自噬在吉西他滨诱导肺癌细胞A549凋亡中的作用及其相关机制

  目的  研究自噬对吉西他滨(gemcitabine, GEM)诱导的肺癌细胞A549凋亡的影响并探讨其可能机制。  方法  MDC染色后采用荧光显微镜对自噬进行形态观察; 以CCK8检测3-MA抑制自噬前后经吉西他滨诱导的A549细胞存活率; RT-PCR检测自噬相关基因Beclin-1表达的变化。Western blot分别检测自噬相关性蛋白Beclin-l及凋亡活化蛋白Caspase-3的变化。  结果  吉西他滨可诱导肺癌细胞A549产生自噬, 自噬在基因及蛋白水平表达均增加; 3-MA和吉西他滨联合用药可增强肺癌A549细胞凋亡。  结论  吉西他滨诱导肺癌细胞A549凋亡的过程中自噬可能起到保护作用, 3-MA特异性抑制自噬后可增强吉西他滨诱导的A549细胞凋亡。      

广藿香酮通过JNK/c-Jun信号通路调控肺癌A549细胞凋亡及自噬

目的 探讨广藿香酮对肺癌A549细胞增殖、凋亡、自噬和JNK/c-Jun信号通路的影响。方法 采用0、10、20、40μmol/L广藿香酮处理肺癌A549细胞，将细胞随机分为4组：0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L广藿香酮处理组，同时将5μmol/L顺铂处理后的肺癌A549细胞作为阳性对照组。EdU染色检测细胞增殖；Hoechst 33258染色检测细胞凋亡；Western blotting检测LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin-1、p62、JNK、p-JNK、c-Jun和p-c-Jun蛋白表达。10μmol/L JNK抑制剂SP600125与40μmol/L广藿香酮共处理A549细胞2 h及24 h,检测细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达。结果 与广藿香酮0μmol/L组比较，广藿香酮20、40μmol/L组EdU阳性细胞数降低，细胞凋亡率升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达升高，p62蛋白表达降低，LC3⁺含量升高，p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun比值升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与对...     

miR-21靶向Atg5对非小细胞肺癌A549细胞自噬调控促进细胞增殖、迁移和侵袭的实验研究

目的  探讨miR-21通过靶向作用自噬相关靶基因5（Atg5）调控非小细胞肺癌（NSCLC）自噬的作用机制及其在A549细胞增殖、迁移及侵袭中的作用。方法  无义核酸序列NC（NC组）、miR-21 模拟物（miR-21 mimics组）、miR-21抑制物（miR-21 抑制组）分别转染A549细胞, CCK-8检测细胞增殖情况;划痕实验检测细胞迁移能力; Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。双荧光素酶报告实验验证miR-21和Atg5之间的靶向关系。Western blotting检测LC3B-II、p62和Atg5蛋白的表达。结果  与NC组比较,miR-21 mimics组细胞增殖、迁移、侵袭能力均上调,miR-21 抑制组细胞增殖、迁移、侵袭能力均下调（P＜0.05）。双荧光素酶报告实验结果显示,miR-21显著抑制野生型Atg5 3’-UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性（P＜0.05）,但对突变型Atg5 3’-UTR的基因报告质粒与miR-21 mimics共转染之后,并未对荧光素酶活性产生影响。NC组LC3B-II蛋白表达量为1.24±0.059,低于miR-21 mimics组的1.98±0.077,高于miR-21抑制组的0.52±0.021（P＜0.05）;NC组p62蛋白表达量为0.62±0.021,高于miR-21 mimics组的0.45±0.020,低于miR-21抑制组的0.79±0.031（P＜0.05）;NC组Atg5蛋白表达量为1.17±0.025,高于miR-21 mimics组的0.38±0.014,低于miR-21抑制组的1.40±0.039（P＜0.05）。与NC组比较, 3-MA处理降低miR-21 mimics转染诱导的A549细胞增殖能力（P＜0.05）;划痕实验和Transwell实验表明,3-MA处理抑制了miR-21mimics转染诱导的A549细胞的迁移和侵袭,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论  miR-21靶向Atg5调控NSCLC自噬促进细胞增殖、迁移和侵袭。     

HAI-1对肾细胞癌细胞自噬及凋亡调控的初步研究

摘 要：［目的］ 研究肝细胞生长因子激活因子1型抑制因子（hepatocyte growth factor activator inhibitor type 1,HAI-1）对肾细胞癌细胞自噬和凋亡的影响,探讨其发挥作用的可能机制。［方法］ QRT-PCR检测HAI-1在肾细胞癌组织和细胞系中的表达水平,选择低表达的肾细胞癌细胞系进行HAI-1过表达质粒的转染,分为对照组（NC组）和过表达质粒组（OE-HAI-1组）。QRT-PCR检测NC组和OE-HAI-1组细胞中HAI-1的表达水平;MTS实验检测NC组和OE-HAI-1组细胞的增殖率;Western blot法检测HAI-1对肾细胞癌细胞中自噬相关蛋白表达水平的影响;流式细胞仪检测NC组和OE-HAI-1组细胞凋亡率;Western blot法检测NC组和OE-HAI-1组细胞中caspase3、Bax和Bcl-2蛋白的表达水平。［结果］ QRT-PCR结果显示HAI-1在肾细胞癌组织中的表达低于其在癌旁组织中的表达,HAI-1在肾细胞癌细胞系ACHN、786-O和A-498中的表达低于其在肾小管上皮细胞HK-2中的表达（P＜0.05）。选择HAI-1表达最低的肾细胞癌细胞系786-O转染HAI-1过表达质粒,qRT-PCR结果显示OE-HAI-1组细胞中HAI-1的表达增加（P＜0.05）;与NC组相比,OE-HAI-1组786-O细胞增殖能力下降。与NC组比较,OE-HAI-1组和加入自噬激活剂Rapamycin的OE-HAI-1+Rapamycin组细胞中Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表达降低,LC3-Ⅰ蛋白表达增加。与OE-HAI-1组相比,OE-HAI-1+Rapamycin组Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表达增加,LC3-Ⅰ蛋白表达降低。与NC组相比,OE-HAI组细胞凋亡增加,细胞中caspase3和Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白的表达降低。［结论］ HAI-1在肾细胞癌组织和细胞系中表达降低,并促进肾细胞癌细胞自噬和凋亡的发生。HAI-1可能是治疗肾细胞癌的候选分子靶标。     

苦参碱可能通过自噬抑制肺癌A549细胞的增殖

目的:探究苦参碱对肺癌A549细胞的增殖抑制作用及其对自噬的影响。方法:体外培养肺癌A549细胞,分别用不同浓度的苦参碱处理后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率;倒置显微镜下观察不同浓度苦参碱时A549细胞的形态变化;采用细胞克隆实验检测不同浓度的苦参碱对A549细胞的增殖抑制程度;Western blot 检测自噬相关蛋白Beclin1、p62及LC3A/B的表达水平;透射电镜下观察经苦参碱处理后A549细胞内自噬泡的变化。结果:苦参碱对肺癌A549细胞有明显的抑制作用,并且呈剂量依赖性;倒置显微镜下发现经苦参碱处理后肺癌A549细胞皱缩、变小、胞内可见大小不一的颗粒状物质;随着苦参碱浓度的增加,肺癌A549细胞形成的克隆集落逐渐变小、变少;Western blot 检测自噬相关蛋白Beclin1、p62及LC3A/B的水平均随着苦参碱浓度的增加而增加,并呈剂量依赖性;透射电镜下观察到苦参碱处理的肺癌A549细胞内自噬空泡明显增加,并且可观察到吞噬线粒体的自噬泡。结论:苦参碱可抑制肺癌A549细胞的增殖,并能诱导细胞内自噬的发生及损伤自噬降解通路,因此我们推测苦参碱可能通过自噬造成细胞内物质和能量的循环紊乱从而抑制肺癌A549细胞的增殖。     

细胞自噬与非小细胞肺癌关系的研究进展

细胞自噬是细胞重要的基本代谢过程之一,经常作为非小细胞肺癌的治疗靶点。细胞自噬一方面可以通过维持细胞内基因组的稳定、清除促癌因子、促进细胞程序性死亡、参与免疫反应和支持干细胞维持等多种途径抑制癌细胞的产生,另一方面又可以为癌细胞提供营养物质以支持其生长和迁移并使其产生对放化疗的抗性。因此,厘清自噬与非小细胞肺癌发生发展之间的具体联系,不仅可以更加有针对性地制定治疗策略,也可以为开发新的治疗策略提供思路。全文结合最新的研究成果,对细胞自噬和非小细胞肺癌的关系作一综述。     

自噬与非小细胞肺癌治疗研究进展

非小细胞肺癌是一种最常见的肺癌类型,主要治疗方式有放疗、化疗、手术治疗和靶向治疗.自噬是真核细胞内一种程序性死亡降解过程,维持细胞稳态,并且与肿瘤发生、发展及耐药密切相关.自噬对肿瘤的治疗存在双重作用.本文就自噬在非小细胞肺癌治疗中的作用进行综述.     

自噬基因Beclin1对宫颈癌HeLa细胞生长影响的体内外研究

目的 研究自噬基因Beclin1在宫颈癌细胞株HeLa中过表达对HeLa细胞体内外生长的影响.方法 构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Beclin1,转染HeLa细胞[pcDNA3.1(+)-Beclin1组],同时设空载体转染组[pcDNA3.1(+)组]和空白对照组.采用荧光定量PCR和Western blot法检测3组HeLa细胞中Beclin1 mRNA和蛋白的表达变化,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测3组HeLa细胞生长的变化,采用流式细胞术检测3组HeLa细胞的凋亡情况,采用单丹磺酰尸胺染色检测3组HeLa细胞的自噬情况.将3组HeLa细胞分别接种于裸鼠皮下,观察体内成瘤性和生长情况.结果 pcDNA3.1(+)-Beclin1组、pcDNA3.1(+)组和空白对照组HeLa细胞中Beclin1 mRNA的表达水平分别为994.718 ±468.764、0.570±0.121和0.736±0.251.pcDNA3.1 (+ )-Beclin1组HeLa细胞中Beclin1 mRNA的表达水平较pcDNA3.1(+)组和空白对照组明显增高(P＜0.05),而pcDNA3.1(+)组与空白对照组间的差异无统计学意义(P＞0.05);3组HeLa细胞中Beclin1蛋白的表达情况与mRNA相似.pcDNA3.1(+)-Beclin1组的自噬细胞率为10.9％,明显高于空白对照组和pcDNA3.1(+)组(分别为2.5％和3.1％,P＜0.05).pcDNA3.1(+)-Beclin1组HeLa细胞的凋亡率为(28.2±2.3)％,明显高于pcDNA3.1(+)组和空白对照组[分别为(14.6±4.6)％和(11.2±3.0)％,P＜0.05].Beclin1在HeLa细胞中过表达可抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.7％;并可使HeLa细胞在裸鼠体内成瘤时间延长,瘤体体积和重量明显小于pcDNA3.1 (+)组和HeLa组(P＜0.05),抑瘤率为52.2％.结论 自噬基因Beclin1过表达可抑制HeLa细胞在体内外的增殖,促进细胞的自噬与凋亡,为宫颈癌基因治疗提供了新的选择途径.     

A549细胞系中自噬泡与线粒体形态的初步定量研究

目的探讨发生自噬的细胞中自噬泡的特点及自噬泡与细胞中线粒体形态特征参数间的关系,分析自噬泡膜来源于线粒体膜的可能性。方法将A549细胞培养后收集1～5×106个,常规固定、包埋及超薄切片,在透射电镜下观察。由随机取样的原则选择细胞进行照相。应用CMIAS多功能真彩色图像分析系统测定细胞、线粒体及自噬泡等结构的截面积和截面数目等参数,根据自动测量结果将细胞分为3组。结果 3组细胞内自噬泡总截面面积的平均值明显不同;3组间自噬泡体积密度的平均值之间存在统计学差异(P=0.03)。3组细胞内线粒体数目及线粒体总截面面积的平均值呈相应下降。结论由于3组细胞内线粒体和自噬泡总截面面积的平均值变化趋势相反,推测部分自噬泡的膜可能来源于线粒体的膜。     

LSD1抑制剂抑制非小细胞肺癌A549细胞侵袭、迁移及上皮间质转化

目的:探究赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（lysine-specific demethylase 1,LSD1）抑制剂对非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）A549细胞侵袭、迁移及上皮间质转化的影响。方法:将体外培养的人非小细胞肺癌A549细胞分为对照组和LSD1抑制剂组,在细胞进入对数生长期时,向实验组细胞中分别加入不同浓度的LSD1抑制剂,培养24 h。CCK-8法用于细胞增殖检测,划痕实验用于细胞迁移检测,Transwell小室法用于细胞侵袭检测,裂解细胞提取总蛋白后通过蛋白质免疫印迹技术（Western blot,WB）检测A549细胞中上皮细胞标志物E型钙黏蛋白（E-cadherin）、间充质细胞标志物N型钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表达水平。结果:与对照组相比,LSD1抑制剂组细胞增殖率、穿膜细胞数和划痕愈合率显著降低（P＜0.05）;LSD1抑制剂组相较于对照组,E-cadherin表达量升高,N-cadherin和Vimentin的表达量均降低（P＜0.05）。结论:LSD1抑制剂可抑制非小细胞肺癌A549细胞的侵袭、迁移及上皮间质转化。     

重组人血管内皮抑素对肺腺癌A549细胞生长及凋亡的影响

目的：探讨重组人血管内皮抑素（恩度）对肺腺癌A549细胞生长及凋亡的影响。方法：应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测恩度对肺腺癌A549细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测肺腺癌A549细胞的凋亡率,比较各浓度药物对肺腺癌A549细胞的诱导凋亡作用。结果：恩度可以抑制肺腺癌A549细胞的生长,且呈时间剂量依赖性。恩度可以诱导肺腺癌A549细胞的凋亡,随浓度增加、作用时间的延长,凋亡率增加,与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0．001）。结论：恩度对肺腺癌A549细胞的生长具有明显的抑制作用,主要通过诱导肺腺癌A549细胞的凋亡引起。     

丙戊酸对耐药细胞株A549/DDP增殖和凋亡作用的实验研究

目的:探讨丙戊酸(valproic acid,VPA)抑制肺癌耐药细胞株A549/DDP增殖和凋亡的作用.方法:0-4mmol/L丙戊酸作用于A549/DDP细胞48h,观察细胞数量和形态的变化,MTT法分析细胞生长抑制,流式细胞仪测定细胞周期动力学变化,细胞免疫组化测定Caspase-3.结果:VPA干预后细胞数量明显减少,形态不规则,细胞核固缩,胞质减少;与对照组比较,VPA可造成A549/DDP细胞生长抑制,且随着VPA浓度的增加,抑制率增加;G1期比例明显升高,S期明显降低;与对照组比较,各实验组细胞胞质中Caspase-3表达明显增加,Caspase-3表达与VPA的浓度成正相关.结论:VPA可明显抑制A549/DDP的生长,诱导凋亡和G1期阻滞作用,在肺癌耐药方面具有重要理论价值和实践意义.     

丙戊酸对耐药细胞株A549／DDP增殖和凋亡作用的实验研究

目的：探讨丙戊酸（valproicacid,VPA）抑制肺癌耐药细胞株A549／DDP增殖和凋亡的作用。方法：0—4mmol／L丙戊酸作用于A549／DDP细胞48h,观察细胞数量和形态的变化,MTT法分析细胞生长抑制,流式细胞仪测定细胞周期动力学变化,细胞免疫组化测定Caspase-3。结果：VPA干预后细胞数量明显减少,形态不规则,细胞核固缩,胞质减少;与对照组比较,VPA可造成A549／DDP细胞生长抑制,且随着VPA浓度的增加,抑制率增加;G1期比例明显升高,S期明显降低;与对照组比较,各实验组细胞胞质中Caspase-3表达明显增加,Caspase-3表达与VPA的浓度成正相关。结论：VPA可明显抑制A549／DDP的生长,诱导凋亡和G1期阻滞作用,在肺癌耐药方面具有重要理论价值和实践意义。     

EHMT1 knockdown induces apoptosis and cell cycle arrest in lung cancer cells by increasing CDKN1A expression

Dozens of histone methyltransferases have been identified and biochemically characterized, but the pathological roles of their dysfunction in human diseases such as cancer remain largely unclear. Here, we demonstrate the involvement of EHMT1, a histone lysine methyltransferase, in lung cancer. Immunohistochemical analysis indicated that the expression levels of EHMT1 are significantly elevated in human lung carcinomas compared with non‐neoplastic lung tissues. Through gene ontology analysis of RNA‐seq results, we showed that EHMT1 is clearly associated with apoptosis and the cell cycle process. Moreover, FACS analysis and cell growth assays showed that knockdown of EHMT1 induced apoptosis and G1 cell cycle arrest via upregulation of CDKN1A in A549 and H1299 cell lines. Finally, in 3D spheroid culture, compared to control cells, EHMT1 knockdown cells exhibited reduced aggregation of 3D spheroids and clear upregulation of CDKN1A and downregulation of E‐cadherin. Therefore, the results of the present study suggest that EHMT1 plays a critical role in the regulation of cancer cell apoptosis and the cell cycle by modulating CDKN1A expression. Further functional analyses of EHMT1 in the context of human tumorigenesis may aid in the development of novel therapeutic strategies for cancer.     

慢病毒介导Ras-GRF1调控肝癌干细胞干性维持与自我更新能力的机制

目的:探究Ras蛋白特异性的鸟苷酸释放因子1（Ras protein specific guanylate releasing factor 1,Ras-GRF1）在肝癌干细胞（cancer stem cells,CSC）生物学特性及自我更新中的作用,并初步探究其作用机制。方法:实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测人正常肝细胞系（HL-7702）和不同肝癌细胞系（Huh7、HepG2、Hep3B、CLC4、CLCl3、SMMC-7721）中Ras-GRF1表达水平;流式细胞术分选出肝癌干细胞,利用Ras-GRF1-pCMV6-GFP重组慢病毒感染肝癌干细胞,MTT法、EdU染色和平板克隆形成实验检测过表达Ras-GRF1对肝癌干细胞增殖能力的影响;Transwell小室实验检测过表达Ras-GRF1后肝癌干细胞迁移与侵袭变化;成球实验检测过表达Ras-GRF1后肝癌干细胞的自我更新能力;蛋白免疫印迹（Western blot）检测肿瘤干细胞中Hippo信号通路关键蛋白大肿瘤抑制因子（large tumor suppressor,LATS）、Yes协同蛋白（Yes cooperative protein,YAP）和哺乳动物STE20样蛋白激酶（mammalian STE20-like protein kinase,MST）的蛋白及磷酸化表达水平。结果:不同肝癌细胞中Ras-GRF1 mRNA表达量较人正常肝细胞中显著降低（P＜0.05）;分离到的肝癌干细胞在感染Ras-GRF1-pCMV6-GFP重组慢病毒后,细胞中Ras-GRF1 mRNA表达量显著升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）;在两种肝癌干细胞 HepG2-CSC和SMMC-7721-CSC中,相较于空白对照组,Ras-GRF1-pCMV6组细胞增殖活性显著降低,EdU阳性染色数目和细胞克隆形成数目均显著减少,细胞迁移与侵袭数目也均显著减少,细胞成球能力明显降低,p-LATS/LATS、p-YAP/YAP及p-MST/MST蛋白表达显著增加,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论:通过慢病毒介导Ras-GRF1在肝癌干细胞中过表达后,能够抑制肝癌干细胞的增殖、迁移与侵袭,降低自我更新能力,其机制可能与调控Hippo信号通路相关。     

miR-218靶向SFMBT1影响肺癌细胞凋亡的研究

目的:探讨miR-218对肺癌细胞凋亡的影响。方法:qRT-PCR检测肺癌细胞A549、SPC-A1、H322和支气管黏膜上皮细胞16HBE中miR-218表达水平。以A549细胞为研究对象,预测miR-218的靶基因可能为含有4个mbt的Scm相关蛋白（SFMBT1）,双荧光素酶报告基因鉴定靶基因,细胞转染miR-218模拟物、模拟物阴性序列、SFMBT1小干扰RNA、小干扰RNA阴性序列,以不处理的细胞为对照,qRT-PCR和Western blot检测转染后细胞中miR-218和SFMBT1表达,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:miR-218在肺癌细胞中表达水平明显低于支气管黏膜上皮细胞16HBE,并且A549细胞中miR-218水平最低。miR-218模拟物和野生型的SFMBT1共转染后细胞荧光素酶活性降低。转染miR-218模拟物后细胞中miR-218水平升高,细胞凋亡率升高,细胞中SFMBT1 mRNA和蛋白水平降低。转染SFMBT1小干扰RNA后细胞中SFMBT1 mRNA和蛋白水平降低,细胞凋亡率升高。结论:miR-218可以负调控靶基因SFMBT1的表达促进肺癌细胞凋亡。     

过表达OMA1通过促进线粒体释放细胞色素C诱导肺腺癌A549细胞凋亡

目的:探讨OMA1在肺腺癌中的表达水平及其对肺腺癌A549细胞凋亡的影响及机制。方法:收集2018年01月至2019年10月在本院保存的42例经病理确诊为肺腺癌患者的癌组织样本及其癌旁组织(距离肿瘤边缘≥5 cm),免疫组化染色法检测癌组织及癌旁组织中OMA1表达情况。体外培养人肺腺癌细胞系NCI-H2009、Calu-3、SPC-A-1、A549及人正常肺上皮细胞BEAS-2B,qRT-PCR和Western blotting检测细胞中OMA1 mRNA和蛋白表达水平。采用OMA1过表达慢病毒及其空载慢病毒感染A549细胞,分为OMA1过表达慢病毒感染组(OMA1组)和空载慢病毒感染组(Vector组),另设置空白对照组(Blank组)。采用MTT检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡水平;JC-10染色法检测细胞线粒体膜电位变化;qRT-PCR法检测细胞中OMA1 mRNA表达水平;Western blotting法检测细胞中OMA1、cleaved caspase-3、OPA1以及细胞线粒体和胞浆中Cyt C蛋白表达水平。结果:肺腺癌患者癌组织中OMA1表达水平显著低于癌旁组织...     

番茄红素对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的:研究番茄红素(lycopene,LP)对人非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响并探讨其机制.方法:体外培养并取对数生长期人非小细胞肺癌A549细胞,分别给予不同浓度的LP(2.5、5、10、20 μg/ml)和顺铂(40 μg/ml)进行干预,48 h后采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定吸光度值并计算细胞增殖抑制率,流式细胞术(FCM)检测细胞周期和细胞凋亡状况,逆转录PCR法(RT-PCR)检测细胞中凋亡相关基因(BaxmRNA、bcl-2 mRNA)表达,免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白(caspase-3)表达.结果:与空白对照组比较,LP能够剂量依赖性地提高人非小细胞肺癌A549细胞增殖抑制率,延长细胞周期中G0/G1期并缩短G2/M期,提高A549细胞凋亡率(AI),上调Bax mRNA表达、下调bcl-2 mRNA表达,提高Bax/bcl-2比值,上调caspase-3蛋白表达.结论:LP具有抑制人非小细胞肺癌A549细胞增殖并促进其凋亡的作用,其机制可能与LP能够阻滞细胞周期并调节凋亡相关基因蛋白表达有关.