目的 运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术阻断喉癌Hep-2细胞株中FAK基因的表达,探讨FAK基因沉默后对Hep-2细胞株产生的影响.方法 针对FAK基因,构建2条干扰重组质粒FAK-pGenesil-CH1和FAK-pGen-esil-CH2,1条阴性对照重组质粒FAK-pGenesil-HK;在脂质体的介导下转染喉癌Hep-2细胞株,用RT-PCR和Westem blot分析FAK mRNA及蛋白的表达;MTT法、流式细胞技术及体外侵袭实验测定十扰重组质粒对Hep-2细胞株的增殖、侵袭能力的影响.结果 重组质粒能有效地阻断Hep-2细胞株中FAK基因在mRNA和蛋白水平上的表达(P<0.05);重组质粒转染Hep-2细胞后,细胞增殖抑制率分别为58.34%、52.78%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);干扰组G0~G1期细胞增多,S期细胞数量明显减少(P<0.05);FAK-pGenesil-CH1、FAK-pGenesil-CH2作用Hep-2细胞株48 h后,Hep-2细胞穿过Matrigel膜的个数分别为(56.0±6.7)、(51.0±5,1),与阴性对照组(152.0 ±9.4)、正常对照组(139.0 ±8.1)比较有统计学差异(P<0.05).结论 干扰重组质粒能有效地抑制转染Hep-2细胞株的FAK mRNA及蛋白的表达,并能抑制Hep-2细胞株的增殖及侵袭能力.     

融合自杀基因CDglyTK治疗喉癌的体外实验研究

目的 研究融合自杀基因CDglyTK治疗喉癌。方法 PCR扩增、酶切、连接、转化等构建质粒表达栽体pcDNA3．1（-）CMVCDglyTK，XhoⅠ／HindⅢ酶切鉴定，测序分析CDglyTK基因序列。建立稳定表达CDglyTK基因的Hep-2细胞株，RT—PcR及Western-blotting鉴定CDglyTK基因的表达。MTT法观察5-FC、GCV、5-FC＋GCV对表达CDglyTK基因的Hep-2细胞生长的抑制作用。结果 酶切和基因测序分析证明重组质粒含完整的CD及TK基因，RT—PCR从转染细胞总RNA中扩出707bp的预期片段。West—era-blotting检测到该基因表达的59kDa的蛋白。表达CDglyTK基因的Hep-2细胞在5一FC、GCV、5-FC＋GCV干预下生长受到抑制，5-FC与GCV联合有更强的杀伤效应。结论 CDglyTK融合自杀基因可以成为基因治疗喉癌的有效方法。     

IGF-1和FGF-2对神经母细胞瘤细胞分化及SOCS表达的影响

目的 研究胰岛素样生长因子-1（IGF-1）与碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）对神经细胞增殖与分化的共同作用，并探讨SOCS基因表达与二者作用的关系。方法 选用人类神经母细胞瘤SK-N-MC细胞系作为神经细胞的体外模型，分别用IGF-1，FGF-2及联合应用IGF-1和FGF-2处理细胞，于处理后24、48和72h分别观察细胞数量、形态学变化；收获培养48h的细胞，提取总RNA，用RT-PCR法检测SOCS1、2、3 mRNA的表达。结果 处理后24h各组细胞数量及形态无明显变化；处理后48、72h IGF-1组细胞数量较对照组增多，形态上无明显变化，SOCS2 mRNA表达显著下调；FGF-2组细胞数量减少，形态呈明显分化，SOCS2 mRNA表达高于对照组：而IGF-1和FGF-2联合组细胞数量、形态及SOCS2 mRNA表达变化与FGF-2组相似，但程度上更加显著。结论 FGF-2可以削减IGF-1所诱导的人类神经母细胞瘤细胞的增殖作用，而SOCS2 mRNA表达上调可能为其作用机制之一。     

Rel A在喉癌Hep-2细胞系中的表达和意义

目的:研究Rel A基因在人喉癌Hep-2细胞中的表达及意义。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法和免疫细胞组织化学技术分别检测Rel A基因的mRNA和蛋白在人喉癌细胞系Hep-2和人正常永生化表皮细胞系Hacat中的表达。结果:Rel A基因的mRNA在Hep-2细胞中高表达,在Hacat细胞中低表达(P<0.05)。Rel A基因的蛋白在Hep-2细胞中高表达且主要表达于细胞浆,在Hacat细胞中低表达(P<0.05)。结论:Rel A基因的高表达可能与喉癌发生、发展有关。     

靶向survivin基因的RNAi诱导喉癌Hep 2细胞凋亡的研究

目的通过构建RNAi表达载体,转染喉癌细胞株Hep 2,观察其对survivin表达的抑制作用。方法构建针对survivin基因的干扰载体,用脂质体转染喉癌细胞Hep 2,分析干扰载体对survivin表达的抑制情况,检测细胞凋亡。结果survivin在喉癌细胞Hep 2中呈高表达,其基因序列与GenBank序列对比一致,干扰载体pGensil/survivin能抑制survivin的表达,抑制率为68%,并诱导了喉癌细胞的凋亡。结论针对survivin的小分子RNA可以有效抑制喉癌细胞Hep 2中survivin蛋白的表达,并促进喉癌细胞凋亡。     

Cbl-b基因沉默增强T细胞对人喉鳞癌细胞Hep-2的免疫杀伤效果

目的研究泛素连接酶（Cbl-b）基因沉默对H9 人T淋巴细胞免疫杀伤人喉鳞癌细胞Hep-2 作用的影响和相关机制。方 法选择12例喉鳞癌患和12例健康对照者,用磁性细胞分离技术分离外周血CD4+T细胞应用RT-PCR法检测Cbl-b的表达水 平。同时,将人T淋巴细胞H9 接种培养于96 孔板,分为4 组：以脂质体转染法将Cbl-b-siRNA 重组序列转染人T淋巴细胞 H9,作为Cbl-b-siRNA组;Cbl-b-siRNA重组序列转染T细胞成功后,在其培养液中加入IL-2 中和抗体,作为anti-IL-2+Cbl-bsiRNA 组;以脂质体转染法将随机阴性对照序列转染的人T淋巴细胞H9 作为阴性组（NC组）;以不做任何处理人T淋巴细 胞H9 为空白组（BC组）。采用倒置荧光显微镜观察人T淋巴细胞H9 的转染效率、以实时荧光定量PCR法和蛋白免疫印迹 法检测各组人T 淋巴细胞H9 中Cbl-b mRNA和蛋白表达情况。以细胞计数试剂盒（CCK-8）检测各组人T 淋巴细胞H9 对 Hep-2细胞的杀伤作用;流式细胞仪检测各组人T淋巴细胞H9表面活化分子CD69、CD25阳性表达率;采用ELISA法检测T细 胞上清液中白介素-2（IL-2）、γ干扰素（INF-γ）水平。结果Cbl-b mRNA在喉鳞癌患者CD4+T细胞中表达升高,与健康对照差异 有显著性（P<0.05）。Cbl-b-siRNA组和阴性组的转染效率分别为（78.30±6.06）%、（77.25±6.38）%,转染效果良好;Cbl-b-siRNA 组人T淋巴细胞H9 的Cbl-b mRNA和蛋白相对表达量与anti-IL-2+Cbl-b-siRNA组无显著差异（P>0.05）,但显著低于空白组 和阴性组（P<0.05）;不同效靶比时,Cbl-b-siRNA组Hep-2 肿瘤细胞杀伤率均显著高于anti-IL-2+Cbl-b-siRNA组、阴性组和空 白组（P<0.05）。Cbl-b-siRNA 组人T淋巴细胞H9 表面活化分子CD69、CD25 阳性表达率均显著高于anti-IL-2+Cbl-b-siRNA 组、空白组和阴性组（P<0.05）;Cbl-b-siRNA 组人T 淋巴细胞H9 上清液中INF-γ、IL-2 水平均显著高于空白组和阴性组（P< 0.05）;空白组与阴性组人T淋巴细胞H9 的Cbl-b mRNA和蛋白相对表达量、肿瘤细胞杀伤率、表面活化分子CD69、CD25 阳 性表达率、上清液中IL-2、INF-γ水平比较差异均不显著（P>0.05）。结论应用siRNA技术沉默T细胞Cbl-b 基因可有效增强 人T淋巴细胞H9 对人喉鳞癌细胞株Hep-2 体外免疫杀伤作用,其机制可能与T细胞Cbl-b 基因沉默促进人T淋巴细胞H9 分 泌IL-2、加强T淋巴细胞激活有关。     

慢病毒载体介导siRNA对人喉癌抑瘤作用的实验研究

目的研究慢病毒载体介导siRNA抑制survivin基因表达后对人喉癌hep-2细胞体内增殖能力的影响以及对裸鼠移植人喉癌的抑瘤活性。方法应用裸鼠成瘤实验测定致瘤能力的改变,采用RT-PCR和Western blotting测定干扰后survivin基因及其蛋白的表达水平;流式细胞术检测喉癌细胞凋亡指数和增殖指数。结果靶向survivin基因的siRNA可以有效抑制survivin基因的表达,使survivin-mRNA表达减少60%-85%,蛋白表达减少70%;流式细胞术检测细胞凋亡率明显提高(P<0.01),降低了在裸鼠体内成瘤的能力。结论RNA干扰survivin基因表达后明显抑制了人喉癌hep-2细胞的体内增殖能力;siRNA介导的survivin基因下调可明显抑制肿瘤细胞在体内的生长。     

亚砷酸对人喉癌Hep-2细胞RECK基因表达及去甲基化的影响

目的:探讨不同浓度亚砷酸对人喉癌Hep-2细胞中伴Kazal域的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白(RECK)基因表达及去甲基化的影响。方法:分别将0.5、1.0、2.0、4.0μmoL/L的亚砷酸作用于体外培养的Hep-2细胞24～72 h,MTT法计算细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞周期,并用甲基特异性PCR检测RECK基因甲基化情况。RT-PCR和W estern b lot分别检测RECK mRNA和蛋白表达水平。结果:0.5～4.0μmoL/L亚砷酸能抑制Hep-2细胞增殖,使Hep-2细胞阻滞于S期和G2/M期;RECK基因甲基化水平随亚砷酸浓度增高而降低,非甲基化水平则逐渐增高;亚砷酸能增加RECK mRNA和蛋白表达。结论:亚砷酸能促进Hep-2细胞中RECK基因去甲基化并提高其表达水平,从而发挥抑制细胞增殖。     

Skp2 shRNA表达质粒的构建及其对肺癌细胞生长的影响

目的 构建Skp2基因的RNAi真核表达质粒,观察其对SIC-A-1肺癌细胞内Skp2基因表达及细胞生长的影响.方法 根据GenBank中Skp2cDNA序列设计针对Skp2基因的shRNA序列,合成序列并克隆人pGenSil-1质粒中,构建skp2 pshRNA重组质粒.脂质体介导重组质粒转染SPC-A-1肺癌细胞.RT-PCR检测肺癌细胞Skp2 mRNA的表达,Western blot检测Skp2蛋白表达.MTT检测各纽细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期改变.结果 重组质粒经酶切鉴定和测序,证实表达干扰质粒构建成功.转染重组质粒的肺癌细胞Skp2 mRNA和蛋白的表达明显下降(P<0.05),细胞生长增殖受到抑制,阻滞在G0/G1期的细胞比例增加,而进入S期的细胞比例明显下降(P<0.05).结论 构建的Skp2 shRNA表达质粒能有效下调Skp2基因的mRNA及蛋白的表达、抑制细胞的生长增殖.