黄精多糖对乳牙牙髓干细胞增殖及成骨向分化的影响

目的:初步探索不同浓度黄精多糖(PSP)对乳牙牙髓干细胞(SHEDs)增殖及成骨分化能力的影响.方法:分离、培养SHEDs,通过流式细胞术及茜素红染色分别对细胞表面标志物和成骨分化潜能进行鉴定.采用不同浓度PSP处理SHEDs后,CCK-8法检测SHEDs的增殖情况,钙钴法染色和碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测其ALP活...     

Chir99021调控Wnt/β-catenin信号通路干预干细胞成骨/成牙分化的研究

目的:探讨Chir99021调控Wnt/β-catenin信号通路干预人牙髓干细胞成骨/成牙分化及其可能的机制.方法:分离纯化和培养人前磨牙牙髓干细胞(HDPSCs),免疫荧光检测牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)和波形蛋白(Vimentin),CCK-8检测不同浓度Chir99021对HDPSCs细胞增殖作用的影响.将HDPSCs分为3组培养,第1组正常培养,为空白对照组;第2组成骨诱导液培养,为实验对照组;第3组成骨诱导液+Chir99021培养,为实验组.15 d后用茜素红染色对各组细胞进行钙沉积物检测;qPCR于5、10、15 d检测各组轴抑制蛋白2(axis-inhibition protein2,Axin2)、β连环蛋白(β-catenin)及糖原合成激酶3(GSK-3β)水平;Western blot于5、10、15 d检测各组RUNT相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和Ⅰ型胶原的表达.结果:分离培养后的HDPSCs中DSP和Vimentin呈阳性表达;Chir99021浓度为2000 nmol/L时,细胞增殖情况最明显;茜红素染色显示实验组钙沉积物较其余两组显著增加;实验组中Axin2、β-catenin显著上升,GSK-3β显著下降(P<0.05);Runx2、ALP在实验组及实验对照组中有显著表达(P<0.05),OC在实验组中显著表达(P<0.05);DSPP、Ⅰ型胶原在实验组中显著表达(P<0.05).结论:Chir99021通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进HDPSCs的增殖和成骨/成牙分化.     

镁黄长石对乳牙牙髓干细胞增殖和成骨分化的影响

目的:研究山羊乳牙牙髓干细胞在镁黄长石表面黏附、增殖和成骨分化特性。方法:采用酶消法培养山羊乳牙牙髓干细胞。在生长培养液条件下,应用荧光显微镜观察细胞在材料表面的黏附情况,以CCK-8法检测细胞在材料表面的增殖特性;在矿化培养液条件下,以pNPP法检测细胞在材料表面于1、4、7 d碱性磷酸酶(ALP)活性,并通过实时定量PCR检测4、7 d时成骨标志基因ALP、COL I、OPN和OCN的表达。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与β-TCP相比,山羊乳牙牙髓干细胞在镁黄长石表面伸展更开,在第4天起增长明显加快,ALP活性在4、7 d更高,镁黄长石组的基因表达水平明显上调,其中OCN表达量在第7天显著增加(P<0.01)。结论:山羊乳牙牙髓干细胞在镁黄长石表面能够良好黏附和增殖。与β-TCP相比,镁黄长石能够促进山羊乳牙牙髓干细胞向成骨方向分化。     

细胞外基质磷酸化糖蛋白在人牙髓细胞成牙本质分化中的表达

义(P<0.05).蛋白质印迹法检测显示各矿化标记的蛋白表达均较对照组上调.结论 在hDPC诱导成牙本质分化的过程中,MEPE与DSPP、DSP、BSP、Ⅰ型胶原呈现相似的表达变化趋势,提示MEPE与hDPC的成牙本质分化有关,可作为hDPC向成牙本质样细胞分化的标志.     

米诺环素通过Wnt/β-Catenin通路对大鼠牙髓干细胞成骨分化的影响

目的 探讨米诺环素对大鼠牙髓干细胞(RDPSCs)成骨分化的影响,以及对Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-Catenin)通路的作用.方法 将RDPSCs随机分为对照组和不同浓度(0.1、1.0、10.0、100.0 mg/L)米诺环素组,对细胞进行成骨诱导.CCK-8法检测细胞增殖率,试剂盒检测骨形成指标碱性磷酸酶(ALP)和骨钙蛋白(OCN)含量;茜素红S染色检测细胞钙盐沉积量;qRT-PCR检测ALP和OCN mRNA表达情况;蛋白质免疫印迹技术(WB)检测β-Catenin、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)和Runt相关转录因子2(Runx2)蛋白表达水平.结果 与对照组相比,0.1、1.0 mg/L米诺环素组RDPSCs细胞增殖率、ALP活性、OCN含量、钙盐沉积量及β-Catenin、Runx2蛋白水平均显著升高,GSK-3β蛋白水平显著降低(P<0.05);10.0、100.0 mg/L米诺环素组RDPSCs细胞增殖率显著升高(P>0.05),ALP活性、OCN含量及表达水平、钙盐沉积量及β-Catenin、Runx2蛋白水平均显著降低,GSK-3β蛋白水平显著升高(P<0.05).结论 低浓度米诺环素能够诱导大鼠牙髓干细胞成骨分化,而高浓度米诺环素抑制细胞成骨分化,该过程可能通过调控Wnt/β-Catenin信号通路实现.     

富血小板纤维蛋白通过Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成骨分化的研究

目的 :研究富血小板纤维蛋白(PRF)通过Wnt/β-catenin信号通路对骨髓基质干细胞(BMSCs)分化的影响。方法:分离、培养原代兔BMSCs,取第三代细胞进行干细胞鉴定,收集同一只兔耳缘静脉血离心制备PRF,将PRF与BMSCs置于Transwell小室中共培养并进行成骨分化。实验分组:A组为单纯BMSCs对照组;B组为PRF与BMSCs共培养组;C组为加入DKK1的PRF与BMSCs共培养组;D组为加入Wnt3a的PRF与BMSCs共培养组。茜素红染色观察各组钙结节形成情况,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测各组ALP活性,定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测成骨成脂相关基因Runx2、OCN、PPARγ2及LPL的m RNA表达,同时检测Wnt/β-catenin信号通路关键因子Cyclin D1及β-catenin的m RNA表达。结果:流式细术检测结果显示,原代培养的BMSCs符合间充质干细胞鉴定标准。茜素红染色结果显示,B组和D组的钙结节数量明显多于A组和C组,A组和C组之间无明显差异。碱性磷酸酶(ALP)活性检测结果显示,B组与D组的ALP活性较A组和C组明显增加(P<0.05),且两组之间差异无明显统计学意义。q RTPCR结果显示B组与D组中的成骨分化标志基因Runx2、OCN的m RNA表达,较A组和C组显著增加(P<0.05),而成脂分化标志基因PPARγ2、LPL的m RNA表达显著降低(P<0.05)。此外,B组和D组中Wnt/β-catenin信号通路关键因子Cyclin D1及β-catenin的m RNA表达较A组和C组显著增加(P<0.05)。结论:PRF通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成骨分化而抑制其成脂分化。     

促红细胞生成素对人牙髓细胞增殖和成骨分化的影响

目的：探讨促红细胞生成素（EPO）对体外培养的人牙髓细胞（hDPCs）增殖和成骨分化的影响。方法：体外培养鉴定人牙髓细胞。使用 EPO 对在成骨诱导培养基中培养的牙髓细胞进行刺激,CCK-8检测 EPO 对牙髓细胞增殖的影响;20 U ／ml EPO 培养 hDPCs 7 d 和14 d,采用碱性磷酸酶活性（ALP）检测和茜素红染色观察 EPO 对牙髓细胞矿化的影响;利用 Real-time PCR 检测加入 EPO 后牙髓细胞成牙本质向分化相关基因的表达情况。结果：EPO 以时间和剂量依赖性方式促进牙髓细胞的增殖;20 U ／ml 的 EPO 后作用,牙髓细胞碱性磷酸酶活性显著提高（P ＜0．05）,钙结节形成明显增多;成牙本质向分化相关基因 DSPP、OCN、OSTERIX、RUNX2的表达明显上调（P ＜0．05）。结论：EPO 能促进人牙髓细胞的增殖和分化。     

小分子鹰嘴豆芽素A对人牙髓干细胞成骨分化的影响

目的:探讨不同浓度鹰嘴豆芽素A (biochanin A,BCA)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)成骨分化的影响及相关分子机制.方法:通过组织块法分离培养原代人牙髓干细胞,流式细胞术鉴定其细胞表型.通过CCK-8法检测不同浓度BCA对hDPSCs增殖活性的影响,通...     

DKK1对脂多糖感染人牙髓细胞生物学行为的影响

目的:研究DKK1对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)感染人牙髓细胞生物学行为的影响.方法:使用改良酶组织块法分离培养人牙髓细胞并通过免疫荧光染色鉴定细胞来源;通过细胞计数试剂盒(CCK-8)、Transwell实验、茜素红染色、荧光定量PCR等实验检测DKK1对LPS感染人牙髓细胞的生物学行为的变...     

GLUD1基因对人牙髓干细胞的体外增殖、分化和矿化的影响

目的:探索谷氨酸脱氢酶1 (Glutamate dehydrogenase 1,GLUD1)基因在人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hPDCSs)体外增殖、成骨分化和矿化中的作用.方法:体外分离培养hPDCSs,利用慢病毒感染方式沉默GLUD1基因的表达,分别采用RT-PCR和Western免疫印迹检测mRNA及蛋白水平的沉默效率.采用CCK8法检测细胞的体外增殖水平.对hDPSC进行体外成骨诱导分化培养,采用茜素红染色法检测矿化结节的形成,利用RT-PCR和免疫荧光染色分别检测Runx2、OCN基因的表达.采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析.结果:hDPSCs经过成骨诱导分化培养后,GLUD1的表达量较对照组明显上升;hDPSCs经shGLUD1病毒转染后,GLUD1表达明显下调;沉默GLUD1表达的hDPSCs体外增殖能力减弱;经成骨诱导分化培养后,与对照组相比,矿化结节形成明显减少;成骨早期标志基因Runx2上调,成骨晚期标志物OCN在mRNA和蛋白水平均显著下调.结论:沉默GLUD1表达抑制hDPSCs的体外增殖和矿化形成,影响晚期成骨分化;GLUD1在hDPSCs的成骨分化中具有重要作用.     

miR-124对牙髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制探讨

目的: 观察微小RNA（miR）-124对牙髓间充质干细胞（DPSCs）成骨分化的影响,并探讨其可能机制。方法: 取对数期DPSCs,分为空白组、空载组、miR-124 inhibitor组和miR-124 inhibitor联合氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯（DAPT,Notch信号通路抑制剂]组。空白组不处理,空载组转染阴性对照载体inhibitor-NC,miR-124 inhibitor组转染miR-124 inhibitor,miR-124 inhibitor联合DAPT组转染miR-124 inhibitor,并加入DAPT使其终浓度为5 μmol/L。转染48 h后,采用CCK-8法检测增殖能力;经诱导液诱导2周后,采用对-硝基苯磷酸盐（P-NPP）法检测碱性磷酸酶（ALP）活性;茜素红染色法检测钙化结节面积;Western印迹法检测细胞中发状分裂相关增强子1（HEY1）、发状分裂相关增强子2（HEY2）和细胞周期蛋白D1基因（CCND1）蛋白表达量。采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 与空白组、空载组相比,miR-124 inhibitor组CCK-8 24、48、72 h A₄₅₀值,ALP活性A₄₅₀值,钙化结节面积构成比和HEY1、HEY2、CCND1蛋白表达量显著升高（P<0.05）;与miR-124 inhibitor组相比,miR-124 inhibitor联合DAPT组CCK-8 24、48、72 h A₄₅₀值、ALP活性A₄₅₀值、钙化结节面积构成比和HEY1、HEY2、CCND1蛋白表达量显著降低（P<0.05）。结论: 下调miR-124可促进DPSCs成骨分化,推测其作用机制与激活Notch信号通路有关。     

淫羊藿次苷对犬颌骨间充质干细胞增殖与成骨分化的影响

目的 研究淫羊藿次苷Ⅱ（Icarisid Ⅱ,ICSII）对体外培养的比格犬颌骨间充质干细胞（alveolar bone-derived stem cells, AMSCs）增殖与成骨分化的影响。方法 取比格犬颌骨骨片,体外分离培养出dAMSCs,传代至第4代,做多向分化鉴定。以10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9 mol/L浓度的ICSII刺激dAMSCs后,取1、3、5、7 d的细胞,分别用CCK-8及碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测dAMSCs的增殖及ALP活性;用10^-6 mol/L的ICSII处理dAMSCs后14 d,作ALP染色,21 d时作茜素红染色,以判断ICSII对细胞分化及矿化能力的影响。在成骨诱导及10^-6 mol/L的ICSII药物诱导第4、8天后,用蛋白免疫印迹试验分析成骨相关蛋白OSX、Runx-2及OCN的表达量;在诱导第6天时,利用RT-PCR分析成骨相关基因OSX、bFGF、Runx-2及OCN的表达情况。采用SPSS 22.0软件包进行统计分析。结果 原代培养的dAMSCs贴壁生长,呈梭形,具备多向分化能力;ICSII在不同浓度下均可促进dAMSCs的增殖,其ALP活性亦有提高,且在实验浓度时可观察到钙结节形成。各成骨相关基因在ICSII诱导后表达量有不同程度增加,均高于完全培养基组。随着时间延长,加药组Runx-2蛋白表达量有所下降, OCN蛋白表达量逐渐增多,与对照组差距加大;OSX的蛋白表达量虽高于对照组,但无统计学差异。结论 ICSII可促进dAMSCs的增殖及成骨分化。     

组蛋白去甲基化酶FBXL11抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化

目的 研究组蛋白去甲基化酶FBXL11对牙髓干细胞定向分化能力的影响.方法 成骨分化诱导培养基诱导牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化.逆转录病毒转染构建过表达FBXL11的牙髓干细胞稳定转染细胞,进行FBXL11获得性功能研究.碱性磷酸酶活性实验及碱性磷酸酶染色检测成骨/成牙本质分化早期分化指标-碱性磷酸酶活性.茜素红染色及钙离子定量分析检测牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化能力.实时定量RT-PCR检测FBXL11及成骨/成牙本质分化相关基因-骨涎蛋白、骨桥蛋白和骨钙素的表达.结果 成骨诱导牙髓干细胞抑制FBXL11的表达.过表达FBXL11明显抑制牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性、牙髓干细胞体外矿化能力以及骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达.结论 组蛋白去甲基化酶FBXL11具有抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化的潜能.     

犬牙髓干细胞的分离培养与鉴定

目的：分离培养犬牙髓干细胞（cDPSCs）。方法：取犬磨牙获取牙髓,采用酶消法和组织块法取原代牙髓细胞,观察计数;免疫荧光和流式法鉴定细胞蛋白表达;进行成牙本质、成脂诱导。结果：酶消法和组织块法均可获得贴壁、集落生长的梭形细胞并稳定增殖。细胞克隆形成率为（15．17％±2．79％）。流式细胞术观察：CD90（24．43％±7．10％）、STRO-1（20．67％±1．42％）、CD24（2．03％±0．06％）、CD34阴性。免疫荧光法观察：Nestin,Vimentin 表达阳性、ALP 表达弱阳性、DSP 表达阴性或微弱阳性。成牙本质诱导见矿化结节,ALP 与 DSP 阳性。成脂诱导后细胞质见大量脂滴。结论：犬健康年轻磨牙牙髓组织中可稳定分离培养出具有一定克隆能力的 cDPSCs。