人外周血单核细胞体外诱导树突状细胞及鉴定

目的：建立从人外周血单核细胞体外诱导培养树突状细胞（dendritic cell,DC)的方法。方法：分离人外周血单个核细胞,以细胞因子粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）,白细胞介素－4（IL－4）,肿瘤坏死因子α（TNF－α）诱导培养获得DC,电镜及共聚集显微镜观察其形态,流式细胞术检测细胞表面抗原,体外同种混合淋巴细胞反应检测DC刺激T细胞的增殖活性。结果：从正常外周血分离得到的单核细胞,体外经重且人GM－CSF,IL－4,TNF－α的共同诱导培养,得到大量成熟DC,形态学观察可见典型DC特征,荧光激少在细胞分离器（FACS）检测表明,诱导的DC高表达HLA－DR（96％）,CD83（94．2％）,CDla(94.2%)分子,同时也高表达CD40（97．7％）,CD80（98．2％）分子,同种混合淋巴细胞反应显示,诱导的DC具有很强的激发同种T细胞增殖的能力。结论：人外周血单核细胞体外经细胞因子贯序诱导培养,可以生成大量功能成熟的DC,为进一步开展DC的基础研究和临床应用提供了可能。     

人外周血树突状细胞的诱导及其对自身T细胞的激发作用

目的 体外诱导和扩增树突状细胞(DC)并分析其对自身T细胞的激发作用。方法 正常人外周血单个核细胞经贴壁去除悬浮细胞，加入细胞因子(IL—4、GM—CSF和TNF—α)培养8天。用流式细胞仪分析细胞表型，用ELISA测定培养上清中IL—12的含量，将诱导的树突状细胞与自身T细胞混合培养用^H—TdR法测定细胞的增殖指数。结果 正常人外周血诱导的树突状细胞高表达分化抗原CDla(89．1％)、CD40(99．8％)、CD80(95．1％)、CD83(45．7％)、HLA—DR(97．6％)，同时所获的比能分泌IL—12和有效地激活自身T细胞，并促其增殖。结论 正常人外周血的单个核细胞经细胞因子的序贯培养，可获得高纯度、功能性的DC细胞。     

GM-CSF重组腺病毒诱导人外周见树突状细胞

将GM—CSF腺病毒颗粒转入人外周血单核细胞（PBMC）,从而找到了一种诱导、扩增DC的新途径。进一步的同种混合淋巴细胞反应提示,这种DC比常规培养的人外周血DC有更强的激发T细胞的能力。     

肺癌可溶性抗原致敏的DC诱导CTL特异性杀伤肺癌细胞的实验研究

目的 通过对负载人肺癌GLC-82细胞可溶性抗原的树突状细胞（DC）体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）对肺癌细胞的杀伤研究，为以DC为基础的肺癌免疫瘤苗的临床应用提供一定的实验依据。方法 通过用3MKCl提取法和弱酸洗脱法获得人肺腺癌细胞GLC-82的可溶性抗原多肽，用GLC-82细胞抗原多肽冲击致敏从人外周血单核细胞（PBMC）中用GM-CSF、IL-4和TNF—α体外诱导扩增并经鉴定的DC；利用负载GLC～82细胞抗原多肽的DC，刺激同种异体外周血T淋巴细胞活化增殖，诱导产生具有识别肺癌细胞抗原的特异性CTL；进一步探讨该CTL对GLC-82，肺癌CALU-6和人红白血病K562细胞的体外杀伤效应。结果 人PBMC体外经7d诱导出的DC，经光镜、电镜、免疫组化证实具有典型的树突状细胞特性；经GLC-82抗原致敏的DC诱导同种异体T淋巴细胞活化增殖产生CTL，诱导激活的CTL与靶细胞共育时镜下发现CTL靠近并聚集在肿瘤细胞周围，致使肿瘤细胞发生凋亡和坏死。结论肺癌可溶性蛋白抗原能活化致敏DC，无需明确肿瘤特异抗原，获取方法简便可行；联合应用GM—CSF、IL-4和TNF—α诱导人PBMC中的单核细胞，能诱导出功能较强的DC；致敏DC能强烈刺激初始型同种异体T淋巴细胞增殖产生CD8^＋表达增加的CTL;激活的CTL对肺癌靶细胞发挥高效而特异的细胞毒效应，对非肺组织瘤靶细胞也具有非特异性杀伤效应。     

树突状细胞肺癌疫苗制备的实验研究

①目的 探讨具有较强免疫活性树突状细胞（DC）的制备及其鉴定。②方法 采用3M KCL提取法和弱酸洗脱法获得肺癌细胞GLC-82的可溶性抗原多肽，并定量抗原多肽浓度；用GLC-82细胞抗原多肽；中击致敏，从人外周血PBMC中用GM—CSF、IL-4和TNF—α体外诱导扩增并经鉴定的DC；利用负载GLC-82细胞抗原多肽的DC，刺激同种异体外周血T淋巴细胞活化增殖，诱导产生具有识别肺癌细胞抗原的特异性CTL；③结果 人体外周血PBMC体外经7天诱导出的DC，具有典型的树突状细胞特性，经GLC-82抗原致敏的DC诱导同种异体T淋巴细胞活化增殖产生CTL，高表达CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋，且随培养时间延长，CD3^＋和CD8^＋ T 细胞百分率增加，CD4^＋／CD8^＋比例下降，动态观察CTL增殖倍数迅速增加；④结论 利用3Mkcl单盐提取法制备肿瘤可溶性抗原，并以终浓度50ng,／mL冲击致敏，从外周血PBMC中分离、扩增、活化的DC，使其负载肿瘤抗原，体外诱导能产生特异性CTL。     

人外周血树突状细胞的诱导及其对自身T细胞的激发作用

目的　体外诱导和扩增树突状细胞 (DC)并分析其对自身T细胞的激发作用。方法　正常人外周血单个核细胞经贴壁去除悬浮细胞 ,加入细胞因子 (IL - 4、GM -CSF和TNF -α)培养 8天。用流式细胞仪分析细胞表型 ,用ELISA测定培养上清中IL - 12的含量 ,将诱导的树突状细胞与自身T细胞混合培养用3H -TdR法测定细胞的增殖指数。结果　正常人外周血诱导的树突状细胞高表达分化抗原CD1a(89.1% )、CD4 0 (99.8% )、CD80 (95 .1% )、CD83(4 5 .7% )、HLA -DR(97.6 % ) ,同时所获的DC能分泌IL - 12和有效地激活自身T细胞 ,并促其增殖。结论　正常人外周血的单个核细胞经细胞因子的序贯培养 ,可获得高纯度、功能性的DC细胞     

肿瘤坏死因子—α预刺激培养成熟树突状细胞

目的 利用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导树突状细胞(DC)成熟的作用原理培养成熟DC的新方法。方法Ficoll密度梯度离心分离健康人外周血获得单个核细胞，用含有10％胎牛血清的RPMI640培养基培养。TNF-α预刺激4h后加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)及IL-4，48、96h再次同时加入上述3种细胞因子并继续培养，第8—10天收集细胞，记作T—DC。FCM检测FDC表型，用^3H-TdR检测同、异基因混合淋巴细胞反应(MLR)及抗原提呈功能；MTT法检测FDC诱导T细胞的杀伤活性。结果 T—DC表达CD83、CDla、CD54、CDlla、CD80、CD86、HLA—DR、CD83HLA—DR并能刺激T细胞增殖与MLR（同基因、异基因)反应；T—DC具有抗原提呈功能、可诱导特异性杀伤。结论 用TNF-α预刺激4h的方法并在含有GM—CSF、IL-4的完全培养基中培养人外周血单核细胞8d可获得成熟的DC。     

Wistar大鼠树突状细胞的体外培养、扩增与鉴定

目的：探讨体外分离、培养和扩增大鼠骨髓来源树突状细胞（DC）的有效方法。方法：采用改良的Chen－WoanDC培养方法，梯度离心提取骨髓单核细胞中的非粘附细胞，加入GM CSF 5?ng/ml、IL 4 5?ng/ml进行诱导扩增，对培养的目的细胞进行形态学、OX62－FITC免疫荧光检查以及功能学鉴定。结果：DC前体细胞培养10?d呈典型树突状结构，表面标志物染色阳性，流式细胞学检查OX62单抗阳性率86％，不同培养时段的DC诱发混合淋巴细胞反应以培养10?d的DC最强，培养10?d的DC诱发混合淋巴细胞反应对同源淋巴细胞有更好的活性。结论：改良的Chen－Woan法为体外诱导扩增大鼠骨髓来源DC的有效方法。     

不同来源树突状细胞体外诱导比较

目的　对脐血和外周血源性树突状细胞 (DC)体外诱导进行比较 ,探索技术更好的DC来源。方法　脐血和外周血分离取白细胞后 ,分别加入GM -CSF ,TNF -α和GM -CSF ,IL - 4培养基中 ,培养 12d ,于 4 ,8,10d进行CD10 ,CD83及HLA -DR表型分析 ,并在第 12天与淋巴细胞混合培养 ,对比两种源性DC激发淋巴细胞增殖的能力。结果　脐血诱导的DC细胞数明显多于外周血诱导的细胞数 (P <0 0 1)。结论　脐血和外周血均可成功诱导成熟DC ,脐血诱导的DC细胞数高于外周血。     

大鼠树突状细胞的体外扩增与初步鉴定

目的建立体外诱导和扩增大鼠骨髓树突状细胞(DCs)的方法，并进行生物学鉴定。方法大鼠骨髓细胞经贴壁去除悬浮细胞，加入细胞因子(IL-4和GM—CSF)培养2周。经过先镜，透射电镜观察培养DCs的形态学特征；通过同种T细胞混合培养，采用MTT比色分析法测定不同浓度的DCs发同种T细胞增殖的能力。结果培养的DC胞浆突起大而长，呈树突状，具有DCs的典型形态，并且具有强烈的激发同种异体T细胞增殖的能力。结论采用大鼠骨髓细胞经贴壁去除悬浮细胞，加入细胞因子(IL-4和GM—CSF)序贯培养，能获得大量、较高纯度的DCs。     

人外周血单核细胞和脐血CD34+细胞来源的树突细胞比较

目的比较从人外周血单核细胞及脐血CD34+细胞诱导树突细胞(DC)的方法及其特性.方法用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,贴壁法获得单核细胞;经GM-CSF及IL-4诱导获得DC.磁性活化细胞分选系统(MACS)分选脐血CD34+细胞,以GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、FL、TPO等细胞因子诱导获得DC.用电镜、普通显微镜观察DC形态;流式细胞仪分析DC表型;同种混合淋巴细胞反应(allo-MLR)观察DC刺激T淋巴细胞增殖的能力.结果外周血单核细胞在因子GM-CSF、IL-4、TNF-α,脐血CD34+细胞在GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、FL、TPO等因子作用下,可生成DC,并表达相应的DC分化抗原CD14、CD80、CD83、CD86、HLA-DR.脐血CD34+细胞具有较强的扩增能力,经2周诱导,体系细胞数可增加173.8士26.7倍,两种来源的DC均能刺激同种异体淋巴细胞的增殖反应.结论外周血单核细胞与脐血CD34+细胞,在体外均可诱导成DC,并具有相应的DC分化抗原和功能.     

负载宫颈癌肿瘤裂解物的树突状细胞诱导的淋巴细胞反应

目的:利用树突状细胞(dendritic cell,DC)递呈肿瘤抗原的生物学特性,观察DC负载宫颈肿瘤裂解物抗原后能否促进同种异体T淋巴细胞增殖,并且活化为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL).方法:宫颈癌患者外周血单核细胞体外经粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)诱导产生DC,肿瘤裂解物和TNF-α共同促其成熟,与异体T淋巴细胞混合共育,以MTT法测定T细胞的增殖程度.结果:宫颈癌患者外周血来源DC无论负载肿瘤组织裂解物还是传代肿瘤细胞裂解物,均可促进异体T细胞大量增殖,二者间无显著差异(P＜0.05).结论:DC能递呈宫颈癌肿瘤抗原,诱导产生大量抗原特异性CTL,提示负载肿瘤裂解物的DC具有为宫颈癌患者进行特异性免疫治疗的临床应用前景.     

C57BL／6小鼠树突状细胞的培养及其诱导细胞毒性T淋巴细胞对FBL-3细胞杀伤效应的研究

目的探讨C57BL／6小鼠树突状细胞（DC）的培养及其诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对FBL-3细胞的杀伤效应。方法应用GM—CSF和114培养C57BL／6小鼠骨髓DC,用冻融法制备FBL-3细胞抗原致敏DC,用3H—TdR法检测T细胞增殖反应的能力,标准的4h51cr释放测定法检测CTL杀伤活性。结果用IL4和GM—CSF联合培养小鼠骨髓细胞3天后,可见细胞形态发生改变,细胞形态不规则。培养第6～8天,细胞表面出现较多毛刺样突起,拉长,为典型的DC特征。流式细胞仪检测DC表面分子有CD80、CD86、H-2Kd及I-Ad表达。FBL-3细胞冻融组和PBS组的DC在体外均可以诱导T细胞增殖,冻融组的DC体外诱导T细胞增殖能力明显高于PBS组。冻融组DC体外诱导的CTL对FBL-3细胞有明显的细胞毒作用。结论应用IL-4联合GM—CSF培养C57BL／6小鼠骨髓细胞,可大量扩增成熟DC,培养的DC符合其自身的特性;用冻融法制备FBL-3细胞抗原致敏DC,可以诱导T细胞细胞大量增殖,并能诱导出杀伤效应较强的CTL。     

人外周血中树突状细胞的诱导及鉴定

目的：从健康人外周血诱导高纯度树突状细胞（dendritic cell,DC)方法：用贴壁法从健康人外周血获取单核细胞，对传统的诱导方法加以改进，经GM－CSF（100ng/ml)和IL－4（500U/ml)持续诱导7天，在此期间不再补充新的细胞因子，新鲜培养基和促成熟因子，以获取高纯度DC，结果：经上述方法处理后，从健康人外周血中诱导出了大量高纯度DC，其能高表达HLA－I，Ⅱ类分子，共刺激分子和粘附分子，显示出成熟DC的特征，这些DC能强烈诱导同种体淋巴细胞的增殖，其内吞能力在第3天达最高，之后明显下降，结论：本研究所建立的从外周血获取大量成熟DC的方法经济，简便，为DC的深入研究和临床应用奠定了基础。     

肿瘤坏死因子—α预刺激对培养树突状细胞形态学的影响

目的：研究肿瘤坏死因子（TNF）－α预刺激对树突状细胞形态学的影响，方法：Ficoll密度梯度离心分离健康人外周血，获得单个核细胞，培养基用含有10％胎牛血清的RPMI 1640，分两组进行培养，一组用TNF－α预刺激4h后加入粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）及白细胞介素－4（IL－4），每48h再次加入上述3种细胞因子；另一组则在培养初始加入GM－CSF及IL－4，每隔48h再次加入上述2种细胞因子，第5天加入TNF－α，两种中所用细胞因子浓度完全一样，且均于第8天收获细胞，前者记作T－DC，后者记作DC。光镜及扫描电镜观察DC形态学变化及差异，结果：T－DC与DC相比，具有更多，更典型的树突状突起，结论：TNF－α预刺激DC前体细胞4h与TNF－α在培养第5天加入相比，所诱导出的DC的树突状形态更为明显，典型。     

经癌胚抗原重组痘苗病毒转染的树突状细胞体外诱导特异性T细胞免疫

目的研究人癌胚抗原重组痘苗病毒(rV-CEA)转染外周血树突状细胞(DC)后能否在体外诱导CEA特异性细胞毒性T淋巴细胞免疫。方法将rV-CEA转染外周血单核细胞来源的DC后用于激发同源的T细胞,检测其对T细胞的增殖作用以及对CEA分泌性肿瘤细胞的杀伤活性,并与未经rV-CEA转染的DC激发的T细胞进行比较。结果经rV-CEA转染的DC激活的T细胞对CEA分泌性肿瘤细胞具特异性杀伤作用。结论rV-CEA转染的DC可以诱导CEA特异性T细胞活性。     

慢病毒介导的hGM—CSF修饰的肿瘤疫苗免疫活性研究

目的构建编码人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（humangranulocyte—macrophage colony stimulating factor，hGM—CSF）的慢病毒载体，研究编码hGM—CSF的慢病毒载体对树突状细胞（dendritic cell，DC）疫苗抗肿瘤活性的增强作用。方法以质粒pORFhGM—CSF为模板，采用PCR方法扩增出hGM—CSF基因片段；通过BamHI和XhoI限制性内切酶位点。将hGM—CSF基因定向克隆到慢病毒连接载体L166中构建重组载体L166-hGM—CSF。将重组载体L166-hGM—CSF和包装载体L205以及包膜载体L311共同转染慢病毒包装细胞293T，72h后收集病毒上清液获得编码hGM—CSF的慢病毒颗粒Lenti—hGM—CSF。从脐血中分离出单核细胞，rhGM—CSF、rhIL-4和α—TNF诱导获得DC，通过相差显微镜和流式细胞仪鉴定。应用反复冻融法制备可溶性肿瘤抗原，分别将负载肿瘤抗原的DC疫苗和慢病毒Lenti—hGM—CSF感染的负载肿瘤抗原的DC疫苗与T淋巴细胞共同培养，MTT方法检测并比较两者所诱导的CTL对反应细胞的体外杀伤活性。结果编码hGM—CSF的慢病毒载体L166-hGM—CSF成功构建，获得了编码hGM—CSF的慢病毒。该慢病毒的Hela细胞上清液中hGM—CSF的表达明显高于未感染者。从脐血中分离出的DC，显示其高表达CD80（87.2％）和CD86（92．8％），而单核细胞标志CD14的表达率较低（3．56％o慢病毒介导的分泌hGM—CSF的树突状细胞肿瘤疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖的能力和抗肿瘤活性较普通DC疫苗明显增强（P〈0．01）。结论本实验制备的慢病毒Lenti—hGM—CSF感染反应细胞后能够显著增强DC肿瘤疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖的能力及其诱导的CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，为hGM—CSF修饰的DC肿瘤疫苗的临床应用提供了一定的实验依据。     

雷公藤多甙和IL-10对人DC内IL-12p40和DCCK1 mRNA转录的影响

目的 :研究雷公藤多甙和IL 10对DC内IL 12p40和DC CK1转录的影响。方法 :通过GM CSF、IL 4和TNFα体外培养体系 ,从人外周血单个核细胞中诱导DC ,IL 12p40和DC衍生的趋化因子 1(DC CK1)转录采用逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术。结果 :通过GM CSF、IL 4和TNFα体外培养体系可以获得成熟功能性DC ,雷公藤多甙和IL 10能抑制DC内IL 12p40mRNA的转录 ,但对DC CK1mRNA的转录无明显影响。结论 :雷公藤多甙、IL 10可能通过抑制IL 12p40mR NA的转录而干扰DC的功能     

鼻咽癌细胞株体外诱导同种异体T细胞TCR VβCDR3谱型和细胞毒性分析

目的 用鼻咽癌细胞株CNE2体外负载同种异体树突状细胞(dendritic cell,DC)诱导T淋巴细胞,使之活化为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL),观察其体外特异性杀伤和克隆性增殖.方法 用GM-CSF,IL-4和TNF-α体外诱导健康志愿者外周血单核细胞,用CNE2负载,使之分化为成熟DC,流式细胞仪检测负载前后DC的表型特征.在IL-2的作用下,用负载CNE2抗原的DC诱导自身T细胞生成特异性CTL.乳酸脱氢酶释放法检测其特异性杀伤活性;采用免疫谱型分析技术分析T细胞的克隆性.结果 健康志愿者外周血单核细胞体外在GM-CSF,IL-4和TNF-α诱导下获得具有典型表型特征的成熟DC,其诱导的CTL对CNE2有明显的特异性杀伤作用;PBMC的TCR Vβ CDR3谱型呈高斯分布,而诱导后的T细胞部分家族出现优势表达.结论 负载鼻咽癌抗原的同种异体DC所诱导的CTL在体外对鼻咽癌细胞有特异性杀伤作用,优势表达的TCR Vβ CDR3家族对鼻咽癌治疗有潜在的临床应用价值.     

脐血及外周血树突状细胞的体外诱导及比较研究

目的 :体外诱导扩增具典型形态、表型及功能的树突状细胞 (DC) ,以进行相关基础研究及临床应用。方法 :取正常人外周血及脐血 ,以 Ficoll分离取白细胞 ,去除悬浮细胞后 ,分别在以加入 GM- CSF,TNF-α(脐血 )及GM- CSF,IL- 4 (外周血 )的完全培养基中培养 ,在第 3,7,9天表型 (CD1a,CD80 ,CD83,HL A- DR)分析及形态观察 ,1周左右分别做同种异体混合淋巴细胞培养 ,比较激发细胞增殖的能力。结果 :脐血诱导的 DC细胞数大于外周血来源的 DC细胞数 ,两者有显著差异。两种来源的 DC在形态及细胞表型 (第 9天 CD1a脐血 6 7.2± 3.6 % ,外周血 6 9.3± 6 .8% ;CD83脐血 73.7± 5 .5 % ,外周血 75 .6± 4 .9% )无显著差异 ,两者的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力无显著差异。结论 :脐血可成功诱导功能性 DC,脐血诱导比外周血诱导效率高 ,且与外周血所诱导的 DC在形态及功能方面差异无显著性