大鼠脑动脉平滑肌细胞的体外培养与鉴定

目的建立大鼠颅内脑动脉平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)的体外培养方法。方法无菌条件下分离大鼠脑基底动脉,去除血管外膜后剪成约0.2mm的小段,分别用0.1% Ⅰ型胶原酶、0.125%胰蛋白酶消化,细胞用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养。采用人工刮除法及差速贴壁法纯化细胞。SMCs通过形态学观察及α-平滑肌肌动蛋白免疫细胞化学方法鉴定。结果原代培养3d后细胞开始贴壁,2w后细胞呈梭形,汇合后具有典型的峰-谷生长特点。传代培养的细胞保持上述特征,第5代细胞经α-平滑肌肌动蛋白表达鉴定,纯度达97%以上。台盼蓝排斥实验检测细胞存活率>95%。结论这种方法操作简单、结果可靠、成本低廉,可为颅内动脉粥样硬化等脑血管病机制和治疗的研究提供适宜的体外培养细胞模型。     

Notch3基因突变导致动脉平滑肌细胞蛋白表达减少

目的 报道Notch3基因突变后微小动脉血管平滑肌细胞相关蛋白的表达特点.方法 6个CADASIL家系先证者的诊断均经过血管超微病理检查和Notch3基因检查加以证实.对6例先证者的腓肠神经标本进行免疫病理检查,第一抗体为抗α-平滑肌肌动蛋白、肌球蛋白重链、结蛋白和波形蛋白.结果 直径≥100 μm的微小动脉平滑肌细胞出现α-平滑肌肌动蛋白、肌球蛋白重链和结蛋白不同程度减少,而波形蛋白表达增强.直径<100 μm的微小动脉平滑肌细胞出现肌球蛋白重链和结蛋白减少,α-平滑肌肌动蛋白减少不明显,波形蛋白表达增强.结论 不同Notch3基因突变均可以导致不同直径的微小动脉平滑肌细胞处于合成状态,其中大直径的微小动脉改变更明显.     

以差速贴壁与化学药物并胰酶限时消化法纯化新生大鼠嗅鞘细胞：优于单一差速贴壁和化学药物法吗？★

背景：目前国内外对嗅鞘细胞培养条件的报道各不相同，个别方法重复性较差，不利于实际应用。 目的：观察差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化法纯化大鼠嗅鞘细胞的效果，并与化学药物法、差速贴壁法培养结果进行比较。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察，于2007-06/2008-06在福建医科大学人体解剖与组织胚胎学系实验室完成。 材料：新生2 d的SD大鼠8只，由福建医科大学试验动物中心提供。 方法：无菌条件下完整取出大鼠双侧嗅球，剥除嗅球表面的软脑膜及毛细血管网，剪成0.5 mm3的小块进行胰蛋白酶消化，过筛后按4.0×108 L-1密度种植于包被多聚左旋赖氨酸的培养瓶中进行原代培养。设立4组：①未经纯化的常规对照组。②化学药物组加入5 μmol/L阿糖胞苷抑制成纤维细胞分裂。③差速贴壁组采用Nash差速贴壁法纯化嗅鞘细胞。④差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化组首先采用Nash差速贴壁法去除大部分成纤维细胞，而后对于少量残留的成纤维细胞加入阿糖胞苷处理，培养6 d贴壁细胞大部分融合后，加入1.25 g/L胰蛋白酶消化1 min，显微镜下见突起回缩、细胞变圆、少量细胞浮起时终止消化。 主要观察指标：嗅鞘细胞的形态，NGFR p75免疫细胞荧光染色结果。 结果：体外培养的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞主要为双极或三极细胞，其突起细长；未经纯化的常规对照组培养7 d时视野内成纤维细胞已达60%以上，至14 d成纤维细胞完全长满；经过纯化处理的另外3组始终以嗅鞘细胞居多，嗅鞘细胞的形态与原代基本相同。存活的双极和3极嗅鞘细胞呈NGFRp75阳性反应，但化学药物组、差速贴壁组嗅鞘细胞纯度偏低，仅为75%；差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化组嗅鞘细胞纯化效率明显增高，达85%以上。 结论：实验结果证实了差速贴壁+化学药物＋胰酶限时消化法的三合一操作技术，是一种高效率的纯化培养嗅球嗅鞘细胞的方法。     

组织工程尿道在裸鼠皮下的埋置

背景：由于创伤、先天畸形、肿瘤或手术继发的尿道缺损、狭窄、憩室等病理状况下，需要采用自体组织修复其缺损。 目的：验证构建组织工程化尿道的可行性。 设计、时间及地点：观察性实验，于2005-01/2006-01在中山大学林百欣医学研究中心完成。 材料：雄性新西兰兔10只，体质量3.0~3.5 kg，用于制备脱细胞尿道；4~6周龄BALB/cA-nude裸鼠20只，体质量18~20 g，与细胞外基质材料复合体进行体内培育。 方法：取新西兰兔完整尿道，脱细胞后形成细胞外基质材料，切取成体新西兰兔阴茎头约1/2大小，组织块法培养扩增兔平滑肌细胞；之后将尿道海绵体平滑肌细胞种植到脱细胞尿道基质上，将其植入裸鼠背部皮下进行培育。实验分为2组，实验组埋置细胞材料复合体，对照组埋置未接种细胞的单纯脱细胞尿道基质。 主要观察指标：植入后1，2，4，6，8周取材，行大体和组织学及电镜观察细胞材料复合体的生长情况，免疫组织化学鉴定平滑肌细胞的表达。 结果：①大体观察裸鼠背部切口愈合良好，饮食活动正常。植入后1，2周实验组脱细胞基质表面已有少量的组织膜形成； 4周组织膜逐渐增厚，有小血管长入；6，8周脱细胞基质材料逐渐被新的细胞替代。②苏木精-伊红染色可见，随着时间延长，脱细胞材料逐渐被吸收，被各种细胞代替。其中平滑肌细胞最多，并可见大小不等的血管长入基质，部分有形成血窦的倾向；提示复合材料在裸鼠体内逐渐形成类似正常尿道的组织结构。③电镜观察从第4周有血管长入基质，可见较多的平滑肌细胞和内皮细胞及少量的成纤维细胞和巨噬细胞，并有部分平滑肌细胞凋亡。④α-平滑肌肌动蛋白抗体进行免疫组织化学染色后可见有平滑肌细胞生长。 结论：采用组织工程技术可再造出类似于正常尿道的海绵体组织。     

血管组织工程种子细胞原代培养技术的改良**★

背景：如何获取高质量的种子细胞是构建组织工程血管的先决问题。 目的：改良血管组织工程种子细胞原代培养技术并观察其生物学特性。 设计、时间及地点：以细胞为培养对象，观察性实验，于2006-12/2008-03在江西省分子医学重点实验室完成。 材料：新西兰家兔，体质量2 kg左右，用于血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的原代培养。 方法：以胶原酶胰酶序贯消化法获得血管内皮细胞、快捷贴壁法培养血管平滑肌细胞。 主要观察指标：免疫细胞化学法对两者进行鉴定；流式细胞术检测第2代和第6代血管内皮细胞的增殖指数。 结果：培养的种子细胞符合各自特征，免疫细胞化学鉴定其为血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。内皮细胞第2代和第6代细胞增殖指数分别为(20.87±2.05)%和(9.75±1.76)%。 结论：胶原酶胰酶序贯消化法和快捷贴壁法可以较稳定地获取血管内皮细胞及血管平滑肌细胞；第2代的内皮细胞较第6代更适用于构建组织工程血管。     

去细胞同种异体神经种植许旺细胞的体外实验：组织工程化人工神经应用的可行性

目的：许旺细胞作为种子细胞在组织工程化人工神经制备中的作用已被学术界所接受。胎兔的神经系统已发育完善，而免疫系统尚未成熟，探讨将胎兔许旺细胞植入去细胞同种异体神经桥接体制备组织工程化人工神经修复周围神经缺损的可行性。 方法：实验于2005-03/2006-03在河北医科大学第三医院完成。①实验材料：SPF级怀孕28 d的新西兰白兔2只、成年新西兰白兔1只。②实验过程：包括胎兔许旺细胞培养、去细胞神经桥接体的制备以及许旺细胞与去细胞神经桥接体的体外种植3个步骤。使用双酶消化法培养许旺细胞并将其种植于经3% TritonX-100作用96 h后的同种异体神经中。③实验评估：分别于培养的1，3，5 d通过石蜡切片苏木精-伊红染色观察许旺细胞在桥接体中的生长情况。 结果：①采用双差速贴壁法去除绝大部分成纤维细胞后在细胞培养的初期使用阿糖胞苷抑制成纤维细胞生长，后期培养液中加入神经生长因子促进许旺细胞生长能获取大量许旺细胞且纯度可达90%以上。②用3%Triton X-100作用96 h可去除周围神经中的细胞和髓鞘而保留完整的神经基底膜管和纤维支架结构，并且对神经基底膜主要成分－层粘连蛋白无明显影响。③采用胎兔坐骨神经培养的许旺细胞能在用成年兔坐骨神经制备的去细胞桥神经接体中生长良好，并且有迁移成行的特性。 结论：种植许旺细胞重新细胞化的去细胞同种异体神经将可能成为一种理想的组织工程化人工神经。     

兔颈内动脉瘤生长与动脉瘤壁平滑肌细胞的变化

目的 研究弹性蛋白酶诱导新西兰兔颈内动脉瘤壁平滑肌细胞(VSMC)表型和骨架蛋白表达的动态变化.方法 通过弹性蛋白酶诱导法建立兔颈内动脉瘤模型,分别于第1、2、3、4周取下实验动脉瘤标本行HE染色,RT-PCR检测瘤壁平滑肌细胞表型基因SM22α-mRNA表达,免疫组化及免疫荧光观察瘤壁PDGF、SMα-肌动蛋白、β-微管蛋白和结合蛋白骨架蛋白的表达.结果 实验动脉瘤随着不断生长瘤壁逐渐变薄,弹性纤维断裂,平滑肌细胞减少,SM22α-mRNA表达减少,PDGF表达增多,SMα-肌动蛋白、β-微管蛋白和结合蛋白骨架蛋白的表达减少,第4周未能检测出其表达.结论 动脉瘤的发生与VSMC表型由收缩型向合成型转化及骨架蛋白表达下调有关,因果关系有待进一步研究.     

酶消化及差速贴壁法原代培养新生C57小鼠耳蜗膜蜗管外侧壁成纤维细胞

背景：目前对耳蜗膜蜗管外侧壁成纤维细胞的培养没有特定的方法。 目的：采用酶消化与差速贴壁相结合的方法,原代培养新生C57小鼠膜蜗管外侧壁成纤维细胞,提供良好的体外细胞模型。 方法：显微解剖分离新生C57小鼠膜蜗管外侧壁组织,对膜蜗管外侧壁组织进行胰蛋白酶消化与差速贴壁相结合的方法培养成纤维细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,苏木精-伊红染色,绘制细胞生长曲线,免疫组织化学染色鉴别细胞来源。 结果与结论：膜蜗管外侧壁组织来源传代纯化的成纤维细胞呈梭形和三角形,生长曲线成S形,免疫组织化学检测波形蛋白,细胞胞浆中呈棕黄色阳性反应。结果证实培养出小鼠膜蜗管外侧壁成纤维细胞     

大鼠乳鼠和成鼠雪旺细胞提取纯化的对照研究*

背景：许旺细胞是神经创伤修复的种子细胞,获取大量高纯度、高活性许旺细胞是研究的关键。 目的：比较乳鼠和成年鼠许旺细胞的体外培养、纯化和形态学的差别,探讨简单可行的、可以获得高纯度许旺细胞的培养方法。 方法：出生1~3 d SD大鼠20只和成年大鼠10只(体质量150~200 g),实验按细胞的来源分为新生组和成年组。双酶分步消化,二次接种差速分离纯化细胞;倒置显微镜观察细胞形态、贴壁速度;细胞计数,纯度计算;MTT法检测细胞增殖能力,绘制两组许旺细胞的增殖曲线,判定增殖速度;S-100免疫化学法鉴定细胞。 结果与结论：乳鼠的许旺细胞贴壁速度快于成纤维细胞,成鼠的许旺细胞贴壁速度慢于成纤维细胞,两组许旺细胞纯度均达96%以上;MTT法检测两组许旺细胞增殖均活跃,由增殖曲线显示乳鼠许旺细胞增殖更快(P < 0.05);S-100免疫化学反应均呈阳性。提示双酶分步消化,二次接种差速分离纯化细胞,可以获取纯度高、活性良好的许旺细胞;乳鼠许旺细胞的增殖、贴壁能力更强。     

人正常神经组织许旺细胞的体外培养*

背景：周围神经组织工程所需要的许旺细胞数量巨大。在以往的研究中,由于正常人神经组织的缺乏,常选用大鼠、兔等动物神经组织分离许旺细胞进行培养,而作为异种细胞在临床的应用相对受限。 目的：体外培养人正常周围神经的许旺细胞,寻找一种最佳的获取、培养、纯化的方法。 方法：切取脑瘫患者周围神经缩窄术中的正常周围神经,以消化培养法为主,结合差速贴壁法纯化培养许旺细胞。将神经组织剪成碎块,接种于含胎牛血清、胶原酶、Dispase酶的培养液中消化培养,离心,将组织块加入培养基中,吹打成单细胞悬液,再移入有多聚赖氨酸的DMEM培养皿中,加入碱性成纤维细胞生长因子培养,当贴壁细胞覆盖培养皿达85%~90%即可开始传代培养。锥虫蓝染色对培养后的第 2,3,4,5,6,7,8,9,10天不同时间许旺细胞进行计数,并经S-100蛋白免疫组织化学染色鉴定计算细胞纯度。 结果与结论：4 d后镜下可见基本为纯净的许旺细胞,密度在0.5×108 L-1以上。传3代后,许旺细胞计数可达到9×108 L-1以上;许旺细胞纯度达85 %以上。结果表明,以消化培养法结合差速贴壁方法培养许旺细胞所需时间短,可获得较高纯度的人许旺细胞,能够为进一步的神经组织工程提供细胞来源。