miR-218通过下调Bmi-1表达抑制人视网膜母细胞瘤细胞生长

目的：探讨miR-218在人视网膜母细胞瘤中的表达、临床意义及其分子机制。

方法：实时定量PCR检测miR-218在视网膜母细胞瘤及瘤旁组织中的表达,并分析其与临床病理特征的关系。检测miR-218在视网膜母细胞瘤细胞系中的表达,并用miR-218模拟物转染Y79细胞,MTT及流式细胞仪检测Y79细胞的增殖、凋亡情况,RT-PCR和Western-blot法检测Bmi-1 mRNA及蛋白的表达。

结果：miR-218在视网膜母细胞瘤组织中的表达水平显著低于对应瘤旁组织; miR-218低表达与神经浸润、分化程度密切相关; miR-218可显著抑制Y79细胞的增殖并促进其凋亡,并下调Bmi-1的mRNA及蛋白表达水平。

结论：miR-218在人视网膜母细胞瘤组织中表达下调,并与临床病理相关,miR-218抑制Y79细胞增殖、促进凋亡的作用可能与下调Bmi-1有关。     

氧化应激条件下miR-21对人眼小梁网细胞胞外基质蛋白表达的影响

目的 探讨氧化应激条件下miR-21对人眼小梁网细胞(human trabecular meshwork cells,HTMCs)胞外基质蛋白表达的影响.方法 用不同浓度H2O2(0μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1、600 μmol·L-1)刺激HTMCs l h,MTT法检测其对HTMCs活力的影响,从而确定后续实验所需H2O2浓度.随后将细胞分成正常组和H2O2组,Real-time PCR检测miR-21的表达,Western blot检测胞外基质蛋白(纤维连接蛋白和胶原蛋白I)的表达.然后将细胞分成5组:H2O2组(只用H2O2处理)、miR-21干预组(H2O2+ miR-21模拟物)、miR-21对照组(H2O2+ miR-21对照模拟物)、miR-21抑制组(H2O2+ miR-21抑制剂)和miR-21抑制对照组(H2O2+miR-21抑制剂对照物),Real-time PCR检测miR-21、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β2和PTEN mRNA表达,Western blot检测胞外基质蛋白、TGF-β2和PTEN蛋白表达.最后将细胞分成3组:H2O2组(只用H2O2处理)、PTEN干扰组(H2O2 +PTEN siRNA)和干扰对照组(H2O2+ control siRNA),检测PTEN、胞外基质蛋白和TGF-β2蛋白水平表达.结果 当H2O2浓度≥400 μmol·L-1时,可显著抑制HTMCs的活性,后续实验选择此浓度.与正常组相比,H2O2组中miR-21、纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ的表达均增加,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).检测氧化应激条件下miR-21对胞外基质蛋白、TGF-β2和PTEN表达的影响,发现与H2 O2组相比,miR-21对照组和miR-21抑制对照组中miR-21、纤维连接蛋白与胶原蛋白Ⅰ蛋白水平表达以及TGF-β2和PTEN mRNA及蛋白水平表达差异均无统计学意义(均为P＞0.05);与miR-21对照组相比,miR-21干预组miR-21、纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ蛋白水平及TGF-β2 mRNA和蛋白水平表达均增加,PTEN蛋白水平表达降低,差异均有统计学意义(均为P＜0.05),而PTEN mRNA表达差异均无统计学意义(均为P＞0.05);与miR-21抑制对照组相比,miR-21抑制组miR-21、纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ蛋白水平及TGF-β2 mRNA和蛋白水平表达均降低,PTEN蛋白水平表达增加,差异均有统计学意义(均为P＜O.05),而PTEN mRNA水平差异无统计学意义(P＞0.05).采用Western blot检测氧化应激条件下PTEN对TGF-β2和胞外基质蛋白表达的影响,发现与H2O2组相比,干扰对照组PTEN、TGF-β2、纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ的表达差异均无统计学意义(均为P＞0.05);与干扰对照组相比,PTEN干扰组PTEN的表达下调,TGF-β2、纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ的表达均升高,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 氧化应激条件下miR-21可增加HTMCs胞外基质产物,这可能与其靶向沉默PTEN基因,调节TGF-β2的表达相关.     

miR-375对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞功能的抑制作用及其机制

背景 研究表明miR-375抑制肿瘤细胞的增生、凋亡、迁移和黏附,并对肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)含量的变化进行调控,进而影响血管的生成,但miR-375是否干预视网膜新生血管的形成鲜见报道. 目的 探讨miR-375对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞(HRCECs)功能的影响及其可能的作用机制.方法 用IMDM完全培养液培养HRCECs,并将细胞分为正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2 +miR-375拟似剂组、CoCl2+miR-375拟似剂对照组、CoCl2+miR-375抑制剂组和CoCl2+miR-375抑制剂对照组,待细胞生长至对数生长期后用200 μmol/L CoCl2处理HRCECs以制备缺氧细胞模型;制备终浓度为50 nmol/L的miRNA-脂质体复合物和小干扰RNA(siRNA)-脂质体复合物将miR-375和卷曲蛋白4(FZD4) siRNA转染各组细胞48 h.采用MTT法检测各组细胞的增生情况(A值)并计算增生倍数;采用Transwell小室法检测各组迁移的细胞数目;采用ELISA法检测细胞培养液中VEGF和血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)含量;采用实时荧光定量PCR法检测细胞中miR-375 mRNA和FZD4 mRNA的相对表达量变化;采用Western blot法分析细胞中Wnt通路相关蛋白的相对表达量变化;采用Matrigel小管形成实验检测细胞的体外形成血管的长度.将培养的细胞分为正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2+mock组和CoCl2+FZD4 siRNA组,采用荧光素酶报告基因法探测miR-375靶基因FZD4的表达. 结果 miR-375处理组miR-375 mRNA相对表达量明显高于正常对照组,miR-375拟似剂组细胞中miR-375 mRNA相对表达量明显高于miR-375拟似剂对照组,miR-375抑制剂组细胞中miR-375 mRNA相对表达量明显低于miR-375抑制剂对照组,差异均有统计学意义(t=-19.237、8.764,均P＜0.01),提示miR-375的转染效率较高.正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2+ miR-375拟似剂组、CoCl2+miR-375拟似剂对照组、CoCl2+miR-375抑制剂组、CoCl2+miR-375抑制剂对照组间细胞增生倍数、迁移细胞数、细胞培养液中VEGF和VE-Cadherin含量以及体外小管形成长度的总体比较差异均有统计学意义(F=24.324、26.776、14.113、19.225、15.040,均P＜0.001),CoCl2 +miR-375拟似剂组细胞增生倍数、迁移细胞数体外小管形成长度及细胞分泌VEGF和VE-cadherin量均较CoCl2+miR-375拟似剂对照组明显减少,而CoCl2+miR-375抑制剂组较CoCl2+miR-375抑制剂对照组明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.01).正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2+miR-375拟似剂组、CoCl2+miR-375拟似剂对照组、CoCl2 +miR-375抑制剂组、CoCl2+miR-375抑制剂对照组细胞中β-catenin、cyclinD1、MMP2和VEGF蛋白表达量的总体比较差异均有统计学意义(F=11.753、13.283、16.770、10.334,均P＜0.001),CoCl2+ miR-375拟似剂组细胞中β3-catenin、cyclinD1、MMP2、VEGF蛋白表达量较CoCl2+miR-375拟似剂对照组均明显下降,CoCl2+miR-375抑制剂组较CoCl2+miR-375抑制剂对照组明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.01).CoCl2处理组和CoCl2+mock组细胞增生倍数、迁移细胞数和小管形成长度均较正常对照组明显增加,CoCl2+FZD4 siRNA组细胞增生倍数、迁移细胞数和小管形成长度均明显低于CoCl2+mock组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 miR-375抑制缺氧条件下HRCECs的增生、迁移以及血管形成能力,其作用机制与miR-375直接靶向FZD4调控Wnt通路活性有关.     

miR-155-5p/SOCS1在大鼠角膜移植排斥反应中的作用

目的 探讨miR-155-5p/细胞因子信号转导抑制物1(SOCS1)在大鼠角膜移植免疫排斥反应中的作用及典必殊能否抑制miR-155-5p/SOCS1 通路延缓排斥反应.方法 建立大鼠角膜移植模型,随机分为对照组、自体移植组、同种异体移植组、同种异体移植+典必殊组(典必殊组).术后每天按Larkin 法行角膜植片排斥...     

甲状腺相关性眼病静脉血单个核细胞差异表达microRNA的初步筛选

目的 以T淋巴细胞在甲状腺相关性眼病(TAO)发生发展中的重要作用作为切人点,筛选出具有意义的microRNA.方法 实验研究.收集对照组、TAO静止期组和TAO急性期组各3例患者的外周静脉血,提取人外周血单个核细胞(PBMC),采用新一代高通量测序(NGS),筛选出TAO患者(包括TAO静止期组和TAO急性期组)与对照者差异表达的microRNA.然后采用实时荧光定量PCR技术,在对照组、TAO静止期组和TAO急性期组各5例的扩大样本中对上述筛选出的microRNA予以t检验验证.结果 根据测序结果筛选出差异有统计学意义,且相差倍数＞2的microRNA,TAO静止期组与对照组比较共18个,TAO急性期组与对照组比较共31个.2个TAO患病组共同与对照组表达差异有统计学意义的microRNA为miR-19a-5p、miR-30c-2-3p、miR-548c-5p、miR-6718-5p,且均呈现明显上调趋势.实时荧光定量PCR验证结果与测序结果基本相符.结论 TAO患者PBMC中存在microRNA表达差异,miR-19a-5p、miR-30c-2-3p、miR-548c-5p、miR-6718-5p是潜在的TAO免疫诊断学标记物,部分可能参与TAO的免疫学发生发展机制.     

蓝光对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响和机制研究

目的:研究蓝光对人视网膜色素上皮细胞增殖能力的影响,并初步探讨其可能机制.方法:利用35W白色冷光灯加用蓝色滤光片建立蓝光损伤体外培养的RPE细胞模型,蓝光控制波长在470~520nm,光照强度控制为2000Lx左右,光照时间控制为24~96h,利用CCK-8法检测RPE细胞的增殖能力,利用real-time PCR技术检测RPE细胞中miR-103的含量.结果:与对照组相比,蓝光照射组的RPE细胞的增殖能力减弱;蓝光照射组的RPE细胞内的miR-103含量较对照组增加;miR-103过表达时,RPE细胞的增殖能力减退,降低miR-103的表达时,细胞增殖能力增强;降低miR-103的表达能够减弱蓝光对RPE细胞增殖的抑制作用.结论:蓝光通过上调miR-103抑制RPE细胞的增殖,miR-103可能成为治疗年龄相关性黄斑变性等视网膜变性疾病治疗的新靶点.     

微小RNA-133b对紫外线诱导的晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用及其调控机制

背景 研究证实紫外线B照射是白内障发生的主要原因之一,其机制与晶状体上皮细胞(LECs)凋亡有关.微小RNA-133b(miR-133b)参与氧化应激诱导的LECs凋亡的调控过程,但其是否参与紫外线诱导白内障的发病过程及其机制尚未阐明. 目的 观察miR-133b对紫外线诱导白内障LECs凋亡的抑制作用及其调控机制.方法 将20只8周龄SPF级C57 BL/6小鼠采用随机数字表法分为白内障模型组和正常对照组,其中白内障模型组小鼠用波长302 nm的紫外线直接照射眼部5 min,照射强度为300 W/cm2,每天照射1次,共照射1周;正常对照组小鼠不给于任何干预.于末次照射后24 h处死各组小鼠并摘出10只眼球以制备全眼球切片.取人LECs细胞系(SRA01/04)紫外线照射25 min,并继续培养4h作为紫外线照射组,正常对照组细胞不作任何干预.取紫外线照射模型组细胞接种于96孔板并分为miR-133b模拟物组、模拟物阴性对照组、miR-133b抑制物组和抑制物对照组,分别用lipofectamine2000联合50 nmol/L miR-133b模拟物、miR-133b模拟物对照剂、100 nmol/L miR-133b抑制物或miR-133b抑制物对照剂瞬时转染细胞.采用实时荧光定量PCR法检测小鼠晶状体组织和不同转染组入LECs中miR-133b mRNA及其预测靶基因BCL2L2mRNA的表达以评估转染效率;采用TUNEL凋亡检测试剂盒检测小鼠晶状体组织中LECs和不同转染组人LECs的凋亡情况.结果 正常对照组小鼠晶状体前囊膜LECs排列规则,未发现TUNEL染色阳性细胞,白内障模型组小鼠LECs排列稀疏,可见凋亡细胞呈红色荧光.紫外线照射组细胞凋亡率为(43.90±9.30)％,明显高于正常对照组的(1.08±0.49)％,差异有统计学意义(t=-7.963,P=0.015).白内障模型组小鼠晶状体组织和紫外线照射组细胞中miR-133b mRNA的相对表达量分别低于正常对照组小鼠和正常人LECs,差异均有统计学意义(t=-2.958,P=0.042;t=-6.195,P=0.003).白内障模型组小鼠晶状体组织和紫外线照射组细胞中BCL2L2 mRNA的相对表达量分别高于正常对照组小鼠和正常人LECs,差异均有统计学意义(t=3.761,P=0.020;t 12.437,P=0.000).miR-133b模拟物组人LECs中miR-133b mRNA的相对表达量明显高于miR-133b模拟物对照组,而BCL2L2 mRNA的相对表达量明显低于miR-133b模拟物对照组,差异均有统计学意义(t=10.883、-5 927.617,均P＜0.01);miR-133b抑制物组人LECs中miR-133b mRNA的相对表达量明显低于miR-133b抑制物对照组,而BCL2L2 mRNA的相对表达量明显高于miR-133b抑制物对照组,差异均有统计学意义(t=-1 606.622、17.556,均P＜0.01).miR-133b模拟物组LECs凋亡率明显低于miR-133b模拟物对照组[(17.55±4.24)％与(43.62±9.19)％],miR-133b抑制物组LECs凋亡率为(78.23±12.42)％,明显高于miR-133h抑制物对照组的(48.01±9.68)％,差异均有统计学意义(t=-4.462,P=0.011;t=3.324,P=0.029).结论 miR-133b可防止紫外线照射所致的白内障的形成,其机制可能与靶向负性调控BCL2L2基因从而调控LECs的凋亡过程有关.     

慢病毒介导miR-34a表达对视网膜母细胞瘤自噬的影响及机制研究

目的　探讨慢病毒介导miR-34a表达对视网膜母细胞瘤自噬的影响并对其机制进行研究。方法　取对数生长期的Y79细胞，将转染miR-34a的慢病毒载体、转染高迁移率族蛋白1（high mobility group protein 1，HMGB1）载体、共转染miR-34a+HMGB1的慢病毒载体及培养液接种至Y79细胞构建转染miR-34a细胞系。按照接种载体分组，将Y79细胞株分为4组，分别为转染miR-34a组、转染HMGB1组、共转染miR-34a+HMGB1组及阴性对照组。用qRT-PCR检测miR-34a的表达，采用Capase3检测试剂盒检测Caspase3活性。采用流式细胞仪及单丹磺酰尸胺（monodansyl cadaverin，MDC）试剂盒在488 nm荧光下检测MDC荧光率，利用透射电子显微镜观察自噬超微结构。结果　miR-34a转染结果显示，转染miR-34a组miR-34a的相对表达量（2.04±0.46）显著高于阴性对照组（1.03±0.21）（P<0.05），共转染miR-34a+HMGB1组的HMGB1的相对表达量（0.42±0.08）显著低于转染HMGB1组（1.08±0.16），差异有统计学意义（P<0.05）。Caspase3活性测试显示，转染miR-34a组Caspase3活性（10.75±2.87）明显高于阴性对照组（3.48±0.74），转染HMGB1组Caspase3活性（2.46±0.94）低于共转染miR-34a+HMGB1组（6.21±1.74），差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞仪检测结果显示，转染miR-34a组MDC阳性率（56.94%）明显高于阴性对照组（2.15%），共转染miR-34a+HMGB1组的MDC阳性率（43.11%）明显高于转染HMGB1组（10.32%）（P<0.05）。透射电子显微镜观察自噬超微结构显示，阴性对照组无明显改变，共转染miR-34a+HMGB1组可见Y79细胞双层膜结构，转染miR-34a组可见自噬溶酶体结构。结论　miR-34a促进视网膜母细胞瘤的自噬凋亡，其机制可能为抑制HMGB1的表达。     

miR-30b-5p 抑制Notch信号通路活化对实验性自身免疫性葡萄膜炎的治疗作用

目的　探讨miR-30b-5p对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠Notch信号通路活化的调控机制及治疗作用。方法　通过Target Scan（http://www.targetscan.org/）对Notch1和Dll4基因与 miR-30b 的关系进行生物信息学预测。将雌性Lewis大鼠随机分为对照组、EAU组、miR-30b-5p组和miR-30b-5p空载体（miR-30b-5p-N）组。EAU组、miR-30b-5p组和miR-30b-5p-N组大鼠首先诱导EAU模型,miR-30b-5p组和miR-30b-5p-N组大鼠分别采用携带miR-30b-5p和miR-30b-5p-N的慢病毒于EAU大鼠脾脏进行注射干预处理,EAU组大鼠于同一部位注射相同体积的生理盐水。处理后12 d,实时荧光定量PCR检测4组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1和Dll4 mRNA的表达;免疫组织化学检测4组大鼠脾脏、淋巴结及眼组织中Notch1和Dll4蛋白的表达,分析miR-30b-5p对葡萄膜炎大鼠Notch信号通路的调控作用。结果　生物信息学预测分析结果表明,Notch 信号通路上 Notch1和Dll4基因均为 miR-30b 调控的靶基因。免疫后12 d,相比于对照组,EAU组、miR-30b-5p组和miR-30b-5p-N组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1和Dll4 mRNA水平均升高（均为P<0.05）;经miR-30b-5p干预治疗后,miR-30b-5p组脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1和Dll4 mRNA表达均显著降低（均为P<0.05）。免疫组织化学检测结果显示,免疫后12 d,EAU组、miR-30b-5p组和miR-30b-5p-N组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1和Dll4 蛋白表达均上调（均为P<0.05）;miR-30b-5p干预治疗后,脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1和Dll4蛋白表达均显著下调（均为P<0.05）。结论　miR-30b-5p可明显下调EAU大鼠各组织中Notch1和Dll4等Notch信号通路相关分子的表达进而抑制Notch信号通路活化,从而达到治疗葡萄膜炎的作用。     

氧诱导视网膜病变小鼠模型微小RNA表达谱分析

目的 分析氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型的微小RNA表达谱,筛选可能与视网膜新生血管(RNV)形成有关的微小RNA.方法 7日龄健康C57BL/6J小鼠52只随机分为正常对照组和OIR组,每组26只.OIR组建立OIR小鼠模型;正常对照组不做任何处理.小鼠17日龄时,行视网膜铺片,观察视网膜血管形态;行视网膜石蜡切片,计数突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数;行微小RNA芯片分析,检测具有差异表达的微小RNA,再应用实时聚合酶链反应(RT-PCR)进行验证.结果 正常对照组小鼠视网膜血管平滑、均匀有序分布;OIR组小鼠周边视网膜血管纡曲、紊乱并伴有新生血管芽,中央视网膜无灌注区明显.正常对照组、OIR组小鼠视网膜无灌注区的相对面积分别为(6.57±3.6)％、(25.81±2.12)％;OIR组小鼠视网膜无灌注区的相对面积较正常对照组明显增大,差异有统计学意义(t=28.71,P＜0.001).光学显微镜观察发现,正常对照组小鼠内界膜结构完整、平滑,血管内皮细胞排列整齐,偶见突破内界膜的血管内皮细胞核.正常对照组、OIR组平均每张切片突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数分别为(0.16±0.31)、(28.41±4.01)个.两组平均每张切片突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数比较,差异有统计学意义(t=54.45,P＜0.001).微小RNA芯片分析结果显示,与正常对照组比较,OIR组有21个微小RNA的表达发生了1.5倍以上的变化.其中,上调者9个,下调者12个.差异表达倍数≥3.0的微小RNA为miR-3078、miR-140、miR-29b、miR-29c.RT-PCR检测发现,差异表达倍数≥3.0的4个微小RNA,其表达趋势与芯片分析结果一致.与正常对照组比较,OIR组miR-3078的表达明显上调,差异有统计学意义(t=-2.380,P＜0.05);miR-140、miR-29b、miR-29c的表达明显下调,差异也有统计学意义(t=2.638、2.323、2,415,P＜0.05).结论 OIR小鼠模型的微小RNA表达谱中,miR-3078、miR-140、miR-29b、miR-29c的差异表达倍数≥3.0,其可能与RNV形成有关.     

miRNA-19对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其机制研究

目的　探讨miR-19在葡萄膜黑色素瘤（UM）细胞中的表达及其对UM细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法　qRT-PCR检测正常视网膜上皮细胞系ARPE-19和UM细胞系SP6.5、M23 中miR-19 的表达。将M23细胞分为miR-19 inhibitor组（转染miR-19-inhibitor）及miR-19 NC组(转染scramble）,MTT法检测各组细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,Western blot检测表皮生长因子受体(EGFR)/丝氨酸-苏氨酸激酶（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路蛋白表达。结果　正常视网膜上皮细胞系ARPE-19中miR-19 相对表达量为1.35±0.13,均显著低于UM细胞系SP6.5与M23中miR-19相对表达量8.35±0.73和9.35±0.43(均为P<0.01) 。 M23 细胞转染后,miR-19 inhibitor组中miR-19表达量低于miR-19 NC组 (1.05±0.33 vs 8.05±0.64,P<0.01)。MTT法检测结果显示,转染24 h,miR-19 inhibitor组与miR-19 NC组光密度值比较,差异无统计学意义（P>0.05);转染48 h、72 h、96 h,miR-19 inhibitor组光密度值均低于miR-19 NC组（均为P<0.05)。miR-19 inhibitor组细胞凋亡率高于miR-19 NC组［(15.34±2.35)% vs (8.23±0.72) %,P<0.05］。miR-19 inhibitor组细胞划痕愈合率低于miR-19 NC组 ［(23.7±2.1） % vs （68.9±5.1）%,P<0.05］。miR-19 inhibitor组侵袭细胞数少于miR-19 NC组［(45.1±3.9）个 vs （115.3±8.9）个,P<0.05］。miR-19 inhibitor组UM细胞系M23 EGFR蛋白表达量低于miR-19 NC组（0.43±0.03 vs 1.02±0.02,P<0.05) 。miR-19 inhibitor组AKT蛋白表达量低于miR-19 NC组（0.52±0.04 vs 1.12±0.05,P<0.05)。miR-19 inhibitor组mTOR蛋白表达量低于miR-19 NC组（0.63±0.05 vs 1.41±0.06,P<0.05）。结论　敲低miR-19 表达可抑制UM细胞增殖、迁移和侵袭能力并促进凋亡,其机制可能与EGFR/AKT/mTOR信号通路被抑制有关。     

ghrelin-GHSR-1a对高糖环境下视网膜血管内皮细胞的保护作用

目的 观察ghrelin及其受体生长激素分泌素受体1a(GHSR-1a)在高糖环境下对视网膜血管内皮细胞的保护作用.方法 将体外培养的人视网膜血管内皮细胞(HRMECs)分为对照组和高浓度葡萄糖组.对照组细胞在含5.5 mmol·L-1葡萄糖的M199培养基中培养48 h,高浓度葡萄糖组细胞在含30.0 mmol·L-...     

信号转导及转录激活因子4（STAT4）介导的circ_0001879表达对高糖条件下人视网膜微血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨信号转导及转录激活因子4（STAT4）介导的circ_0001879表达对高糖处理的人视网膜微血管内皮细胞(HREC)增殖和凋亡的影响。方法　将HREC分为正常组（5.5 mmol·L^-1葡萄糖）、高糖组（25.0 mmol·L^-1葡萄糖）和甘露醇对照组（5.5 mmol·L^-1葡萄糖+19.5 mmol·L^-1甘露醇）,继续培养。将高糖组细胞进一步分组,进行相应转染处理。采用实时荧光定量PCR检测各组细胞circ_0001879、miR-338和多效生长因子（PTN）的表达。通过MTT、流式细胞术分析circ_0001879调控miR-338/PTN对HREC增殖和凋亡的影响。采用双荧光素酶报告实验确定miR-338和circ_0001879、miR-338和PTN之间的相互作用;ChIP实验验证STAT4与circ_0001879的结合。结果　与甘露醇对照组HREC中 circ_0001879（1.21±0.13）、miR-338（0.99±0.08）和PTN（1.12±0.11）的表达相比,高糖组HREC中circ_0001879（2.93±0.21）和PTN（3.62±0.33）的表达显著升高,而miR-338（0.44±0.05）的表达降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。通过MTT和流式细胞术检测各组细胞增殖活力和凋亡率,结果显示,过表达miR-338能够抑制高糖处理的HREC的增殖活力,促进HREC凋亡,而敲减miR-338的表达则作用相反;miR-inhibitor对高糖处理的HREC的作用能够被si-circ部分抑制。双荧光素酶报告实验结果显示,PTN是miR-338的一个靶基因,且其表达受miR-338和circ_0001879的影响。ChIP实验结果显示,STAT4与circ_0001879启动子区域的B1、B3结合,STAT4能够与circ_0001879的启动子结合并且促进circ_0001879的转录。结论　STAT4能够激活circ_0001879的转录,circ_0001879进一步通过调节miR-338/PTN轴促进高糖条件下HREC增殖,抑制细胞凋亡。     

薯蓣皂苷对高糖诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

目的 探讨薯蓣皂苷(Dio)对高糖(HG)诱导的视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤的保护作用,并分析其机制.方法 用细胞计数试剂8(CCK-8)法筛选葡萄糖浓度和无细胞毒性的Dio剂量范围.将ARPE-19细胞分为对照组(5 mmol·L-1葡萄糖处理48 h)、模型组(50 mmol·L-1葡萄糖处理48 h)和低、中...     

年龄相关性白内障患者miR-138的表达及其对人晶状体上皮细胞凋亡的影响

目的　检测miR-138在年龄相关性白内障晶状体组织中的表达情况,并探讨miR-138对人晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响及其可能的靶基因。方法　采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测年龄相关性白内障患者（白内障组）与正常对照组中miR-138和预测靶基因沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)的表达水平。向人晶状体上皮细胞系（SRA01/04）细胞中分别转染miR-138 模拟物、模拟物阴性对照物、miR-138抑制物、抑制物阴性对照物,采用RT-qPCR检测SIRT1的mRNA表达,Western blotting检测SIRT1的蛋白表达水平;转染72 h后细胞暴露于200 μmol·L^-1 H₂O₂ 1 h,Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3活性。双荧光素酶报告基因检测验证miR-138与SIRT1的靶向关系。结果　与正常对照组相比,白内障组miR-138的表达(3.64±0.19)显著升高（P<0.001）,SIRT1的mRNA表达(0.32±0.06)显著下降（P<0.001）;相对于模拟物阴性对照组,miR-138 模拟物组的SIRT1的mRNA(0.42±0.05)及蛋白(0.46±0.05)表达水平均明显降低,Caspase-3活性(3.24±0.17)明显升高（均为P<0.05）;相对于抑制物阴性对照组,miR-138抑制物组的SIRT1的mRNA(2.95±0.13)及蛋白(1.98±0.12)表达水平均明显升高,Caspase-3活性(0.42±0.05)均明显下降（均为P<0.05）;双荧光素酶报告基因检测确证SIRT1为miR-138的直接作用靶点。结论　miR-138在年龄相关性白内障患者晶状体囊膜中高表达,miR-138通过靶向性负性调控SIRT1表达,促进晶状体上皮细胞凋亡。     

OTUD6B-AS1通过miR-21-5p对高糖诱导的ARPE-19细胞增殖、迁移的影响

目的　探讨高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19)中含有卵巢肿瘤结构域的6B反义RNA 1(OTUD6B-AS1)的功能及其作用机制。方法　取ARPE-19细胞,加入含30 mmol·L^-1葡萄糖的培养基培养,设为高糖组,另取ARPE-19细胞不做任何处理设为对照组。用Lipofectamine^TM 2000转染试剂分别将过表达空质粒（pcDNA-NC组）、OTUD6B-AS1过表达质粒（pcDNA-OTUD6B-AS1组）和OTUD6B-AS1过表达质粒＋miR-21-5p 模拟物（pcDNA-OTUD6B-AS1+miR-21-5p mimics组）转染进高糖诱导的ARPE-19细胞。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测细胞中OTUD6B-AS1和miR-21-5p的表达;用CCK-8法检测各组细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况;细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力;荧光素酶报告基因实验验证OTUD6B-AS1与miR-21-5p的靶向关系。结果　与对照组比较,高糖组ARPE-19细胞中OTUD6B-AS1表达量显著降低、miR-21-5p表达量显著升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与对照组比较,高糖组细胞凋亡率显著升高,细胞增殖率和迁移率均显著降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05）。与pcDNA-NC组比较,pcDNA-OTUD6B-AS1组中细胞增殖率和迁移率显著升高,细胞凋亡率显著降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验显示,OTUD6B-AS1可靶向miR-21-5p。与pcDNA-OTUD6B-AS1组比较,pcDNA-OTUD6B-AS1＋miR-21-5p mimics组细胞凋亡率显著升高,细胞增殖率和迁移率显著降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05）。结论　OTUD6B-AS1可抑制高糖诱导的ARPE-19细胞凋亡,并促进细胞增殖和迁移,其作用机制与miR-21-5p有关。     

高糖条件下miR-615-5p对人视网膜内皮细胞的影响研究

目的 探讨高糖条件下miR-615-5p对人视网膜内皮细胞(hRECs)迁移能力、成管能力、愈合能力的影响及其机制.方法 取对数生长期的hRECs,将细胞分为低糖(LG)组、高糖(HG)组、miR-615-5p模拟物(mimic)组、miR-615-5p模拟物阴性对照(mi-nc)组、miR-615-5p抑制剂(inh...     

circZNF292靶向miR-23b-3p/SIRT1轴调节人晶状体上皮细胞氧化应激损伤的机制分析

目的　探究circZNF292在调节人晶状体上皮细胞（LECs）氧化应激损伤中的作用及可能的分子机制。方法　收集单纯年龄相关性白内障（ARC）患眼的晶状体前囊膜组织（ARC组）和排除眼部疾病眼球捐献者的晶状体前囊膜组织（对照组）各3例,进行RNA提取及转录组学测序。应用qRT-PCR检测两组样本中circZNF292、miR-23b-3p和SIRT1 mRNA表达水平。利用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性来验证circZNF292、miR-23b-3p、SIRT1之间的靶向关系。体外培养人永生化LECs细胞系HLE-B3,分为空白对照组、NC siRNA组、circZNF292 siRNA组、NC inhibitor组、miR-23b inhibitor组、NC mimics组、miR-23b mimics组、circZNF292 siRNA+miR-23b inhibitor组。使用Lipo2000试剂转染,48 h后收获细胞。分别用MTT法、流式细胞术和荧光探针示踪法检测细胞活力、凋亡率及丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、活性氧（ROS）含量。结果　ARC组和对照组晶状体前囊膜组织样本之间鉴定得到469个下调circRNA和1231个上调circRNA,对前10位变化最明显的circRNA进行qRT-PCR验证,最终确定circZNF292在ARC组样本中下调最明显;且circZNF292与miR-23b-3p表达、miR-23b-3p与SIRT1 mRNA表达均呈负相关（r=-0.935,-0.951,均为P<0.05）。NC siRNA组和空白对照组细胞活力、细胞凋亡率及ROS、MDA、SOD、GSH-Px含量比较,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。应用H₂O₂刺激后,与NC siRNA组相比,NC siRNA组+H₂O₂ HLE-B3细胞凋亡率及ROS、MDA含量均明显升高（均为P<0.05）,细胞活力及SOD、GSH-Px含量均明显降低（均为P<0.05）;而circZNF292 siRNA组+H₂O₂细胞凋亡率及ROS、MDA含量则较NC siRNA组+H₂O₂均进一步升高（均为P<0.05）,细胞活力及SOD、GSH-Px含量均进一步降低（均为P<0.05）。此外,circZNF292 siRNA+miR-23b inhibitor组上述指标较circZNF292 siRNA组则被逆转（均为P<0.05）。结论　circZNF292可通过miR-23b-3p/SIRT1轴调节人LECs氧化应激损伤,从而有望为ARC提供新的治疗靶标。     

miR-106调控CC趋化因子配体2对增生型糖尿病视网膜病变中人视网膜微血管内皮细胞增殖、血管生成和炎症反应的影响

目的　探讨miR-106调控CC趋化因子配体2（CCL2）对增生型糖尿病视网膜病变（PDR）中人视网膜微血管内皮细胞（HRMEC）增殖、血管生成、炎症反应的影响。方法　GEO数据库筛选PDR中差异表达的miRNAs。高糖（25.0 mmol·L^-1葡萄糖,HG）诱导HRMEC建立PDR细胞模型,qRT-PCR检测miR-106和CCL2在正常葡萄糖（5.5 mmol·L^-1葡萄糖,NG）和HG培养条件下HRMEC中的表达。将PDR患者的血清外泌体做miR-106过表达处理后与HG处理的HRMEC共培养,同时干预HRMEC中CCL2的表达以探讨血清外泌体miR-106和CCL2在PDR中的功能。采用MTT法、小管形成实验和ELISA法分别检测各组HRMEC增殖、血管生成和炎症因子的表达。双荧光素酶报告实验用以验证miR-106和CCL2的靶向关系。结果　与NG组细胞中miR-106表达（1.04±0.10）、CCL2表达（1.02±0.09）相比,HG培养的HRMEC中miR-106表达（0.68±0.06）降低,CCL2表达（1.38±0.11）升高（均为P<0.05）。PDR患者血清外泌体中miR-106表达较NDR患者血清外泌体中表达降低（P<0.05）。与HG+PDR-exo+miR-NC组相比,HG+PDR-exo+miR-106 mimic组HRMEC活力降低,血管生成被抑制,细胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低,而SOD、CAT和GSH水平升高（均为P<0.05）。双荧光素酶报告实验证实了CCL2是miR-106的一个靶点。与HG+PDR-exo+miR-106 mimic+oe-NC组相比,HG+PDR-exo+miR-106 mimic+oe-CCL2组HRMEC活力提高,血管生成被诱导,TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,而SOD、CAT和GSH水平降低（均为P<0.05）。结论　血清外泌体miR-106能够抑制CCL2表达,进而对PDR中的HRMEC增殖、血管生成和炎症反应起抑制作用。     

miR-21对H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡及PTEN/AKT通路的影响

目的　探讨miR-21对H₂O₂诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡以及PTEN/AKT通路的影响。方法　体外培养人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19,实验分为四组:空白对照组、阴性对照组、H₂O₂组、H₂O₂+miR-21mimics组,使用q-RT-PCR法检测各组ARPE-19细胞中miR-21表达,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3以及人第10号染色体缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN）、磷酸化AKT蛋白表达。结果　与空白对照组和阴性对照组相比,H₂O₂组和H₂O₂+miR-21 mimics组miR-21表达量（1.14±0.23、2.18±0.44）、SOD水平［（5.49±1.10） U·L^-1、（14.28±2.86） U·L^-1］、Bcl-2蛋白含量（0.34±0.07、0.62±0.12）、p-PI3K表达水平（0.46±0.09、0.68±0.13）、p-AKT水平（0.53±0.11、1.16±0.13）均显著降低,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）,而活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）水平（30.58±7.96、23.25±5.67）、MDA水平［（3.95±0.79）mol·L^-1、（2.13±0.43）mol·L^-1］、凋亡率［（25.48±5.10）%、（17.63±3.52）%］、PTEN蛋白表达（0.59±0.12、0.43±0.11）、Bax表达（0.73±0.15、0.49±0.10）、Caspase-3蛋白表达（0.85±0.17、0.42±0.08）均显著升高,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。与H₂O₂组相比,H₂O₂+miR-21 mimics组miR-21表达量、SOD水平、Bcl-2蛋白表达、p-PI3K及p-AKT蛋白表达均显著升高（均为P＜0.05）,ROS水平、MDA水平、细胞凋亡率、PTEN蛋白表达、Bax及Caspase-3蛋白表达均显著降低（均为P＜0.05）。结论　上调miR-21可能通过激活PTEN/AKT信号通路抑制H₂O₂诱导的视网膜色素上皮细胞细胞凋亡。