新生大鼠心肌细胞培养及电生理特性观察

目的 应用原代细胞培养技术,以获取大量具有正常电生理特性的心肌细胞.方法 用胶原酶溶液处理1 d龄SD大鼠的心脏,差速贴壁法纯化获得的单个心肌细胞,CO2培养箱中培养8d后,以膜片钳技术记录心肌细胞的动作电位和各跨膜离子流.结果 细胞培养中,改进了酶溶液的成分、浓度和经典的差速贴壁法作用时间,获得了大量的高纯度单个心肌细胞.在此细胞上,采用电流钳技术,可引导出心室肌动作电位.运用心肌细胞离子通道的电压依赖性和特异阻断剂,在不同的钳制电位和指令电位下,可记录到Ina,Ica,Ito,IK等多种离子流.结论 改进的细胞培养技术可获得大量的具有正常电生理特性的心肌细胞.     

耐钙心肌细胞的分离及其L型钙通道电流观察

目的：建立大鼠心肌细胞分离方法，用于膜片钳实验，并记录L型钙通道电流，方法：基于Langendorff逆行主动脉灌流模型，以经改进的心肌细胞分离技术获得单个耐钙心肌细胞，用膜片钳全细胞方式记录L型钙电流。结果：在灌流所得50％存活单个心肌细胞中约70％为耐钙心肌细胞，并记录到典型的L型钙电流，结论：这种心肌细胞分离技术能获得大量具有正常电生理特性的耐钙心肌细胞，可用于心肌细胞离子通道和信号转导机制的研究。     

昆明小鼠心室肌细胞分离及钙电流观察

目的：探索建立简单实用的小鼠心肌细胞分离方法并观察其钙电流特征,以便有利于心肌细胞电生理和分子生物学研究。方法：采用下腔静脉灌流,原位主动脉插管和胶原酶Ⅱ消化法得单个心肌细胞。在倒置显微镜下观察细胞形态,台盼蓝染色判定心肌细胞活力,利用全细胞膜片钳技术记录钙电流。结果：分离得到的心肌细胞数量多、存活率高、杆状、横纹清晰、折光性好、静止、贴壁良好。逐步复钙后可获得50%～60%耐钙细胞,单个心肌细胞在全细胞膜片钳模式下可记录到典型的L-型钙电流,在细胞外液加入尼群地平后L-型钙电流消失。结论：该心肌细胞分离方法简单实用,重复性好,所获得的单个心肌细胞具有正常的电生理活性。     

新生大鼠少突胶质前体细胞的培养与鉴定

目的 在体外培养条件下获取纯度较高的少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPCs).方法 原代混合胶质培养,利用振荡法和差速贴壁法分离纯化少突胶质前体细胞,再用无血清化学条件培养基培养.免疫荧光法及膜片钳记录细胞电生理特性进行鉴定.结果 振荡分离后超过90%细胞为NG2阳性OPCs:OPCs电生理特性:输入阻抗Ra相对较高;电压依赖的K 电流具有外向整流特性;对河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)敏感的小的内向Na 流,不能产生动作电位.结论 振荡法结合差速贴壁可以获得纯度较高的OPCs;OPCs具有区别于神经元、星型胶质细胞、小胶质细胞的独有电生理特性.     

耐钙心肌细胞的分离及基本电生理特性

目的　探讨分离单个心肌细胞的方法并进行基本电生理指标测定 .方法　改进的 L angendorff灌流法及膜片钳全细胞记录法 .结果　单个心室肌细胞静息电位为 (- 85±2 .3) m V(n=1 0 ) ,记录到单个心室肌细胞典型的 L 型钙电流特性 .结论　用该方法分离的细胞具有耐钙性和正常电生理特性     

心肌细胞分离方法的改进及其钾电流的观察

目的:探索建立简单可靠的心肌细胞的酶解分离方法,提高细胞存活率和膜片钳实验成功率.方法:采用Langendorff装置,无钙液和胶原酶P二步灌流法分离心肌细胞.显微镜下观察细胞形态结构,并应用膜片钳全细胞技术记录大鼠心室肌细胞膜瞬时外向钾电流.结果:心肌细胞存活率高,形态结构良好,可成功记录出瞬时外向钾电流.结论:通过改进的分离方法获得的心肌细胞存活率高,具有正常的电生理特性.     

适于膜片钳实验的心肌细胞分离方法及维拉帕米对钙电流的作用

目的：建立适应于膜片钳实验的大鼠单个心室肌细胞的分离方法,探讨L-型钙通道在大鼠心肌电活动中的作用.方法：采用改进Langendorff装置,酶解法分离单个心室肌细胞,应用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞L-型钙电流及维拉帕米的作用.结果：该法分离到的心肌细胞存活率达80％～90％,高倍镜下细胞呈杆状,边缘清楚,表面光滑,纹理清晰;成功记录到典型L-型钙电流（Ica-L）,给予维拉帕米（0.3、3、30 μmol/L）后呈浓度依赖性抑制钙电流,其抑制率分别为（44.35±5.52）％,（61.06±2.99）％,（71.88±4.45）％.结论：改进心肌细胞的分离方法可获得大量耐钙心室肌细胞,这些细胞具有正常的电生理特性.     

阿米洛利对甲状腺素诱发大鼠肥厚心肌的瞬时外向钾电流的作用

目的研究阿米洛利对甲状腺素诱发大鼠肥厚心肌瞬时外向钾电流(Ito)的作用,观察正常组、肥厚组及阿米洛利处理组心肌细胞Ito特性的不同,以阐明肥厚大鼠心肌细胞动作电位的变化及阿米洛利抗心肌肥厚的电生理机制。方法大鼠ipL-甲状腺素造成心肌肥厚模型后,用标准微电极技术记录大鼠右心室乳头状肌动作电位;用膜片钳技术记录大鼠单个心室肌细胞的Ito。结果肥厚大鼠心肌细胞动作电位时程(尤其是APD20)明显延长,阿米洛利可使过度延长的APD20恢复或接近于正常值。肥厚组心肌细胞Ito幅度和密度均增加,激活动力学特性无改变。Amiloride[0.5mg/(kg·d),p.o]能抑制Ito电流幅度及电流密度的增加。结论在甲状腺素诱发大鼠心肌肥厚模型中,Ito特性发生了变化,这是造成肥厚心肌电生理异常的离子基础。Amiloride能对抗甲状腺素致肥厚的心肌细胞Ito的变化,这可能与其抗心肌肥厚的作用有关。     

犬左心房心肌细胞的分离方法及电生理记录

目的 探索简单、稳定的犬左心房肌细胞的分离方法。方法 采用改良的Langendorff灌流法及自制的冠脉插管装置。对分离得到犬左心房肌细胞进行形态学观察和应用膜片钳技术记录动作电位和瞬间外向整流钾电流（Ito）以验证其电生理特性。结果 分离的状态良好的单个左心房细胞率为70 %～80 %,形状呈杆状,边缘锐利,横纹清晰;电生理记录显示具备正常的心房肌细胞电生理特性。结论 该方法简单,可节约实验成本和时间,分离的活细胞产量高,质量好,值得推广使用。     

应用单相动作电位技术对心脏电生理学的基础和临床研究

应用玻璃微电极记录心肌组织的单细胞跨膜动作电位是研究心肌细胞电生理特性最常用、最重要的方法,但单细胞跨膜动作电位是在离体心肌标本上获得的,而一些心律失常的发生、抗心律失常药物的作用均有赖于心脏解剖与生理的完整性,在分离心肌细胞标本时,心肌的某些特征将发生很大变化,使离体实验结果解释临床现象时受到限制。因此,寻求记录在体心脏电变化的     

恒流灌注分离心肌细胞及膜片钳记录钾电流方法学探讨

目的探讨膜片钳实验中豚鼠、大鼠心肌细胞急性分离过程中的观察指标和影响因素,并进行膜片钳记录。方法使用改进的Langendorff恒流灌注法分离心肌细胞和全细胞膜片钳记录钾通道电流。结果分离即刻,存活细胞可达80%以上,复钙后约40%~50%呈静息状态,余出现自发性收缩,存活细胞能够进行膜片钳封接,于室温KB液中可成活8 h以上。结论使用恒流灌注法,观测灌注压的变化,可以较客观的掌握酶解消化的程度,利于获取生理状态良好的心肌细胞。且细胞能够进行膜片钳实验。     

降纤酶对大鼠急性心肌梗死后梗死周边区心室肌细胞动作电位和L型钙电流的影响

目的　探讨降纤酶对大鼠急性心肌梗死后梗死周边区心室肌细胞动作电位和 L型钙电流的影响。方法　制成大鼠急性心肌梗死模型, 分两组, 一组对照, 另一组腹腔注射降纤酶0. 2 U/ (100g·d), 共 7 d, 酶解分离梗死周边区心室肌细胞, 采用全细胞膜片钳技术记录其动作电位和 ICa,L。结果　降纤酶组梗死周边区心室肌细胞 ERP/APD90增大, 受抑制的 ICa,L有所恢复, 峰电流密度显著增大, I V曲线下移, 失活曲线右移, 失活后再恢复速度加快。结论　降纤酶使急性心肌梗死后梗死周边区心室肌细胞ERP/APD90增大, ICa,L有所恢复, 因此具有减少急性心肌梗死后室性心律失常和改善心功能的作用。     

膜片钳研究中的钙耐受大鼠心肌细胞分离方法

目的：探讨膜片钳实验中大鼠心肌细胞分离过程中影响细胞活性和钙耐受性的各种影响因素。方法：采用Langendorff灌流，先用台氏液灌流30s，再用无钙台氏液灌流5-7min，其后换含胶原酶Ⅰ0.1-0.2g/L的低钙本科液消化约8-30min，最后用无钙台氏液冲洗心脏2min，剪下心肌组织，KB液中37℃剪碎吹打温育5min后，用200μm筛网过滤，室温静置换液后进行膜片钳实验。结果：注意控制水，酶，温度等各种因素后，可得到杆状、横纹清晰、膜良好的耐钙心肌细胞。结论：大鼠心肌细胞分离过程中各种因素控制好后可以保证一定的细胞成活率及其质量，有利于膜片钳实验的顺利进行。     

Morphological and electrophysiological properties of single myocardial cells from Koch triangle of rabbit heart

Background The morphological and electrophysiological characteristics of cardiac cells in Koch triangle are still disputed. We studied the appearance and electrical properties of these diverse myocytes to elucidate their complex electrophysiological phenomena. Methods Experiments were conducted using cooled charge coupling device (CCD) system and whole cell, patch clamp technique to determine the morphology, action potential and sodium current density of single viable myocytes enzymatically isolated from the Koch triangle of rabbit hearts. Results Morphologically, cardiac cells in shape of spider, tiny spindle, slender spindle, rod and strip were observed in percentage of 3.0±0.3, 35.0±5.0, 15.0±2.0, 40.0±5.0 and 6.0±0.7 respectively. The cellular dimensions and capacitance gradually increased in the above order (all P<0.05). Electrophysiologically, action potential configurations recorded from them were similar respectively to nodal (N), atrial nodal (AN), nodal Hisian (NH), atrial (A) and Hisian like potentials obtained from the intact atrioventricular nodal preparations. Diastolic depolarization appeared in all myocytes except for rod cells. Sodium current density increased in the order of tiny spindle, strip, rod, slender spindle cell (all P<0.05), but could not be detected in spider-shaped cells. Linear regression analysis revealed that membrane capacitance was correlated negatively to the rate of diastolic depolarization r=-0.70, P<0.001, but positively to maximum depolarization potential, amplitude of action potential, upstroke velocity and maximum peak value of sodium current density r=0.84, 0.80, 0.87 and 0.75, respectively; all P<0.001. Conclusions The results demonstrated that spider-shaped, spindle, rod and strip cells in Koch triangle might correspond to pacemaking, transitional, atrial and Purkinje like cells, respectively. Furthermore, tiny spindle and slender spindle cells were referred to transitional cell α (TCα) and β (TCβ) accordingly considering their distinctive electrical properties. Different myocytes with diverse electrical properties constituted the infrastructure of sophisticated electrophysiological phenomena in Koch triangle. In view of the prominent percentage and electrical properties, tiny spindle and slender spindle cells were presumed to play important roles.     

氧化苦参碱对正常及乌头碱诱发心律失常大鼠动作电位的影响

目的：观察氧化苦参碱(OMT)对正常及乌头碱诱发大鼠心律失常模型动作电位(AP)的影响。 方法：采用悬浮微电极技术记录大鼠在体心室肌细胞的动作电位。 结果：给予3、15和30 mg•kg^-1的OMT能剂量依赖性地延缓乌头碱所致大鼠心律失常的发生,静脉给予30 mg•kg^-1的OMT能减小AP的幅值,缩短APD₅₀和APD₉₀,降低V_max。 结论：OMT对心肌细胞AP的影响可能为其抗心律失常作用机制之一。     

丹参注射液对模拟缺血预适应引起兔心室肌细胞动作电位和ATP敏感性钾电流变化的影响

目的:探讨丹参注射液对模拟缺血预适应引起兔心室肌细胞动作电位和ATP敏感性钾电流(IK(ATP))变化的影响,试图揭示其保护心肌缺血-再灌注损伤,抗缺血性心律失常作用的离子机制。方法:采用酶解法分离兔左心室细胞,按先后顺序,用正常Tyrode液和模拟缺血液以及模拟缺血液加丹参(750 mg.L-1)灌流,利用膜片钳全细胞记录技术记录不同条件下动作电位和IK(ATP)前后变化。结果:①模拟缺血液灌流后动作电位时程(APD)复极化的50%(APD50)和90%(APD90)分别缩短(与正常组相比P<0.05,n=12);模拟缺血液加丹参灌流,APD50和APD90缩短更加明显,分别缩短了80.46%和71.87%(与正常组相比P<0.01,与模拟缺血液组相比P<0.05,n=12)。静息电位和动作电位幅值无明显改变;②经模拟缺血液灌流,引起IK(ATP)通道的开放,膜电流显示外向性直线形,发生率为58.33%(7/12,P<0.05)。模拟缺血液加丹参,更容易引起IK(ATP)开放,膜电流曲线完全成为直线,诱发率为91.67%(11/12,与正常组和模拟缺血液组相比P<0.05);③Glibenclimide能使这种外向性直线形膜电流恢复为“N”形,证明这种膜电流为IK(ATP);经丹参作用后,改用正常Tyrode液冲洗,心肌细胞上结合的丹参可以被洗脱以及从模拟缺血液中得到恢复。结论:丹参能产生类似心肌缺预适应的病理生理过程,起到了ATP敏感性钾通道开放剂效应,这可能是丹参对心肌缺血预适应的保护作用具有增强效应电生理基础。     

Long Evans大鼠视网膜神经节细胞电生理学发育特性研究

目的 研究Lnng Evans大鼠不同发育阶段视网膜神经节细胞(Retinal Ganglion Cells，RGCs)电生理学特性，认识视觉发育过程中视网膜神经元成熟的细胞内机制。方法 取出生后3～31d Lnng Evans大鼠，制备视网膜片，寻找RGCs行膜片钳全细胞记录，给予不同强度去极化脉冲，诱发动作电位。结果 33只Long Evans大鼠共获得94个RGCs，按动作电位类型RGCs分为单锋型、瞬变型和持续型，在视觉发育不同阶段，3种类型的RCCs所占比例不同，在电生理特性上有显著差异。结论 在视觉发育过程中，RGCs的电学特性逐渐成熟，动作电位的幅度、频率存在差异，提示不同类型的RGCs在编码及传递时间、空间视觉信息中具有不同作用。