日本血吸虫疫苗候选分子的基因克隆、表达及特性鉴定

本研究用日本血吸虫（Sj）成虫抗原免疫的免血清从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA库筛选出Sj22．6基因克隆；用根据曼氏血吸虫23kDa膜抗原（Sm23）的编码基因设计的引物，以PCR法从日本血吸虫成虫CDNA库扩增出Sj23基因；用根据日本血吸虫菲律宾林的磷酸丙糖异构酶（SjTPI）基因设计的引物，以RT－PCR从日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA扩增出SjTPI基因；并测得了上述3个基因的核苷酸序列；通过与国外有关单位合作研究，获得日本血吸虫中国大陆株肌球蛋白的62kDa肽段（Sj62）的编码基因克隆．Sj22．6、SjTPI及Sj62的编码基因巴克隆入质粒pGEX并获得表达；Sj23基因克隆入杆状病毒，在家蚕幼虫体内获得表达．用Glutathione－Sepharose4B（GS4B）已纯化出重组的Sj22．6（rSj22．6）、Sj62（rSj62）及SjTPI。Sj22．6、Sj23、SjTPI和Sj62基因的表达产物均可被Sj重感染的兔血清识别；用rSj22．6免疫家兔和小鼠，均可诱生明显升高的IgG抗体，其可特异地识别rSj22．6，还可识别成虫抗原中天然的相应分子，但不识到虫卵抗原中任何成份．用rSj22．6对昆明鼠及BALB／C小鼠分别作免疫攻击实验，前者可产生38.93％的减虫率，后者可产生32．1％－35.27％的减虫率和28．4％的总体减卵率。Sj22．6／Sj26GST融合蛋白可诱导BALB     

重组日本血吸虫脂肪酸结合蛋白在不同佐剂条件下的免疫效果观察

目的观察重组日本血吸虫脂肪酸结合蛋白在几种佐剂条件下的免疫预防效果。方法用E.coli表达日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因,制备日本血吸虫脂肪酸结合蛋白与GST的重组融合蛋白(rSj14/GST),分别以福氏完全佐剂(FCA)/福氏不完全佐剂(FIA)、卡介苗(BCG)和免疫刺激复合物(ISCOM)作为佐剂免疫昆明系小鼠,比较攻击感染后的减虫效果。结果以BCG为佐剂皮内免疫和以ISCOM为佐剂皮下免疫分别诱导了34.3%和36.0%的减虫率;而以FCA/FIA为佐剂进行免疫,虽然诱导了较高的抗体反应,但几乎没有产生明显的减虫效果(8.5%)。结论BCG和ISCOM均是rSj14/GST的适宜佐剂。     

日本血吸虫（中国大陆株）线粒体相关蛋白对小鼠免疫保护性的初步研究

目的 研究日本血吸虫（中国大陆株）线粒体相关蛋白（rSj338/26GST)对小鼠的免疫保护性，预测其作为血吸虫疫苗候选分子的潜能。方法 将编码日本血吸虫线粒体相关蛋白的cDNA经PCR扩增后亚克隆人载体质粒pGEX-6p-1进行表达，并用表达的重组抗原的融合蛋白免疫BABL／c小鼠。结果 与对照组相比，rSj338/26GST重组蛋白免疫小鼠获得了32．3％的减虫率及46．5％肝总减卵率；与Sj26GST免疫组相比，rSj338抗原可能使小鼠获得22．5％的减虫率及30．0％的肝总 减卵率。结论 证明重组的日本血吸虫线粒体相关蛋白(rSj338/26GST及rSj338)可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力，可望成为新的疫苗候选分子。     

日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因功能的初步研究

目的探索日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(chymotrypsin-like protease)在终宿主体内的基因表达、定位和潜在功能,评估该蛋白在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护力。方法利用软件分析日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(Sj CTRL)基因(Gen Bank登录号为FN317561.1)的理化特性,及与其他物种同源基因的种系发生关系。采用整体原位杂交法定位Sj CTRL基因转录本在d26成虫中的表达部位。利用实时定量荧光PCR方法监测感染后14、18、22和26 d等4个发育时期雌雄虫的Sj CTRL基因转录水平。制备Sj CTRL-ds RNA,采用体外浸泡法对d26合抱雌雄虫进行RNA干扰,并利用共聚焦显微镜观察被干扰虫体的形态学变化。设计特异性引物扩增去除跨膜结构的编码基因序列,并克隆至p ET-28a原核表达载体,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)后进行原核表达。将纯化重组蛋白免疫C57BL/6小鼠,用尾蚴(40±2条/鼠)攻击感染进行动物保护性实验。同时设对照组。感染后35 d收集虫体和肝脏,统计减虫率、每克肝组织减卵率。结果原位杂交定位结果显示,该基因转录本位于雌虫后段肠道。Sj CTRL基因仅在d26雌虫体内有较高的转录本丰度。Sj CTRL-ds RNA干扰后雌虫相应基因转录本的相对表达量降至25.7%(P0.05),但未有可观察到的形态学变化。构建了p ET-28a/Sj CTRL重组质粒,诱导表达获得不可溶重组蛋白。免疫保护试验结果显示,减虫率为25.4%,减卵率为80.5%。结论初步探明日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因仅在d26雌虫的后段肠道高转录,体外干扰可降低Sj CTRL基因的转录本水平,该蛋白可一定程度上减少感染日本血吸虫的C57BL/6小鼠的成虫数和肝脏虫卵数。     

日本血吸虫促凋亡基因SjBAD的初步研究

目的了解日本血吸虫促凋亡基因Sj BAD的生物学、免疫学和转录表达特征,评估Sj BAD重组蛋白作为日本血吸虫病疫苗候选分子的潜力。方法根据Sj BAD的参考序列设计引物,应用PCR技术扩增Sj BAD基因,构建重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj BAD。采用实时定量PCR检测Sj BAD基因在日本血吸虫不同发育期及42 d雌、雄虫体内的转录水平;应用Western blotting和间接ELISA法分析Sj BAD重组蛋白的抗原性和免疫原性。用重组抗原Sj BAD免疫BALB/c小鼠,通过计算减虫率及肝脏减卵率,评估重组抗原作为血吸虫病候选疫苗分子的潜力。结果成功克隆了日本血吸虫Sj BAD基因,构建了重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj BAD,并在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白分子量约为22 k Da。Western blotting表明Sj BAD具有较好的抗原性和免疫原性,间接ELISA法检测表明重组蛋白免疫小鼠产生了高水平的特异性抗体Ig G。实时定量PCR检测发现Sj BAD基因在日本血吸虫的各个发育阶段均有转录,以14 d表达量最高,且在雄虫体内的表达量高于雌虫。两次动物免疫试验表明,重组蛋白Sj BAD在BALB/c小鼠体内诱导了30.82%和27.87%的减虫率,及42.52%和45.84%的肝脏虫卵减少率,均显著高于PBS对照组(P均0.05)。结论成功克隆、表达了日本血吸虫促凋亡相关基因Sj BAD,该基因在日本血吸虫不同发育期虫体内均有表达。纯化的重组Sj BAD蛋白在小鼠体内能诱导产生部分抗血吸虫感染的免疫保护效果。     

不同免疫方案对日本血吸虫22.6 kDa重组蛋白保护性免疫力的影响

目的比较福氏完全佐剂(FCA)、福氏不完全佐剂(FIA)与氢氧化铝(Al(OH)3)的免疫增强作用,探讨不同免疫方案对日本血吸虫22．6 kDa蛋白保护性免疫力的影响。方法通过基因工程技术获得rSj22．6／26GST重组抗原的大量表达,用亲和层析法制备rSj22．6／26GST融合蛋白并以凝血酶酶切获得纯化重组日本血吸虫22．6 kDa抗原(rSj22．6)。将纯化rSj22．6抗原分别与FCA、 FIA和Al(OH)3混合后,按照不同的免疫程序分别免疫BALB／c小鼠后进行日本血吸虫尾蚴攻击感染试验。用减虫率及减卵率表示免疫保护效果。结果 Western blot结果证实纯化的酶切产物是日本血吸虫22．6 kDa抗原。rSj22．6抗原与不同佐剂的免疫保护性实验结果提示:与PBS对照组相比．rSj22．6与FCA、FIA的协同作用均能诱导较高的成虫减虫率和总体减卵率(P均<0．01); rSj22．6与Al(OH)3的协同作用虽能诱导产生一定的总体减卵率(P<0．01),但未见有统计学意义的成虫减虫率(P>0．05)。各佐剂干预组所诱导的小鼠抗日本血吸虫感染的保护作用差异均无显著性(P均>0．05)。rSj22．6抗原诱导的保护作用在福氏佐剂的辅助下强于在Al(OH)3作用下的保护作用。结论福氏佐剂和Al(OH)3均可在一定程度上增强rSj22．6免疫小鼠的抗感染保护性免疫力,但福氏佐剂的增效作用强于Al(OH)3。     

日本血吸虫精氨酸酶新基因的鉴定及作为疫苗的保护性研究

目的 识别和鉴定日本血吸虫（Sj）精氨酸酶（ARG）新基因，并研究纯化的重组SjARG对Sj感染小鼠的保护性。　方法 通过巢式PCR，从日本血吸虫尾蚴cDNA文库特异扩增ARG基因cDNA序列的5′端，并用生物信息学进行鉴定；将ARG的完整编码序列（CDS）克隆到pET30a（+）载体，表达并纯化表达产物后，以鸟氨酸-茚三酮法鉴定酶活性；用蛋白质印迹法（Western blotting）比较重组ARG蛋白与Sj天然ARG蛋白的免疫学特性，间接免疫荧光法对ARG在Sj成虫中的分布进行组织定位；用纯化重组ARG蛋白免疫小鼠（PBS和SjGST作对照），Sj尾蚴攻击感染后，检测SjARG作为疫苗的免疫保护力。 结果 　扩增并鉴定SjARG基因的完整CDS长为1 095 bp；重组SjARG具有酶活性，并具有与Sj天然ARG蛋白相同的免疫学特性；ARG定位于Sj成虫的肠壁和生殖器官。重组SjARG蛋白免疫后的减虫率和减卵率分别为55.8%和48.8%。SjGST蛋白免疫后的减虫率和减卵率分别为28.6%和6.89%。 结论 获取并鉴定了SjARG新基因；SjARG比SjGST具有更高的疫苗保护性。     

日本血吸虫极低密度脂蛋白结合蛋白重组抗原的免疫保护性研究

目的?摇探讨日本血吸虫极低密度脂蛋白结合蛋白（SVLBP）重组抗原的免疫保护性及其作为候选疫苗的潜在价值。 方法 用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导克隆菌大量表达SVLBP重组抗原，以镍-次氮基三乙酸琼脂糖树脂（Ni-NTA）亲和层析法纯化制备SVLBP重组抗原；将纯化的重组抗原加福氏佐剂经皮下免疫C57BL/6小鼠，每隔2周免疫1次，在第3次免疫后10 d，经腹部皮肤攻击感染日本血吸虫尾蚴35±1条，感染后45 d剖杀，计数检获虫数和每克肝虫卵数（LEPG）。小鼠在免疫前和攻击感染后分别采眶窦血，用ELISA测定特异性IgG及其亚群抗体水平。 结果 相对于佐剂对照组，免疫组小鼠的减虫率为33.4%，减卵率为47.6%；免疫后小鼠产生高水平的特异性IgG（>1:6 400）；抗体亚类检测结果显示，免疫组小鼠 IgG2a、IgG2b、IgG1明显高于免疫前和佐剂对照组。 结论 日本血吸虫皮层蛋白SVLBP重组抗原能诱导小鼠产生一定的保护性免疫，是潜在的疫苗候选抗原分子。     

日本血吸虫24-26kDa抗原和重组Sj26抗原的抗原性和免疫原性比较研究

本文报告从日本血吸虫大陆株成虫抽提的24—26kDa抗原与源于日本血吸虫菲律宾株的重组Sj26抗原之间在抗原性和免疫原性上所进行的一系列比较研究。ELISA、IFA和Westernblotting等方法观察结果均表明,24—26kDa和rSj26抗原免疫后所诱导的特异性抗体与其对应的抗原之间具有明显的抗原交叉反应,而与其它血吸虫抗原如可溶性虫卵抗原也有交叉反应。若以两种抗原加福氏佐剂分别免疫小鼠,以日本血吸虫大陆株尾蚴攻击感染,减虫率相似(26～32％),表明两种抗原存在一定程度的交叉免疫保护性。这些研究结果为开发rSj26抗原,或是根据已知Sj26 cDNA核苷酸序列制备DNA探针,从已构建的日本血吸虫(大陆株)cDNA库筛选相关目的基因,加速血吸虫疫苗的研制起着重要作用。     

日本血吸虫脂肪酸结合蛋白DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫力的研究

目的构建日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj14FABP)重组质粒,并观察其在小鼠体内诱导的抗日本血吸虫感染保护作用。方法RT-PCR特异性扩增Sj14FABP基因,将其克隆入真核表达载体pVIVO2,通过PCR、双酶切及测序鉴定。获得的重组质粒pVIVO2-Sj14FABP转染HepG2细胞,间接免疫荧光(IFA)检测蛋白表达;并免疫BALB/c小鼠,30d后攻击感染,感染后45天剖杀,计数检获成虫数和肝脏虫卵数。结果RT-PCR扩增出大小为440bp的Sj14FABP片段,重组质粒经PCR和双酶切后均获得目的片段,转染细胞IFA结果显示有较强荧光。重组质粒免疫小鼠后分别获得24.1%减虫率和27.2%减卵率。结论成功构建和表达重组质粒pVIVO2-Sj14FABP,该核酸疫苗能够诱导小鼠产生部分抗血吸虫感染的保护力。     

日本血吸虫体表蛋白Tetraspanin 2-A核酸疫苗的构建及其对小鼠的免疫试验

采用PCR法扩增日本血吸虫体表四跨膜家族蛋白2-A（SjTsp2-A）基因,构建重组质粒pcDNA3.1（+）/SjTsp2-A,将其转至大肠埃希菌DH5α制备DNA疫苗pcDNA3.1（+）/SjTsp2-A。24只BALB/c小鼠均分3组,每鼠于左股四头肌注射0.5 mg/ml盐酸布比卡因50 μl。次日,A组同法注射DNA疫苗pcDNA3.1（+）/SjTsp2-A,B组注射重组质粒pcDNA3.1（+）/SjGST,C组注射空质粒pcDNA3.1（+）。注射剂量均为100 μg/只。每隔2周注射1次,共3次,末次免疫后2周各组均经腹部皮下感染日本血吸虫尾蚴40±2条/鼠,45 d后剖杀,计数减虫率和减卵率。ELISA检测抗体效价,A组化分析股四头肌局部组织蛋白表达情况。结果A组的平均检虫数和每克肝组织虫卵数均显著低于B组和C组（P值均<0.05）,A组的减虫率和减卵率分别为44.4%和28.4%。A组血清抗体效价高达1 ∶ 25 600。A、B两组局部组织均有特异性蛋白表达。DNA候选疫苗pcDNA3.1（+）/SjTsp2-A能诱导小鼠产生一定的免疫保护作用。     

日本血吸虫重组膜外蛋白rSj29免疫诊断的初步应用

目的用重组日本血吸虫相对分子质量(Mr)29000膜外蛋白(rSj29)作为诊断抗原,探讨其在血吸虫病流行区免疫诊断的价值。方法在血吸虫病低度流行区芜湖南陵县弋江镇蒲桥和竞河村现场采血394份,同时采集粪样,用改良加藤法(三送九检)或集卵孵化法检查。制备rSj29和成虫粗抗原(AWA),分别用2种抗原进行间接ELISA(单盲法)和间接红细胞凝集试验(IHA)检测血样。结果粪检、IHA、rSj29-ELISA和AWA-ELISA检测结果显示,阳性率分别为4.8%(19/394)、62.2%(245/394)、68.3%(269/394)和89.9%(354/394)。rSj29-ELISA和IHA检测结果差异无统计学意义(χ2=3.2,P0.05),一致率为80.7%(318/394)。IHA、rSj29-ELISA和AWA-ELISA与粪检符合率分别为42.6%(168/394)、36.0%(142/394)和15.0%(59/394)。结论 rSj29间接ELISA法对日本血吸虫病有一定诊断价值。     

日本血吸虫重组抗原SjPGAM-SjEnol的保护性免疫效果评价

目的构建日本血吸虫重组表达质粒pET32a-SjPGAM-SjEnol并在大肠埃希菌(E.coli BL21)中表达,观察重组抗原在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护作用。方法利用生物信息学技术筛选SjPGAM和SjEnol富含人源(HLA)Ⅱ类、鼠源(H2-d)Ⅱ细胞结合表位且与宿主同源性较小的肽段,将对应编码的核苷酸序列进行拼接,构建重组质粒pET32a(+)-SjPGAM-SjEnol,并在E.coli BL21中表达。用蛋白质印迹(Western blotting)分析该重组抗原的抗原性。用小鼠实验评估重组抗原的免疫保护效果,即将55只雄性BALB/c小鼠均分成5组,其中3个试验组分别用重组抗原pET32a-SjPGAM-SjEnol(A组)、pET28a-SjPGAM(B组)、pET28a-SjEnol(C组)(各27μg)与206佐剂混合后免疫小鼠,每次间隔2周,共免疫3次。同时设佐剂对照组(D组)和空白对照组(E组)。末次免疫后2周,每鼠经腹部皮肤分别感染日本血吸虫尾蚴40±2条,感染后6周,经肝门静脉灌注法收集成虫和检测每克肝虫卵数(EPG),计算减虫率和肝脏减卵率。各组小鼠分别于免疫前、各次免疫后1周尾部取血和剖杀时收集血清,应用ELISA检测血清特异性IgG抗体水平。结果确定SjPGAM的96~147、SjEnol的233~312肽段为重组片段。PCR扩增出一条含编码这两个肽段的核苷酸序列的重组DNA序列,大小447bp。获得的重组蛋白pET32a-SjPGAM-SjEnol相对分子质量(Mr)为33000。Westernblotting结果显示,该重组蛋白可被日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清识别,具有良好的抗原性。小鼠免疫实验结果显示,与空白组相比,A组获得39.7%的减虫率和64.9%的肝减卵率,其减虫率与B组(18.5%)、C组(14.7%)比较,差异有统计学意义(均P0.05);肝减卵率与B组(47.5%)、C组(30.5%)比较,差异也有统计学意义(P0.05,P0.01)。ELISA结果显示,第3次免疫后A组的特异性IgG抗体达到较高水平(2.372±0.268),与D组(0.490±0.138)、E组(0.220±0.088)间的差异有统计学意义(P0.01)。结论成功构建了重组表达质粒pET32a-SjPGAM-SjEnol,多表位重组蛋白pET32a-SjPGAM-SjEnol在小鼠抗血吸虫感染中比单一重组抗原pET28a-SjPGAM和pET28a-SjEnol诱导了更高的免疫保护作用。     

日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原诱导小鼠抗雌虫生殖免疫的研究

目的 探讨日本血吸虫云南株未成熟卵可溶性抗原（SIEA）免疫小鼠产生的抗雌虫生殖效果及作用机制。 方法 3 000条日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤感染家兔,第34天收集兔肝中的未成熟卵制备SIEA。20只ICR小鼠随机分为两组,免疫组（11只）每鼠背部皮下多点注射SIEA（100 μg/只）,对照组（9只）给予等量生理盐水,每2周免疫1次,共5次。末次免疫后1周,用（30±2）条血吸虫尾蚴攻击感染每只鼠。第45天收集小鼠粪便,第46天剖杀小鼠,心脏灌注法收集成虫,比较成虫数及粪便、肝组织、雌虫子宫内虫卵数和肝表面虫卵结节密度;透射电镜观察雌虫卵黄腺及雄虫睾丸组织。 结果 免疫组与对照组检获成虫数差异无统计学意义（P＞0.05）。免疫组小鼠每克粪便每条雌虫虫卵数、每克肝组织每条雌虫虫卵数、每条雌虫子宫内虫卵数及肝表面虫卵结节密度分别为（56.68±24.78）个、 （5 826±437）个、 （49.94±12.53）个和（10.04±1.13）个/0.25 cm2; 对照组分别为（89.93±32.18）个、 （10 016±3 541）个、（76.54±19.77）个和（19.22±2.45） 个/0.25 cm2,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。透射电镜观察显示,与对照组相比,免疫组小鼠体内雌虫卵黄腺内成熟卵黄细胞和脂滴减少,雄虫睾丸组织内支持细胞多见而精细胞较少,且卵黄细胞和支持细胞胞质内出现空泡。 结论 SIEA可能通过抑制日本血吸虫生殖细胞的成熟而产生抗雌虫生殖免疫效应。     

日本血吸虫SjPP基因重组杆状病毒的构建和在昆虫细胞中的表达

目的 在昆虫细胞中表达获得可溶性的日本血吸虫SjPP重组蛋白。 方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,通过RT-PCR扩增出SjPP基因的编码区序列,将其定向克隆到供体质粒pFastBac HT-B中,构建重组杆状病毒供体质粒pFastBac-SjPP,转化入大肠埃希菌DH10Bac进行转座,提取重组杆粒Bacmid-SjPP,用阳离子脂质体法转染粉纹夜蛾（TN5B1-4）细胞。利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析重组蛋白表达情况。 结果 构建了含日本血吸虫SjPP基因的重组杆粒Bacmid-SjPP,转染TN5B1-4细胞后,获得有感染力的重组杆状病毒,并在TN5B1-4细胞中成功表达SjPP蛋白。该重组蛋白可被抗SjPP蛋白的兔血清识别。 结论 成功构建SjPP基因重组杆状病毒,并在TN5B1-4细胞中表达,该蛋白具有良好的抗原性。     

日本血吸虫童虫cDNA文库免疫学筛选及阳性克隆的初步鉴定

用日本血吸虫感染14 d的小鼠血清免疫筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,将获得的7个阳性克隆进行核苷酸序列同源性分析,结果显示其中一个克隆所测序列与日本血吸虫HSP70有很高的同源性（分值score=650）,另有2个克隆所测序列分别与已报道的日本血吸虫FABP（score=229）和含锌指结构的CDGSH型蛋白样蛋白（score=246）明显同源,其余4个未找到已知的同源序列,为新基因。4个新基因序列已被GenBank接受（登录号为EU121231、202646、202647和202648）。     

日本血吸虫Mr 26000 GSTDNA疫苗和重组蛋白疫苗联合免疫的保护作用研究

目的 观察日本血吸虫Mr26000谷胱甘肽S-转移酶(Sj26)DNA疫苗和重组蛋白(rSj26GST)疫苗联合免疫对小鼠的保护作用。方法 将Sj26基因克隆入含有增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N3,构建重组质粒pEGFP-Sj26,并转染幼仓鼠肾细胞(BHK),用荧光显微镜和蛋白质印迹法(Western blotting)检测蛋白的表达。联合免疫组BALB/c小鼠分别在第0、2周用pEGFP-Sj26免疫2次,第4周再用rSj26GST加强免疫1次;而单独免疫的pEGFP-Sj26组及rSj26GST组,与上组同步各自免疫3次。末次免疫后2周进行感染攻击,45d后剖杀,计数成虫及肝内虫卵。同时设PBS对照组。结果 pEGFP-Sj26在BHK中能有效表达。联合免疫组的减虫率为50·8%,显著高于pEGFP-Sj26(28.0%)和rSj26GST组(25.5%)(P值均<0.01)。联合免疫组以及pEGFP-Sj26、rSj26GST组减卵率分别为32.7%、20.6%、33.0%;联合免疫组及rSj26GST组,肝组织中每条雌虫平均产卵数显著低于PBS对照组(P值均<0.01)。结论 联合免疫组的保护作用优于pEGFP-Sj26和rSj26GST单独免疫组。     

日本血吸虫rSj14-3-3疫苗和rSj26 GST疫苗联合免疫保护作用研究

目的观察日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)疫苗和重组M r2600谷胱甘肽S转移酶(rSj26GST)疫苗联合免疫对小鼠的保护作用。方法将含有Sj14-3-3和Sj26GST编码基因的菌株E.coliBL21/p ET28a涂布LB/Kana/IPTG/X-gal平板,培养、收集细菌、超声碎菌、分离、纯化,分别取5μL进行SDS-PAGE,观察纯化结果,采用BCA法测定重组蛋白的浓度。联合免疫组BALB/c小鼠分别在第0、2、4周用rSj14-3-3疫苗rSj26GST疫苗联合免疫;而单独免疫的rSj14-3-3组及rSj26GST组,与上组同步各自免疫3次。末次免疫后2周进行感染攻击,45d后剖杀,计数成虫及肝内虫卵。同时设PBS对照组。计算各组间的减虫率和减卵率,以及虫卵肉芽肿的大小。结果联合免疫组的减虫率为38.38%,显著高于rSj14-3-3(16.98%)和rSj26GST组(26.80%)(P0.01)。联合免疫组以及rSj14-3-3、rSj26GST组减卵率分别为48.81%、25.27%、41.41%;联合免疫组rSj14-3-3和rSj26GST组,肝组织中每条雌虫平均产卵数显著低于PBS对照组(P0.01)。联合组小鼠虫卵肉芽肿的直径为(173.9±35.0μm),显著小于对照组(267.7±28.6μm)(P0.01),联合组亦明显低于rSj14-3-3和rSj26GST组(P0.01)。结论联合免疫组的保护作用优于rSj14-3-3和rSj26GST单独免疫组。且联合免疫疫苗具有一定的抗虫卵肉芽肿及抗肝纤维化作用。     

重组日本血吸虫Sj16蛋白调节宿主炎症反应的实验研究

目的 评价日本血吸虫重组蛋白（reSj16）调节宿主炎症反应的效果。方法 在大肠埃希菌中对重组pGEX-4T-1-Sj16基因进行原核表达并纯化重组蛋白。56只昆明小鼠随机分为7组（每组8只）,其中5个实验组,所用reSj16蛋白剂量分别为0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μg/kg;并设地塞米松（5.0 μg/kg）和生理盐水（0.1 ml/只）对照组。进行小鼠耳廓肿胀和毛细血管通透性实验,观察reSj16蛋白对二甲苯致小鼠耳廓肿胀作用和毛细血管通透性改变的影响。56只SD大鼠进行角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀实验,56只昆明小鼠进行实验性腹膜炎小鼠腹腔毛细血管通透性改变实验,观察reSj16调节宿主炎症反应效果。 结果 0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μg/kg的reSj16蛋白均可明显减轻二甲苯所致小鼠耳廓肿胀和毛细血管通透性增加,抑制角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀,明显抑制实验性腹膜炎小鼠腹腔毛细血管通透性增高,且具有一定的剂量依赖关系。1.0、5.0和10.0 μg/kg的reSj16蛋白组与对照组相比,差异具有统计学意义。 结论 Sj16具有明显的调节宿主炎症反应的作用。     

日本血吸虫热休克蛋白70(Sj HSP70)的抗体反应特征及免疫诊断价值

目的制备重组日本血吸虫中国大陆株热休克蛋白[rSj HSP70(Grp78)],检测其抗体反应特征及用于血吸虫病免疫诊断的价值。方法以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板逆转录合成cDNA,采用基因特异性引物,通过PCR技术扩增编码Sj HSP70(Grp78)成熟肽的基因片段,并将该片段插入到表达质粒pET28a(+)中,构建表达质粒HSP70(Grp78)-pET28a。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后采用镍亲和层析法制备纯化的可溶性rSj HSP70(Grp78)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)及Western blot检测rSj HSP70(Grp78)的抗体反应特异性及抗rSj HSP70(Grp78)IgG在血吸虫感染小鼠血清中动态变化,以分析其早期诊断与疗效考核价值,并比较rSj HSP70(Grp78)-ELISA与SEA-ELISA检测血吸虫感染者血清抗体IgG的敏感性与特异性。结果编码Sj SP70(Grp78)成熟肽基因片段克隆成功,并获得纯化的分子质量单位约69ku的重组表达Sj HSP70(Grp78)蛋白。Western blot显示Sj HSP70(Grp78)蛋白能被日本血吸虫感染的小鼠及人血清识别,但不与华支睾吸虫病和卫氏并殖吸虫病患者血清及健康人、鼠血清反应。感染小鼠血清抗Sj HSP70(Grp78)IgG水平与血吸虫感染度呈正相关,并随着感染时间延长呈增强趋势,在感染后16~18周达到峰值,随后开始回调,但始终维持在较高水平。治疗组小鼠经药物治疗后第2周(感染后第8周),体内抗体水平迅速上升并达到高峰,经过短暂下降后再次上升,出现第二个高峰,随后逐渐回调,至治疗16周(感染后第22周),部分小鼠抗体水平已接近阴性阈值。部分个体在血吸虫感染后1周即可检测到血清抗rSj HSP70(Grp78)IgG。分别以rSj HSP70(Grp78)和SEA血吸虫、华支睾吸虫及卫氏并殖吸虫感染者血清及健康人血清,敏感性分别为82.9%和95.7%,特异性分别为94.3%和85.7%,与健康人血清的交叉反应率分别为0和16.67%,与华支睾吸虫感染者血清的交叉反应率分别为5.7%和14.29%;与卫氏并殖吸虫感染者血清的交叉反应率分别为5%和65%。结论 Sj HSP70(Grp78)具有高度的抗原特异性,以此为抗原采用ELISA检测抗Sj HSP70(Grp78)IgG具有日本血吸虫病辅助诊断价值,并具有一定的早期诊断与疗效考核潜能。