猪链球菌2型中国强毒株CovR重组蛋白及其抗体的制备

目的通过构建pET32a-covR原核表达质粒,表达并提纯CovR重组蛋白,制备其多克隆抗体。方法采用PCR法,从四川资阳病人分离株05ZYH33基因组扩增CovR的编码基因covR,构建重组表达质粒pET32a-covR,转化E.coliBL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE鉴定后,His亲和层析柱纯化CovR重组蛋白;免疫新西兰兔制备特异性抗体,Western blot检测兔多抗血清的特异性,间接ELISA检测其滴度。结果covR基因在原核细胞中得到高效表达,重组蛋白免疫新西兰兔后血清效价高达1∶204800,且重组蛋白能够与之发生特异性的反应。结论成功构建了表达载体pET32a-covR,可在E.coliBL21中高效表达,制备了特异性抗体,为进一步研究CovR的调控机理奠定了基础。     

2型猪链球菌中国强毒株及其covR基因突变株的蛋白质组学研究

目的 通过比较2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33及其covR基因突变株△covR蛋白表达谱差异,质谱鉴定差异表达蛋白,分析CovR在蛋白表达调控中的作用。方法 首先将05ZYH33和△covR在THB培养基中培养至对数期,然后裂解细菌制备蛋白样品。第一向等电聚焦电泳在pH3~10的IPG胶条上完成后进行SDS-PAGE电泳,电泳胶经扫描分析后选取蛋白点进行质谱鉴定。结果 05ZYH33和△covR全菌蛋白裂解液经二维电泳分别得到559和491个蛋白点,经比对发现两菌株蛋白表达量差异3倍以上蛋白点40个,经质谱鉴定出15个蛋白,主要涉及细胞代谢的酶类如谷氨酸脱氢酶、腺苷酸激酶、PTS系统成分等,以及分子伴侣蛋白如GroEL和Dnak等;电泳分离得到△covR特异蛋白点124个,质谱鉴定出15个,主要为参与细胞糖代谢过程中的酶,如磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶等;质谱鉴定05ZYH33特异表达蛋白5个。结论 鉴定05ZYH33和△covR差异表达蛋白35个,部分蛋白涉及细菌毒力、宿主细胞粘附、细胞分裂等生命过程,同时蛋白分子伴侣在△covR中的表达变化说明CovR的调控可能发生在蛋白修饰水平,为研究CovR在调控细菌毒力中的作用和分子机制奠定基础。     

2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶对细菌生物学特性的影响

猪链球菌是一种重要的人兽共患病病原菌,有33个血清型[1].2型猪链球菌致病力最强,可引起脑膜炎、关节炎、败血症等[2].信号转导系统对细菌应对外界复杂的环境变化有着重要的作用.本课题组前期在对2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组测序的研究中发现和真核生物同源的丝氨酸/苏氨酸激酶stk,利用同源重组原理成功构建了stk基因敲除突变株[3],本文进一步研究stk缺失后细菌生物学特性的变化.     

2型猪链球菌Rgg调控因子的序列结构分析及原核表达

目的 克隆2 型猪链球菌Rgg转录调控因子编码基因并进行原核表达和纯化,并对其进行生物信息学分析和结构预测.方法 PCR扩增2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组的rgg基因,构建重组表达质粒pQE30-rgg,转化大肠杆菌M15,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE 鉴定表达产物;确定最佳诱导条件后,大量培养诱导重组表达菌,Ni²⁺亲和层析柱纯化重组蛋白,非变性PAGE电泳分析其体外聚合状态.结果 整个Rgg蛋白由15个α螺旋和2个β转角组成;构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,15 ℃过夜诱导获得可溶性重组蛋白的比例最高;获得了较高纯度的Rgg重组蛋白,并证实其在体外可形成同源二聚体.结论 成功地原核表达并纯化了Rgg重组蛋白,证明它存在二聚体结构,为进一步研究其调控机制奠定了基础.     

检测猪链球菌2型胞外因子（EF）的PCR方法的建立

根据猪链球菌2型的ef基因和ef^*基因合成了一对可扩增长度为626bp目的片段的引物,成功地建立了检测胞外因子（EF）的PCR方法。用HaeⅡ内切酶进行酶切,获得了与预期一致的354bp和272bp的两个片段,并进行了PCR的牧民性试验和敏感性试验。对马腺疫链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌和猪肺炎霉形体的PCR检测结果均呈阴性;检测的敏感度可达100个细菌。另外,对9株猪链球菌2型菌株进行了检测,7株呈EF阳性,1株呈EF^*阳性,1株呈EF阴性;对15份正常屠宰猪扁桃体分离物的检测结果1份为阳性。实验结果表明此法特异性和敏感性很高,可作为EF快速诊断和流行病学调查的手段。     

猪链球菌2型毒力因子部分片段的克隆与表达

根据猪链球菌2型(Streptococcussuistype2)胞外蛋白因子(extracellularfactorprotein,EF)的基因(epf)序列,设计合成一对引物,以猪链球菌2型江苏分离株SS2-H的基因组为模板,扩增epf基因1585-2547位序列,进行T/A克隆,转化入宿主菌DH5α中。提取阳性克隆质粒进行双酶切并纯化,将目的片段向克隆到表达载体pET-32a中组氨酸的下游,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导可表达分子量约为53000的融合蛋白。免疫转印分析表明,该融合蛋白具有EF的抗原表位。     

2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C基因过表达株的构建

目的 构建2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C基因过表达株,为cps2C基因功能研究提供实验材料。方法 使用重叠延伸PCR技术将延伸因子TufA(又名EF-Tu,编码基因为SSU05＿0530)的启动子(命名为P0530)与cps2C基因连接为P0530cps2C片段,将P0530cps2C酶切后连接至猪链球菌-大肠埃希菌穿梭质粒pSET2,构建过表达质粒pSET2::P0530cps2C。将pSET2::P0530cps2C电转化导入S.suis 2野生毒株05ZYH33感受态细胞,抗性及组合PCR筛选得到cps2C过表达株。qRT-PCR检测过表达株cps2C基因的转录水平。结果 重叠延伸PCR成功将P0530启动子片段(300 bp)和cps2C基因片段(696 bp)拼接为P0530cps2C(996 bp),片段及载体经BamH I和EcoR I酶切后连接,成功构建出过表达质粒pSET2::P0530cps2C;将pSET2::P0530cps2C电转化导入S.suis 2 05ZYH33感受态细胞,抗性筛选及组合PCR检测结果显示cps2C过表达株构建成功。提取野生株05ZYH...     

2型猪链球菌人源致病株07NJH06的分离和病原生物学鉴定

目的系统分析鉴定南京地区脑膜炎型猪链球菌感染病人脑脊液分离株07NJH06病原生物学特性。方法采集患者脑脊液,进行细菌分离和培养,观察菌体显微形态,通过免疫凝集试验和PCR方法对分离物进行种属鉴定及毒力因子基因携带情况分析,纸片法测定菌株药物敏感性,采用小白鼠和仔猪模型评估分离菌株的致病特性。结果从病人脑脊液分离到1株革兰阳性链球菌,经免疫学、生物化学及分子生物学方法系统鉴定为2型猪链球菌（命名为07NJH06）,毒力基因型为cps2J＋mrp＋epf＋sly＋gdh＋fbp＋srtA＋,未获得含有完整毒力岛PAI89k的证据,该岛两侧边缘反向重复区靶基因以及岛内二元调控系统SalK/SalR均未检出,但针对岛内3个独立的镶嵌结构区代表基因进行扩增,其中2个结构区代表基因（05SSU0942和05SSU0965）得到特异性扩增;药敏试验显示,07NJH06株对青霉素、万古霉素等抗生素敏感,对四环素、头孢噻肟钠等抗生素耐药;动物感染试验显示,07NJH06株对小鼠和猪仔有致病性,毒力较国内暴发流行强致病株05ZYH33弱,与国际参考株毒力相当。结论07NJH06株为致病性2型猪链球菌,基本生物学特性、主要毒力基因型与既往国内暴发现场分离株相似,但不含有完整的毒力岛PAI89k基因结构,系统掌握该菌遗传信息对于阐明国内强毒株遗传进化规律有重要价值。     

应用多重荧光Real-time PCR快速鉴定猪链球菌2型

目的建立能同时鉴定链球菌2型(S.suis2)和确定主要毒力标志MRP的快速检测方法。方法根据S.suis2CPS2J与MRP的保守序列,设计并合成了2对引物及其相应探针。通过优化各反应物的浓度、配比和循环程序,建立能从组织中直接检测CPS2J和MRP的实时荧光PCR方法。结果能在3h内对送检组织样品检测确定S.suis2型和MRP毒力基因,最低检测菌体浓度24CFU/ml。与普通PCR相比,敏感性在检测CPS2J时比普通PCR高至少10倍以上,而在检测MRP时比其高100倍。与葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、S.suis1型、9型等无交叉反应。同一人在试剂放置0d、20d和60d检测,以及不同人用同一方法检测,变异系数均小于5%,差异不显著。用于检测SSsc0501攻毒后的样品,结果在心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、脑中均检测到S.suis2阳性,MRP阳性。而在肌肉中,S.suis2和MRP均为阴性。结论建立的多重荧光Real-timePCR敏感性高、特异性强,稳定性和重复性好,能用于可疑S.suis2型组织样品的快速定型和毒力鉴定。     

2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C基因过表达株的构建北大核心CSCD

目的构建2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C基因过表达株,为cps2C基因功能研究提供实验材料。方法使用重叠延伸PCR技术将延伸因子TufA(又名EF-Tu,编码基因为SSU05_0530)的启动子(命名为P0530)与cps2C基因连接为P0530cps2C片段,将P0530cps2C酶切后连接至猪链球菌-大肠埃希菌穿梭质粒pSET2,构建过表达质粒pSET2::P0530cps2C。将pSET2::P0530cps2C电转化导入S.suis 2野生毒株05ZYH33感受态细胞,抗性及组合PCR筛选得到cps2C过表达株。qRT-PCR检测过表达株cps2C基因的转录水平。结果重叠延伸PCR成功将P0530启动子片段(300 bp)和cps2C基因片段(696 bp)拼接为P0530cps2C(996 bp),片段及载体经BamH I和EcoR I酶切后连接,成功构建出过表达质粒pSET2::P0530cps2C;将pSET2::P0530cps2C电转化导入S.suis 205ZYH33感受态细胞,抗性筛选及组合PCR检测结果显示cps2C过表达株构建成功。提取野生株05ZYH33和cps2C过表达株总RNA后进行qRT-PCR实验,结果显示过表达株cps2C基因的相对表达水平较05ZYH33株上调2.4倍。结论本研究选用S.suis 205ZYH33的延伸因子TufA强启动子P0530作为启动子,成功构建过表达质粒pSET2::P0530cps2C并导入S.suis 2感受态细胞,成功获得cps2C过表达株,为进一步研究酪氨酸激酶Cps2C功能提供实验材料。     

猪链球菌2型新基因岛SSGI4的发现

目的通过比较猪链球菌2型强毒株与弱毒株和无毒株的基因组差异,发现新的基因岛,探讨猪链球菌的基因群水平转移及其与致病性之间的关系。方法在已知猪链球菌2型强毒株全基因组序列和对可能基因岛的分析基础上,通过DNA测序和生物信息学分析,对基因岛的结构进行分析鉴定,并预测其功能。结果发现了一个只存在于猪链球菌2型中国强毒株,而在弱毒株和无毒株中整体缺失的新基因岛,命名为SSGI4。基因岛全长11 269bp,G+C含量(36.8%)明显低于基因组总G+C含量(41.1%),基因岛两端均有10bp的正向重复序列,并且末端携带有噬菌体整合酶基因,显示很可能是通过溶原性噬菌体整合入基因组。基因岛包含11个编码基因,部分基因推测为可能的膜表面蛋白基因或氨基酸结合蛋白基因。结论新发现的基因岛SSGI4具有致病性基因岛的各项典型特征,可能与猪链球菌2型强毒株的致病性有关,具有深入研究的价值。     

2型猪链球菌FtsZ重组蛋白的制备及其酶活性测定

目的制备2型猪链球菌丝状温度敏感蛋白(Filamentous temperature-sensitive protein Z,FtsZ)重组蛋白并测定其水解三磷酸鸟苷(GTP)的酶活性。方法从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组中PCR扩增目的基因ftsz,构建重组表达质粒pET28a-ftsz,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,Ni 2+亲和层析柱纯化重组蛋白,Western blot分析。重组蛋白免疫新西兰兔后收集多抗血清,间接ELISA法检测抗体效价,用孔雀绿-磷酸检测法测定FtsZ重组蛋白的GTP酶活性。结果成功构建pET28a-ftsz重组表达质粒;纯化获得大量纯度较高的FtsZ重组蛋白;ELISA检测兔多抗血清效价达1∶13 107 200;Western blot显示FtsZ重组蛋白能够与His-Tag单抗和兔多抗血清发生反应;以GTP为底物检测重组蛋白具有GTP酶活性。结论成功制备了具有GTP酶活性的2型猪链球菌FtsZ重组蛋白并以重组蛋白为抗原制备出高效价的多抗血清,为进一步研究2型猪链球菌FtsZ在细胞分裂调控过程中的作用奠定基础。     

浙江省9株猪链球菌2型分离株Cps2J全基因克隆与序列分析

目的了解浙江猪链球菌2型(SS2)分离株的分子基础及与国内外其他分离株的基因差异程度,确定Cps2J基因变异位点和频率,为该地区的猪链球菌防治提供科学依据。方法提取菌株DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增菌株Cps2J基因全片段,克隆入质粒载体,纯化后采用ABI自动测序仪测定序列,并同国内外其他分离株的基因进行比较。结果扩增出9株菌株的Cps2J基因的完整开放阅读框(ORF)都为999bp,编码333个氨基酸,9株菌株Cps2J片段核苷酸高度同源,同源性在99.7%～100%;与国内外其他的SS2核苷酸的同源性为98.8%～99.0%,与猪链球菌1型的同源性只有56.8%～57.0%。结论9株浙江省猪链球菌2型分离株Cps2J基因序列非常保守,这些不同来源的菌株可能有相同的起源。     

2型猪链球菌cps2D基因敲除株的构建及其基本生物学特性的研究北大核心CSCD

目的构建2型猪链球菌荚膜多糖基因簇中cps2D基因敲除株(Δcps2D),比较野毒株05ZYH33与敲除株Δcps2D基本生物学特性的差异。方法设计合成引物L1/L2、R1/R2、Spc1/Spc2,分别扩增cps2D基因上、下游同源臂L片段、R片段及Spc^(R)抗性基因S片段,将3个片段连接至pUC19线性载体上,构建敲除质粒pUC19::cps2D。将敲除质粒电转导入05ZYH33感受态细胞后,利用Spc^(R)抗性平板筛选敲除株,并通过组合PCR和RT-PCR进一步验证。比较野毒株05ZYH33和敲除株Δcps2D细菌生长特性、溶血活性、革兰染色、细菌链长、荚膜形态等方面的异同。结果L1/L2、R1/R2、Spc1/Spc2三组引物分别扩增出L(1030 bp)、R(1030 bp)以及S(1130 bp)基因片段;通过无缝克隆的方法成功构建出敲除质粒pUC19::cps2D;电转入感受态细胞后获得69个克隆,筛选出26个疑似敲除株;组合PCR以及RT-PCR筛选后获得cps2D基因敲除株Δcps2D;与野毒株05ZYH33相比,Δcps2D对数期生长变缓,链长显著变短,荚膜稀疏变薄。结论成功构建cps2D基因敲除株,为后续进一步研究其调控荚膜合成的作用机制奠定基础。     

2型猪链球菌荚膜唾液酸合成相关基因neuC敲除突变株的构建及其生物学特性

目的探索荚膜多糖合成基因neuC与细菌唾液酸合成转化的关系。方法应用同源重组基因敲除方法构建筛选2型猪链球菌(SS2)强毒株05ZYH33荚膜多糖组分唾液酸合成相关基因neuC的缺失突变株;系统比较分析突变体与野生株的基本生物学特性的差异,小鼠和仔猪毒力试验分析neuC基因缺失对细菌毒力的影响。结果应用PCR检测和Southern杂交分析显示,neuC基因在2株转化重组体中被壮观霉素抗性基因所替代,表明neuC基因敲除突变体构建成功;突变体△neuC与野生株在菌落形态、染色特性和溶血活性方面无明显差异;突变体与2型特异性抗血清的凝集反应显著减弱;电镜观察显示突变体表面荚膜结构较野生株荚膜显著变薄,直径20～55nm,但质地更致密;小鼠和仔猪毒力试验显示,突变体毒力显著减弱。结论neuC是SS2荚膜多糖合成的重要结构基因,与细菌唾液酸的转化利用密切相关;neuC基因可能藉其在唾液酸转化中的作用影响SS2的基本生物学特性和细菌的侵袭致病能力。     

猪链球菌2型四川株溶血素主要抗原决定簇基因的克隆及表达

目的研究有效的猪链球菌病疫苗。方法采用PCR方法,以四川株、参考菌株和江苏分离株猪链球菌2型基因组DNA为模板扩增溶血素基因,克隆至PMD18-T载体。提取阳性质粒,进行PCR和酶切鉴定。经测序正确后,构建原核表达载体pET32a-SLY,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG进行诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量约为43ku的重组蛋白,表达产物经纯化后,免疫印迹法（Western-blotting）分析证实,该重组蛋白与SS2-6阳性血清发生特异性反应。结论本实验旨在通过对溶血素主要抗原决定簇基因的克隆表达,分析表达产物的抗原性和免疫原性,为进一步对猪链球菌2型疫苗共表达的研制奠定基础。