神经干细胞植入大鼠海马中的迁移

目的：观察成鼠神经干细胞主切割海马伞侧海马和正常侧海马后的存活和迁移情况。方法：取成鼠前脑室下带（SVZ）组织制成单细胞悬液，接种于含EGF和bFGF和DMEM/F12(1：1）无血清培养基中，待神经球形成后，用有限稀释法进行单细胞克隆。将单克隆细胞球进行消化，分离，加入BrdU标记并扩增成大量来源于同一细胞的亚细胞系神经干细胞克隆球。取SD大鼠，切割其右侧海马伞，术后14天，将标记有BrdU的神经干细胞植入两侧海马齿状回中。移植术后1月，取脑冰冻切片，作Nissl染色和BrdU免疫荧光检测。结果：Nissl染色片两侧海马齿状回中有许多大小不等的深染细胞沿颗粒下层排列。两侧移植区中的BrdU免疫荧光标记细胞均从移植区沿海马颗粒下层迁移，形成一明显的迁移带。切割海马伞侧海马的BrdU免疫荧光亮点密度明显大于正常侧海马内的免疫荧光亮点密度。免疫荧光片Nissl复染发现齿状加的深染细胞与RrdU免疫荧光亮点相对应，在切割海马伞侧海马齿状回内有大胞体的神经元样细胞，而正常侧较少见。结论：移植至海马齿状回中的神经干细胞能存活，并可沿正常海马齿状回中固有的神经干细胞迁移路径即颗粒下层迁移。切割海马伞侧海马内存活和迁移的神经干细胞明显多于正常侧海马内的神经干细胞。提示切割海马伞侧海马齿状回内促进神经干细胞存活并诱导其迁移，分化的物质表达增强。     

穹窿海马伞切割后海马内NSCs的增殖和向神经元的分化

目的观察切割穹窿海马伞侧和非切割侧大鼠海马内自体神经干细胞的增殖和向神经元分化的情况。方法切割SD大鼠右侧穹窿海马伞,术后2 d腹腔注射BrdU,连续5d,于术后28 d取脑冰冻切片,进行BrdU/NF-200免疫荧光双标检测。结果切割穹窿海马伞侧海马内的BrdU免疫荧光阳性细胞明显多于非切割侧,且发现有BrdU/NF-200双标神经元,而非切割侧未见到BrdU/NF-200双标神经元。结论穹窿海马伞切割后,切割侧海马内自体神经干细胞增殖加快,并可向神经元分化。     

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析切割海马伞大鼠海马组织蛋白

目的 :应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统研究切割海马伞后大鼠海马组织蛋白的生化改变 ,为分离、纯化海马中诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的信号物质奠定基础。方法 :取SD大鼠 ,行单侧切割海马伞术 ,于术后不同时期取切割侧海马和正常侧海马组织。进行 10 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。观察切割海马伞海马和正常海马的蛋白表达差异。结果 :两者在低分子量区存在一条差异性蛋白条带。其中正常海马组织的条带染色最浅 ,切割海马伞海马组织中 10天组和 2 0天组染色较深 ,14天组染色最深。结论 :结合我们过去实验 ,本研究中切割海马伞海马及正常海马组织蛋白出现的差异性条带中 ,可能存在着诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的信号物质     

原位杂交法检测切割穹窿海马伞大鼠海马中PEBP mRNA的表达

目的：探讨切割穹窿海马伞侧大鼠海马与正常侧海马中PEBP mRNA的表达差异。方法：取6只大鼠,于切割右侧穹窿海马伞后第7d,应用寡核苷酸探针原位杂交技术观察PEBP mRNA在切割侧和正常侧海马中的表达差异。结果：切割侧锥体细胞层和齿状回颗粒层PEBP mRNA阳性细胞数量与正常侧比较无明显差异（P〉0.05）,但切割侧的杂交信号强于正常侧（P〈0.05）;而在齿状回门区和颗粒下层,切割侧PEBP mRNA阳性细胞数量多于正常侧,杂交信号也强于正常侧（P〈0.05）。结论：结合本课题组以往的工作,切割穹窿海马伞后海马内PEBP mRNA的表达上调,可能与海马内神经干细胞向胆碱能神经元的分化有关。     

大鼠海马中83KD蛋白诱导神经干细胞向AChE阳性神经元定向分化的作用

目的：探讨海马组织中83KD蛋白诱导神经干细胞向ACHE阳性神经元定向分化的作用。方法：将切割海马伞后14天海马和正常海马组织匀浆进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据染色脱色结果取83KD差异蛋白条带进行电洗脱，将收集到的蛋白质加入到鼠胚神经干细胞球培养液中，并设阴性对照组。12天后，用AChE组织化学染色检测神经干细胞分化为AChE阳性神经元的情况。结果：83KD切割组中AChE阳性神经元较多，胞体较大且分化较好，突起较粗且长；83KD正常组中AChE阳性神经元数量较少，胞体较小，突起也较短；空白对照组仅看到少量的AChE阳性神经元，胞体很小，突起短而少。结论：海马中83KD蛋白具有诱导神经干细胞向AChE阳性神经元定向分化的作用。     

碱性成纤维细胞生长因子对海马伞切断大鼠海马神经细胞增殖的影响

目的探讨碱性成纤维细胞生成因子(bFGF)对海马伞切断造成的阿尔茨海默氏病(AD)模型大鼠海马齿状回神经细胞增殖的影响.方法 AD处理组及AD对照组大鼠单侧海马伞切断制造阿尔茨海默病模型;正常对照组注射生理盐水.AD处理组造模后每天侧脑室注射bFGF共7天;AD对照组及正常对照组同时间注射生理盐水.BrdU标记增殖细胞.TUNEL方法标记DNA片段,原位检测凋亡细胞.计数海马齿状回各区域BrdU阳性细胞与凋亡细胞数.结果 AD处理组大鼠与AD对照组大鼠相比,海马齿状回BrdU阳性细胞增加明显(P<0.01), 而凋亡细胞差异不显著(P>0.05).AD对照组大鼠与正常对照组大鼠相比,海马齿状回BrdU阳性细胞数及凋亡细胞数差异均不显著(P>0.05).结论 bFGF可促进AD模型大鼠海马神经细胞的增殖.是治疗AD等神经缺损性疾病有希望的一种神经生长因子.     

蒺藜皂苷诱导SD新生大鼠海马神经干细胞分化的实验研究

目的 探讨蒺藜皂苷对于诱导SD新生大鼠海马神经干细胞(neural stem cells, NSCs)分化的影响作用以及蒺藜皂苷培养液浓度变化对其的影响.方法 采用无血清和单克隆培养方法,将蒺藜皂苷加入离体的海马NSCs的培养液中,应用Nestin、BrdU、NF200、GFAP免疫荧光染色观察NSCs的形态及分化而来的神经元、神经胶质细胞形态,并检测由海马NSCs分化而来的细胞的数量.结果 海马NSCs在无血清培养下,可形成Nestin阳性细胞球.在诱导分化后,免疫荧光染色可见NF阳性细胞、GFAP阳性细胞,而其中20 mg/kg 蒺藜皂苷干预组海马NSCs向神经元的分化比例最高.结论 在蒺藜皂苷的作用下,海马NSCs向神经元分化的数量增多.     

碱性成纤维细胞生长因子影响痴呆大鼠海马神经发生

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对海马伞切断造成的阿尔茨海默氏病(AD)模型大鼠海马齿状回神经发生的影响.方法 AD处理组及AD对照组大鼠左侧海马伞切断制造阿尔茨海默病模型;正常对照组注射生理盐水.AD处理组造模后每天侧脑室注射bFGF共7 d;AD对照组及正常对照组同时间注射生理盐水.BrdU标记增殖细胞.TUNEL方法标记DNA片段,原位检测凋亡细胞.计数海马齿状回BrdU阳性细胞与凋亡细胞数.结果 AD处理组大鼠与AD对照组大鼠相比,海马齿状回BrdU阳性细胞增加非常显著(P＜0.01),而凋亡细胞差异不显著(P＞0.05),AD对照组大鼠与正常对照组大鼠相比,海马齿状回BrdU阳性细胞数及凋亡细胞差异均不显著(P＞0.05).结论 bFGF可刺激AD模型大鼠海马神经发生.是治疗AD等神经缺损性疾病有希望的一种神经生长因子.     

切割海马伞大鼠海马自然凝胶电泳差异蛋白条带诱导神经干细胞迁移的作用

目的 :观察切割海马伞海马和正常海马组织自然凝胶电泳的差异性蛋白条带与大鼠神经干细胞共培养后细胞迁移的情况。方法 :用无血清培养技术从SD大鼠胚脑中分离、克隆和扩增神经干细胞备用。切割SD大鼠单侧海马伞 ,分别于术后不同时期取切割侧海马和正常侧海马进行 10 %的自然凝胶电泳。根据染色的蛋白条带位置将未染色的含差异蛋白条带的自然凝胶切成胶条块 ,分别放置于 2 4孔培养板各孔中并接种神经干细胞球与其共培养 ,观察神经干细胞的迁移情况。结果 :切割组蛋白胶块附近的神经干细胞球中的细胞特异性地向胶条方向迁移生长 ,这种现象切割组较正常组明显 ,在切割组中尤以 14天组最为显著。结论 :切割海马伞侧海马和正常海马组织自然凝胶电泳差异性蛋白条带能诱导神经干细胞向其定向迁移生长 ,证实此差异性蛋白条带中具有诱导大鼠神经干细胞迁移的物质     

碱性成纤维细胞生长因子对海马伞切断大鼠海马神经细胞增殖的影响

目的 探讨碱性成纤维细胞生成因子(bFGF)对海马伞切断造成的阿尔茨海默氏病(AD)模型大鼠海马齿状回神经细胞增殖的影响。方法 AD处理组及AD对照组大鼠单侧海马伞切断制造阿尔茨海默病模型；正常对照组注射生理盐水。AD处理组造模后每天侧脑室注射bFGF共7天；AD对照组及正常对照组同时间注射生理盐水。BrdU标记增殖细胞。TUNEL方法标记DNA片段，原位检测凋亡细胞。计数海马齿状回各区域BrdU阳性细胞与凋亡细胞数。结果 AD处理组大鼠与AD对照组大鼠相比，海马齿状回BrdU阳性细胞增加明显(P＜0．01)，而凋亡细胞差异不显著(P＞0．05)。AD对照组大鼠与正常对照组大鼠相比，海马齿状回BrdU阳性细胞数及凋亡细胞数差异均不显著(P＞0．05)。结论 bFGF可促进AD模型大鼠海马神经细胞的增殖。是治疗AD等神经缺损性疾病有希望的一种神经生长因子。     

银杏叶提取物对切割海马伞大鼠隔区胆碱能神经元的保护作用

目的：研究银杏叶提取物对切割海马伞大鼠隔区胆碱能元的保护作用。方法：实验组和对照组动物在切割海马伞前后分别用银杏叶提取物和蒸馏水灌胃，术后第4周灌注固定，取隔区切片进行Nissl染色及胆碱乙酰转移酶（ChAT)免疫组化染色，显微镜下记数切割海马伞侧内侧隔核和斜角带垂直支ChAT阳性神经元数目。用CMM－301图像分析系统对切割海马伞侧隔区ChAT阳性神经元的面积、周长等指标进行分析处理，用t检验作统计学分析。结果：实验组切割海马伞侧隔区的ChAT阳性神经元数明显多于对照组（P＜0．01），其神经元的胞体面积及周长指标实验组均好于对照组（P均＜0．01）。结论：银杏叶提取物对切割海马伞大鼠的隔区胆碱能神经元具有保护作用。     

氦氖激光穴位照射对缺血缺氧后新生大鼠海马神经元增殖的影响

目的：探讨氦氖激光穴位照射疗法对缺血缺氧新生大鼠脑损伤后海马神经元增殖的影响。方法：7d龄健康Wistar大鼠72只随机分成4组：假手术组、缺血缺氧组、缺血缺氧激光穴位照射组、缺血缺氧激光非穴位照射组。制备新生大鼠缺血缺氧脑损伤模型,激光穴位照射组选择“百会”和“大椎”穴位给予氦氖激光照射．激光非穴位照射组选择腹部非穴位部位进行激光照射,常规饲养22d后处死,处死前经腹腔注射5-溴-2-脱氧脲嘧啶(BrdU)标记增殖细胞。取左侧脑做组织切片,HE、Nissl染色以及采用抗BrdU抗体和神经上皮蛋白(Nestin)抗体进行免疫组织化学染色。结果：激光穴位照射组与其他组比较海马神经元胞体内尼氏体丢失较少,神经元坏死减轻,海马齿状回BrdU标记的免疫阳性细胞数增加,海马CA1区Nestin免疫阳性细胞数增高。结论：激光穴位照射对海马神经元有保护作用,促进了海马神经元的增殖。     

全脑缺血-再灌注损伤后大鼠海马齿状回神经元发生的研究

目的：观察脑缺血－再灌注损伤后大鼠海马齿状回神经元发生的时间规律，探讨缺血性脑损伤后神经元发生的机制。方法 采用4血管闭塞法建立大鼠全脑缺血模型。使用5－溴脱氧尿核苷（5-bromodeoxyuridine,BrdU)标记有丝分裂和免疫组织化学方法观察大鼠海马齿状回的神经元发生，并采用荧光组织化学方法和激光共 焦显微镜确定新生细胞类型。结果 缺血性脑损伤可促进成年大鼠齿状回的细胞增殖。与对照组相比，大鼠全脑缺血－再灌注损伤后3d时，齿状回BrdU阳性数据胞数目没有显著性增加（P＞0．05），此后，齿状回BrdU阳性细胞数目开始显著增加，并于全脑缺血再灌注损伤后第14日时达到峰值。此时，齿状回BrdU标记阳性细胞数量是对照组的7倍。对新生细胞的分化过程进行观察后发现齿状回BrdU标记阳性细胞大部分可以分化为神经元。结论 缺血性脑损伤可诱导海马齿状回神经元发生水平在一定时间窗内上调，其机制可能与缺血引起脑组织激素水平、神经递质、神经营养因子浓度发生变化以及齿状回局部微环境改变有关。     

RT-PCR/Southern杂交法检测穹窿海马伞切割大鼠海马Brn-4 mRNA的表达变化

目的:探讨切割穹窿海马伞大鼠海马与正常海马内Brn-4 mRNA表达的差异。方法:42只SD大鼠随机分成正常对照组和切割穹窿海马伞后1、3、7、14、21及28d组。取各组大鼠的海马组织,提取总RNA,采用RT-PCR/Southern杂交方法分析穹窿海马伞切割后海马内Brn-4 mRNA的表达变化。结果:海马内Brn-4 mRNA的表达量在切割后第3d开始升高,14d达到最高水平,随后下降,28d左右恢复至正常水平。结论:切割穹窿海马伞后海马内Brn-4mRNA表达明显上调,可能与促进海马内移植的或自体的神经干细胞向神经元分化有关。     

Noggin蛋白对D 半乳糖致衰老小鼠学习记忆及海马齿状回神经发生的影响

目的观察侧脑室注射Noggin蛋白后对D 半乳糖致衰老模型小鼠学习记忆行为能力与海马齿状回神经发生的影响。方法采用皮下注射D 半乳糖构建衰老小鼠模型后,连续7?d侧脑室注射Noggin蛋白,对照组同时注射等量生理盐水,造模42?d后对各组小鼠进行Y迷宫学习记忆能力测试,用BrdU标记海马齿状回增殖细胞。 结果Y迷宫检测结果表明,模型组小鼠学习记忆能力较正常对照组明显降低（P<0.05）,而模型治疗组小鼠学习记忆能力较模型对照组明显改善（P<0.05）;模型组与模型对照组小鼠海马齿状回BrdU阳性细胞数较正常对照组减少（P<0.05）,而模型治疗组BrdU阳性细胞数较模型组、模型对照组显著增多（P<0.05）。结论侧脑室给予Noggin蛋白可改善衰老模型小鼠的空间学习及记忆能力,可能与Noggin能保护海马神经元并促使齿状回神经干细胞增殖有关。        

海马外泌体中miR-219a-1-3p对神经干细胞向神经元分化的影响

目的：探讨海马外泌体中miR-219a-1-3p对神经干细胞(neural stem cells, NSCs)向神经元分化的影响。方法：切割穹窿海马伞,构建去神经支配海马大鼠模型,分离提取切割组和正常组海马外泌体,与SD大鼠海马NSCs共培养,利用实时定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)、Western Blot和免疫荧光技术检测外泌体在NSCs向神经元分化中的作用;通过RNA-seq方法检测外泌体中表达变化的miRNA,利用Real-time PCR对差异表达的miR-219a-1-3p进行验证,并检测其在成年SD大鼠各组织以及NSCs、星形胶质细胞和神经元中的表达水平。利用miR-219a-1-3p mimic转染NSCs,Real-time PCR、Western Blot和细胞免疫荧光检测miR-219a-1-3p对NSCs向神经元分化的影响。结果：切割组海马组织外泌体可促进NSCs向神经元分化;海马组织外泌体中差异表达的miR-219a-1-3p与RNA-seq结果一致;miR-219a-1-3p在端脑和海马中呈现优势表达;miR-219a-1-3p在NSCs中表达较高,而在星形胶质细胞中表达较低;过表达miR-219a-1-3p可抑制NSCs向神经元分化。结论：海马外泌体促进NSCs向神经元分化可能与miR-219a-1-3p下调有关。     

胚胎干细胞源性与海马源性神经干细胞培养与分化的特性比较

【目的】探讨胚胎干细胞(ESCs)源性神经干细胞(NSCs)与海马源性NSCs的培养条件与分化特性,并进行比较研究。【方法】将拟胚体阶段视黄酸及视网膜Muler细胞诱导的ESCs和自60只BALB/c胎鼠海马组织分离的细胞(每次实验取10只),分别在NSCs选择性培养基中进行NSCs培养筛选,观察细胞形态变化,RT-PCR法检测Nestin基因表达,免疫细胞化学法检测Nestin等NSCs特异性标志物,对其分化后细胞检测Map2、Gap43、NF200、S100、GFAP神经组织细胞标志抗原,并对6次诱导结果进行观察比较。【结果】初级诱导的ESCs及海马细胞,在NSCs选择性培养基中培养,均形成大量呈Nestin抗原阳性,整合BrdU,表达Nestin基因的神经球样结构,且具有体外扩增传代及分化为神经元及神经胶质样细胞的能力。但ESCs源性NSCs增殖力更强,且分化细胞中NF200阳性细胞率42.1％±3.6％高于海马源性NSCs分化细胞中NF200阳性细胞率18.7％±5.1％,P<0.01。【结论】体外诱导可获得ESCs源性NSCs,与海马源性NSCs相比有更强的增殖力和向神经元分化的潜能,可作为干细胞移植治疗青光眼等神经变性疾病研究新的种子细胞。     

心脉隆注射液对新生SD大鼠海马神经干细胞增殖分化的影响

目的初步探讨心脉隆注射液对新生SD大鼠海马神经干细胞增殖分化作用的影响。方法分离新生SD大鼠海马组织,采用无血清及单克隆培养方式获得大量神经干细胞,将不同浓度心脉隆注射液加入第3代神经干细胞单细胞悬液中有血清贴壁培养并分实验组和对照组,应用免疫荧光及细胞化学染色检测Nestin、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)、微管相关蛋白2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,计算MAP-2阳性细胞百分率。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法观察心脉隆注射液对神经干细胞增殖能力的影响。结果海马NSCs在分化后,各心脉隆注射液干预组MAP-2阳性细胞比例均较空白对照组增高(P<0.05),MTT结果显示培养5 d后各药物组NSCs增殖能力均较对照组增强(P<0.05)。结论心脉隆注射液具有促进神经干细胞增殖并向神经元方向分化的作用。     

慢性应激抑郁模型大鼠海马神经干细胞的增殖、存活和分化

目的 探讨慢性应激抑郁状态对大鼠海马神经干细胞的影响.方法 应用慢性不可预知温和应激和孤养法建立抑郁模型,分为对照组、CUMS 14 d组、CUMS 28 d组,采用免疫组化、免疫荧光,测定大鼠海马神经干细胞的增殖、存活和分化的改变.结果 海马神经干细胞增殖:与对照组( 2919.50±188.80)比较,14d CUMS组(2254.17±164.41)和28 d CUMS组(1900.33±104.10)海马齿状回BrdU阳性细胞数均减少,差异有统计学意义(P＜0.01).海马神经干细胞存活:与对照组( 2404.50±148.77)相比,CUMS 28 d组(1845.33±126.88) BrdU阳性细胞数明显减少,差异有统计学意义(P＜0.01).海马神经干细胞分化:与对照组[ NeuN/BrdU(71.63±10.21),GFAP/BrdU( 14.34±2.03)]比较,CUMS 28d组[NeuN/BrdU(69.11±11.30),GFAP/BrdU( 17.27±2.93)]细胞分化无明显变化(P＞0.05).结论 慢性应激抑郁模型大鼠海马齿状回神经干细胞的增殖和存活受到抑制,但干细胞的分化无明显改变.     

Y迷宫训练对成年大鼠海马齿状回细胞的增殖作用

目的观察Y迷宫训练对成年大鼠海马齿状回(dentategyrus,DG)神经干细胞/前体细胞的增殖作用。方法通过Y迷宫训练,用5溴2脱氧尿嘧啶核苷(5bromo2deoxyuridine,BrdU)标记增殖细胞,用ABC免疫细胞化学方法观察成年大鼠海马齿状回细胞的增殖情况。结果Y迷宫训练组海马齿状回BrdU阳性细胞数明显多于对照组(P<0.05),且Y迷宫训练成绩的优劣与海马齿状回神经细胞增殖的多少存在相关性,学习成绩良好组齿状回BrdU阳性细胞数显著多于学习成绩低劣组(P<0.05)。结论Y迷宫训练可促进成年大鼠海马齿状回神经干细胞/前体细胞的增殖。