超抗原SEB在同种异体细胞移植小鼠中诱导的免疫耐受及其特征

目的 探讨超抗原葡萄球菌肠毒素B（SEB）体内诱导的免疫耐受性及其特征。方法 采用MHC不同的两种小鼠进行淋巴细胞移植。用流式细胞术和混合淋巴细胞培养技术，检测受体鼠T细胞亚群的变化，供体鼠H－2K^d分子在受体鼠体内表达的阳性率与免疫应答性。结果 （1）注射SEB可选择性地降低CD4^ T细胞和CD4^ T/H-2K^b 细胞的百分率，而不影响CD8^ T细胞的数量。在SEB注射的21d，抑制作用最强，其对CD4^ T细胞和CD4^ T/H-2K^b 细胞的抑制率分别是6.24%和23.38%。（2）在进行异源性MHC淋巴细胞移植时注射SEB，于移植细胞后21d，受体小鼠肝脏淋巴细胞上开始表达供体小鼠H－2K^d分子，至移植后40d，表达率达到高峰7.90%。与此同时，受体鼠外周淋巴细胞对供体鼠淋巴细胞的免疫应答能力也明显降低。结论 SEB能诱导小鼠产生免疫耐受，免疫耐受的形成与受体鼠内CD4^ T细胞克隆的明显减少有关。     

抗CD4抗体对SEB诱导的PBMC增殖反应的抑制作用机理

目的：探讨抗CD4抗体在SEB诱导的外周血单个核细胞（PBMC）增殖择应中的作用机理。方法：采用MTT法,以SEB为刺激原,观测在不同条件诱导的BMC增殖反应中抗CD4抗体的作用。采用形态学、生物化学、流式细胞仪等方法,检测抗CD4抗体诱导的CD4^ T细胞凋亡。结果：抗CD4人-鼠嵌合抗体和鼠源性单抗对由SEB诱导的PBMC增殖均有抑制作用。嵌合抗体能特异性诱导CD4^ T细胞发生凋亡。结论：抗CD4抗体的增殖抑制作用能直接作用于TCR诱导的早期活化信号,嵌合抗体的抑制作用强度与单核细胞的存在密切相关,抗CD4嵌合抗体的进一步广泛交联是诱导凋亡的关键。     

SEB活化的人外周血T细胞CD25,CD69的表达

本文用超抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB)诱导外周血淋巴细胞增殖。结果显示出微量超抗原能诱导外周血淋巴细胞的增殖,大量的增殖反应发生在SEB刺激后的第5天,增殖的细胞是CD4~+T细胞,它们由刺激前的27％增加到42％。外周血活化的T细胞不依赖外源性IL-2:大量内源性IL-2的存在抑制T细胞的增殖反应。伴随CD4~+T细胞的增殖,CD25和CD69分子表达明显增加。提示SEB能改变外周血T细胞表面的分子表达。     

耐受性CD8~+ NKT细胞体外增殖能力的鉴定

目的:利用CFSE标记细胞,流式细胞术(FCM)检测法,解析超抗原SEB活化的耐受性CD8+ NKT细胞在体外增殖的情况。方法:利用CFSE标记新鲜分离的C57BL/J鼠脾细胞,分别与ConA和LPS共同培养3d,收集细胞进行荧光染色并用FCM解析细胞表面CD69分子的表达率和增殖能力。CFSE标记的鼠脾细胞与SEB共培养5d和10d后,荧光染色并用FCM解析细胞表面CD69的百分数和增殖能力。SEB活化的第10天细胞经CFSE标记后在IL-2的协同作用下继续培养10d,荧光染色,FCM解析这群细胞的增殖能力、活性分子CD69的表达率和NKT细胞亚群的变化情况。结果:ConA、LPS和SEB三者均可以刺激小鼠脾细胞增殖。ConA和LPS在3d内可以使细胞增殖3代,且CD69的表达率为74.19%和41.56%;SEB在5d和10d内分别可以使细胞增殖5代和7代,细胞表面CD69的表达率为32.09%和48.66%。SEB活化的10d细胞可以在IL-2的协同下继续传代培养10d,可以增殖7代;这群细胞中CD8+ NKT细胞亚群,由原始的0.36%增加到38.58%;细胞表面CD69分子由正常值的0.11%提高到83.74%。结论:超抗原SEB活化的CD8+ NKT细胞可以在体外进行增殖培养,且这些细胞是活性化的细胞。利用CFSE标记细胞,FCM可以检测耐受性CD8+ NKT细胞在体外的增殖水平。     

T细胞凋亡受体和共刺激分子的表达变化与终末期肾功能衰竭患者细胞免疫功能的关系研究

目的：探究终末期肾功能衰竭患者T细胞亚群的凋亡受体CD95分子与共刺激分子CD28、CDl52（CTLA-4）的表达与细胞免疫功能的关系。方法：采用流式细胞术检测外周血T细胞的凋亡受体CD95（Fas）与共刺激分子CD28／CDl52表达。结果：终末期肾功能衰竭患者CD3^＋T细胞和CD4^＋T细胞比例明显高于健康对照组，CD4／CD8比值增加（P=0．008），CD4^＋T细胞和CD8^＋T细胞上CD95分子表达均上调（P=0．001），以CD8^＋T细胞上CD95分子增加更为明显；CD28和CD152分子在不同T细胞亚群上的表达均上调（P〈0．05），然而，CD4^＋T细胞以CD28分子表达增加为主，而CD8^＋T细胞则CD152分子表达增加为主。结论：终末期肾功能衰竭患者的细胞亚群失衡，共刺激分子CD28和CD152表达异常增加，提示T细胞活化与抑制性调节发生紊乱。T细胞亚群上凋亡受体CD95分子表达增加，以CD8^＋T细胞为主，说明终末期肾功能衰竭者淋巴细胞的减少可能通过两种途径——受体配体途径和负性共刺激分子CD152抑制信号途径，其中以CD8^＋T细胞减少为主，造成患者细胞免疫缺陷。     

阻断共刺激通路诱导产生的无能细胞的抗原特异性免疫调节作用

目的：了解联合阻断B7-CD28和CD40-CD154通路诱导产生的小鼠免疫无能细胞的免疫调节特性和表型，以及是否具有抗原特异性。方法：Anti-CD154和anti-CD80单克隆抗体加入BALB／C(夏应细胞)和C3H(刺激细胞)的混合淋巴细胞培养(MLR)体系中诱导产生无能细胞。将无能细胞或对照细胞分别加入新的BALB／C和C3H的MLR体系中观察抑制效果。在反应细胞和刺激细胞／第三方刺激细胞(C57BL/6J)之间的MLR体系中加入无能细胞观察抗原特异性。无能细胞中加入刺激细胞或rmIL-2,观察无能细胞的逆转情况。通过流式细胞仪检测无能细胞的表型。结果：无能细胞对反应细胞和刺激细胞之间的MLR具有抑制作用，且呈剂量依赖关系。无能细胞对于反应细胞和第三方刺激细胞之间的MLR无抑制作用。C3H刺激细胞和rmIL-2共同刺激才能逆转无能细胞的无能状态。无能细胞中CD25^ CD4^ T细胞含量上升，而CD45RB^kwCD4^ 和CD28^-CD8^ T细胞含量无改变。结论：联合阻断B7-CD28和CD40-CD154通路诱导产生的小鼠免疫无能细胞具有抗原特异性的免疫调节功能，可以通过感染性耐受的方式抑制淋巴细胞的增殖。     

无血清培养体系中CD3AK细胞诱导HL—60细胞凋亡的研究

目的：采用无血清培养体系,研究CD3单克隆抗体激活的杀伤（CD3AK）细胞诱导HL－60细胞凋亡情况。方法：用血清代用品代替人血清培养CD3AK细胞,将诱导生成的CD3AK细胞与HL－60细胞共同孵育后,通过观察细胞形态、琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带及充式细胞仪（FCM）检测分析HL－60细胞凋亡情况。结果：与CD3AK细胞孵育7h后的HL－60细胞出现凋亡细胞形态特征,DNA凝胶电泳典型梯状电泳带,FCM检测凋亡细胞比例为24.59%。结论：无血清培养条件下CD3AK细胞可诱导HL－60细胞凋亡。     

超抗原SEB激活诱导CD4~+T细胞凋亡模型的建立

目的为了探讨超抗原活化诱导 CD4+ T淋巴细胞凋亡分子机理及其信号传导途径 ,有必要建立超抗原活化诱导 CD4+ T细胞凋亡模型。方法采用电镜观察细胞凋亡的形态学特征 ,借助流式细胞仪 PI染色观察细胞凋亡的光散射特征及亚二倍体核型峰特征 ,琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的 DNA片段化图谱 ,最后采用改进的二苯胺 (DPA)法定量分析细胞凋亡 DNA片段化百分率。结果 4μg/ m L SEB刺激静息的 SEB应答 CD4+ T细胞 12 h后 ,电镜下观察呈现典型的凋亡形态学特征 ;流式细胞仪 PI染色分析表明 ,在二倍体峰的左侧出现亚二倍体核型峰典型凋亡特征 ,在光散射图谱上呈现低于正常细胞的前向散射和高于正常细胞的侧向散射 ;琼脂糖凝胶电泳分析呈现典型的凋亡 DNA梯状图谱 ;DNA片段化百分率分析表明 ,超抗原 SEB活化诱导 CD4+ T细胞凋亡率的升高具有时间依赖性 ,添加 Fas- Ig融合蛋白能够特异性抑制凋亡 DNA片段化百分率的升高。结论超抗原 SEB活化诱导 CD4+ T细胞凋亡模型的建立 ,为进一步深入探讨超抗原活化诱导 T细胞死亡的分子机理和信号通路奠定了坚实基础     

正常人周围血初始和记忆T细胞亚群及细胞因子表达的探讨

目的：利用多色流式检测技术探讨初始和记忆T细胞亚群与细胞因子表达之间的关系。方法：自正常人静脉血中分离PBMC,经超抗原（SEB）刺激5h后,加入多种抗细胞表面标记和抗细胞因子抗体进行染色,利用流式细胞术检测,并利用Flow Jo软件分析结果。结果：根据CD45RO表达与否,将CD4^＋和CD8^＋T细胞分为初始和记忆T细胞,再根据归巢受体（CD62L）和趋化因子受体（CCR7）的表达与否,将初始和记忆T细胞进一步分为不同的亚群。当T细胞受到SEB激活后,CD45RO^＋和CD45RO^-的CD4^＋或CD8^＋T细胞均表达IL-2、IFN-γ和TNF-α。进一步分析结果表明,CD62L^hi和CD62L^hiCCR7^＋细胞不表达细胞因子,而CD62L^loCCR7^lo和CCR7^＋T细胞均表达细胞因子,其中CD62L^loCCR7^lo细胞表达细胞因子的阳性率明显高于CCR7^＋细胞亚群。结论：只利用CD45RO表达与否区分初始和记忆T细胞是不够准确的,同时检测CD62L的表达,可明显地提高其准确性。     

流式细胞术检测CFSE标记人T细胞亚群增殖反应

目的探讨应用流式细胞术和活细胞荧光染料CFSE检测T淋巴细胞各亚群增殖反应的方法学。方法人外周血单个核细胞（PBMC）经CFSE染色后,分别用植物凝血素（PHA）、CD3 mAb和结核杆菌抗原（Mtb-Ag）刺激,加IL-2扩增后,用流式细胞术检测活化增殖后T细胞各亚群的比例,并用ModFit软件分析各亚群的增殖动力模型。结果PHA和CD3 mAb主要活化总T细胞,CD8^＋T细胞的增殖优于CD4^＋T细胞,但CD4^＋T细胞前4代细胞明显多于CD8^＋T细胞。Mtb-Ag主要刺激γδT细胞增殖。结论以CFSE标记淋巴细胞,结合流式细胞术可有效检测出不同T细胞亚群对不同刺激剂的增殖反应以及增殖动力学变化。     

康莱特注射液对胃癌患者细胞凋亡、增殖及T细胞亚群的影响

目的：探讨康莱特对胃癌细胞凋亡对增殖及胃癌患者T细胞亚群的影响。方法：进展期胃癌患者30例，随机分为3组（每组各10例）：A组（对照组）：手术前后常规给予全胃肠外营养（total parenteral nutrition,TPN)治疗；B组（康莱特治疗组）：术前5d及术后9d，给予康莱特注射液200mL/d静脉滴入加常规TPN治疗；C组（化疗组）：术前给予5d化疗，甲酰四氢叶酸钙（calcium folinatefor,CF)200mg及5氟脲嘧啶（5－FU）750mg/d静脉滴注加常规TPN治疗。分别于治疗前及术后1d,5d及10d，采集外周静脉血，应用免疫荧光法检测CD3^ 、CD4^ 、CD8^ T细胞亚群。手术中取胃癌病理组织，用末端转移酶介导的dUTP切口末端标记法和免疫组织化学染色法检测胃癌细胞的凋亡（AI）与增殖（PI）及二者之比（AI／PI）。结果：B组与C组相比较，胃癌细胞的AI、PI及AI／PI，无显著差异（P＞0．05）；B组与A组相比较，上 3种指标则具有显著差异（P＜0．01）。治疗前3组CD3^ 、CD4^ 、CD8^ T细胞亚群的百分率无显著差异（P＞0．05）；术后1d,5d3组CD3^ 、CD4^ 、CD8^ T细胞亚群的百分率差异显著（P＜0．01）；术后10d,CD3^ 、CD4^ 、CD8^ T细胞亚群的百分率，B组与A组以及B组与C组相比较，差异性分别为显著（P＜0．05）及非常显著（P＜0．01）。结论：康莱特可明显促进胃癌细胞凋亡和抑制其增殖，有助于提高围手术期患者的免疫功能。     

雷帕霉素对同种移植耐受模型CD4+CD25+ T细胞活性的影响

目的：研究雷帕霉素（Rapa）对同种移植耐受个体CD4^＋CD25^＋ T细胞体内负免疫调节作用的影响.方法：建立同种皮肤移植模型, 受体鼠术前预输注供体鼠脾细胞, 术后给予环孢素A（CsA）进行耐受诱导.移植后第14天提取耐受诱导模型鼠的T细胞, 经不同浓度Rapa和/或IL-2体外处理后, 混合淋巴细胞反应（MLR）确定T细胞特异增殖水平;流式细胞术（FCM）检测CD4^＋CD25^＋ T细胞比例变化;RT-PCR检测Foxp3 mRNA表达情况;ELISA检测细胞培养不同时间后上清中IL-10的变化.然后将Rapa和/或IL-2处理的T细胞过继转移给同种移植后的BALB/c-SCID鼠, 观察移植物存活状态.结果：CsA加供体脾细胞预先注射可明显延长小鼠移植皮片的存活期（P＜0.05）;移植耐受状态的T细胞经Rapa和/或IL-2体外处理后CD4^＋CD25^＋ T细胞比例升高、增殖水平明显降低、 Foxp3表达量明显增加;过继转输给同种移植SCID鼠后, 其移植皮片存活时间显著延长（P＜0.05）.结论：Rapa可体外扩增耐受诱导模型中CD4^＋CD25^＋ T细胞, 使CD4^＋CD25^＋ T细胞相关的Foxp3和IL-10明显升高, 过继免疫后, 小鼠同种移植物存活时间明显延长, 而低浓度IL-2可以协同Rapa的这一作用.     

CD4+ CD25+调节性T细胞AICD机制的研究

目的探讨CD4^＋CD25^＋调节性T细胞活化诱导的细胞死亡（AICD）发生的机制。方法CD4^＋CD25^＋T细胞以磁性细胞分离器（MACS）从BALB／c小鼠或DO11．10小鼠的静息T细胞分离纯化。体外细胞增殖抑制实验证实其免疫调节作用。CD4^＋CD25^＋T细胞的AICD以CD3／CD28单克隆抗体活化或以特异性OVA323-339肽、抗原提呈细胞活化等两种方法获得。CD4^＋CD25^＋T细胞凋亡相关基因的表达通过实时定量PCR检测。流式细胞仪检测细胞的凋亡率。进一步观察FasL中和抗体、TRAIL中和抗体及caspase抑制剂zVAD-fmk对CD4^＋CD25^＋T细胞凋亡的影响。结果MACS成功分离CD4^＋CD25^＋T细胞，纯度可达98％，该细胞可特异性表达Foxp3基因，能明显抑制效应性T细胞的体外增殖。CD3／CD28抗体以及OVA特异性抗原活化8d的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞AICD达39％～45％。活化前后的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞死亡受体家族表达发生明显变化；FasL、TRAIL中和抗体及zVAD-fmk可明显抑制CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的凋亡。结论FasL／Fas及其他凋亡相关分子可能参与了CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的凋亡。     

休克期大面积切痂对严重烧伤大鼠细胞免疫功能影响的研究

目的 观察休克期大面积切痂对严重烧伤大鼠细胞免疫功能的影响，探索改善烧伤后机体免疫功能紊乱的有效方法。方法 将大鼠分成休克期切痂组（A组）、常规切痂组（B组）和正常对照组（C组）。A、B组造成30％TBSAⅢ度烫伤，C组不烫伤。A组伤后第6h、B组伤后第4d切痂，并于伤后第1、5、9d各活杀10只，取材送检，观察其免疫指标的变化。结果 （1）A、B组与C组比较：A、B组烫伤大鼠各时相点CD3^＋T细胞变化不大（P〉0．05），但CD4^＋T细胞、CD4^＋／CD8^＋比值明显下降、CD8^＋T细胞增高（P〈0．05或P〈0．01）。NK细胞活性明显下降（P〈0．05或P〈0.01），外周血CD25^＋T淋巴细胞表达及经活化后脾脏CD25^＋T淋巴细胞表达明显下降（P〈0．05或P〈0．01）。（2）A组与B组比较：A组CD4^＋T细胞、CD4^＋／CD8^＋比值明显升高、CD8^＋T细胞降低（P〈0．05或P〈0．01），NK细胞活性明显升高（P〈0．05或P〈0．01），外周血CD25^＋T淋巴细胞表达及经活化后脾脏CD25^＋T淋巴细胞表达均明显升高（P〈0．05或P〈0．01）。结论 （1）大鼠烫伤后细胞免疫状况发生了明显变化。（2）休克期切痂可以改善烫伤大鼠T淋巴细胞亚群分布，提高NK细胞活性，增加外周血CD25^＋T淋巴细胞的表达。提高经活化后脾脏CD25^＋T淋巴细胞数。从而改善烫伤大鼠伤后机体的细胞免疫功能。     

CD4+CD25+调节性T细胞的生物学特性及功能

对自身抗原产生免疫耐受是防止发生自身免疫病的关键。自1995年日本学者Sakaguchi等首次报道CD4^＋CD25^＋调节性T（Treg）细胞以来，越来越多的研究证明这群T细胞在自身耐受的维持中发挥着重要的作用。CD4^＋CD25^＋调节性T细胞具有以下特点：①自身免疫防御作用；②自然条件下是处于无能（Anergy）状态；③抑制其他CD4^＋T细胞和CD8^＋T细胞的生物活性；④抑制活性是抗原非特异性的；⑤抑制方法可能通过细胞与细胞间直接接触，或经分泌抑制性细胞因子发挥免疫抑制效应；     

CD40配基化的肿瘤特异性树突状细胞介导Th1细胞分化的研究

目的：探讨CD40配基化的肿瘤特异性DCs在介导Th1细胞分化中的作用。方法：采用GM-CSF和IL-4联合方案体外诱导小鼠髓系DCs，并利用mCD40L-CHO和TNF-α分别刺激凋亡肿瘤细胞负载的DCs制备DCs瘤莆；^3H-TdR掺入试验检测DCs对T淋巴细胞的促增殖效应；ELISA测定细胞培养上清中IL-10、IFN-1、IL-12的含量；胞内染色和流式细胞术检测经成熟DCs活化的T细胞中CD4^＋IFN-γ^＋T和CD4^＋IL-4^＋T的比例。结果：体外刺激T细胞增殖能力在CD40配基化DCs组最高（P〈0．05），CD40配基化DCs能更有效地促进活化T细胞分泌IFN-γ和介导CD4^＋IFN-γ^＋T细胞的分化（P〈0．05）。同时，CD40配基化DCs分泌IL-12的量也明显高于TNF-α组（P〈0．05）。结论：CD40配基化的肿瘤特异性DCs体外能有效介导Th1细胞的分化。     

T细胞疫苗诱导异种特异性免疫耐受的作用探讨

目的：探讨T细胞疫苗诱导异种特异性免疫耐受的作用。方法：制备SD大鼠针对脉鼠的T细胞疫苗(TCV)，然后用T细胞疫苗免疫正常SD大鼠，连续3周，每周1次，同时设空白对照组。以被免疫SD大鼠的脾细胞作为反应细胞，以豚鼠的脾细胞作为刺激细胞(经丝裂霉素处理)，于接种前和每次接种后第5天进行单向混合淋巴细胞反应(MLR)，同时对外周血T细胞凋亡和CD4^ 、CD8^ T细胞亚群进行检测。结果：MLR及结果显示，在TCV组，SD大鼠的脾细胞反应程度比接种前显著减弱(P＜0．01)，接种后相同时点组间比较，TCV组显著低于对照组(P＜0．01)；接种T细胞疫苗后，外周血T细胞凋亡率比接种前显著增加(P＜0．01)，并随着接种次数的增加而升高；随着接种T细胞疫苗次数的增加，CD/CD8逐渐减小，与MLR及的cpm值的递减趋势一致。结论：T细胞疫苗成功地诱导出异种特异性免疫耐受。T细胞疫苗可能通过诱导抗原特异性的反应性T细胞凋亡去除独特型T细胞克隆，进而诱导出抗原特异性免疫耐受；CD4/CD8与免疫耐受的产生有关，CD4/CD8降低有利于特异性免疫耐受的形成。     

CD4^＋CD25^＋T细胞：一类新被认识的免疫调节细胞

CD4^ CD25^ T细胞是最近才被认识的一类免疫调节细胞，在胸腺产生，主要发挥抑制性免疫调节功能，表达IL-10mRNA，细胞表面表达IL-2受体α链(CD25)，本身不产生IL-2，但在体内、外增殖需要外源性IL-2，在体外为无能细胞(anergy cell)，CD4^ CD25^ T细胞发挥免疫抑制作用是通过细胞-细胞接触依赖方式而非细胞因子依赖方式，CD4^ CD25^ T细胞在调控自身免疫性疾病的发生、炎症反应和T细胞稳态中发挥重要作用。本文拟对CD4^ CD25^ T细胞的生物学特性及其应用研究的最新进展作一综述。     

重组FoxP3腺相关病毒转染小鼠CD4+CD25 -T细胞的实验研究

目的：研究FoxP3（Forkhead Box P3）基因在小鼠T细胞的表达情况，以及重组FoxP3腺相关病毒（adeno-associatedvirus，AAV）对小鼠CD4^＋CD25^-T细胞功能的影响。方法：采用实时定量PCR检测CD4^＋CD25^-T细胞和CD4^＋CD25^-T细胞FoxP3 mRNA表达情况，利用基因重组技术构建FoxP3腺相关病毒载体，体外转染CD4^＋CD25^-T细胞，通过细胞增殖试验观察转染CD4^＋CD25^-T细胞功能变化。结果：CD4^＋CD25^-T细胞较CD4^＋CD25^-T相比高水平表达FoxP3基因mRNA，重组FoxP3腺相关病毒转染后的CD4^＋CD25^-T细胞对CD3单抗的刺激呈低反应性，并且能抑制新鲜分离CD4^＋CD25^-T细胞的增殖。结论：FoxP3基因转染的CD4^＋CD25^-T细胞在体外具有抑制T细胞活化增殖的功能。     

献血员CD8~+T细胞的增加对CD4~+T细胞的抑制作用

实验发现 6 5 %体检合格的献血员外周血CD8+T细胞数量明显增加 ,并伴随CD16 +淋巴细胞数量的增加。这些异常的淋巴细胞与葡萄球菌肠毒素B (SEB )共同培养 6d ,CD4+T细胞无增殖反应。预先用抗CD8抗体去除CD8+T细胞 (去除率 >90 % )再用SEB刺激淋巴细胞 ,其应答能力恢复正常。增殖的细胞是CD4+T细胞 ,它们由 34 0 4%增加到 99 34%。CD8+T细胞由最初的 9 5 7%降低到 0 12 %。这些结果显示过量的CD8+T细胞有可能是被外原性抗原活化的T细胞。它们直接抑制CD4+T细胞对SEB的免疫应答反应 ,但不破坏CD4+T细胞的TCRVβ结构。