紫外线B照射在抑制人视网膜色素上皮细胞自噬中的作用

目的　探讨紫外线B(ultraviolet B,UVB)照射在抑制人视网膜色素上皮细胞株ARPE-19细胞自噬中的作用。方法　不同剂量UVB照射ARPE-19细胞后不同时间收集细胞,应用MTT法检测UVB照射对细胞存活的影响;Western blot检测细胞中自噬蛋白LC3的表达及LC3-II/LC3-I比率、Beclin-1蛋白表达水平;应用细胞自噬增强剂雷帕霉素（rapamycin,RAPA）和细胞自噬抑制剂氯化铵（NH₄Cl）进一步验证UVB照射对于细胞自噬的调节;采用环氧霉素（epoxomicin,EPO）检测泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)对于UVB作用的影响。MTT法检测细胞自噬变化对于细胞生存的影响。结果　UVB照射组诱导细胞剂量依赖性的死亡,100 mJ·cm^-2 UVB照射后24 h细胞出现明显死亡,和对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）;200 mJ·cm^-2 UVB照射后24 h和对照组相比差异有显著统计学意义(P<0.01);两种剂量的UVB照射后48 h细胞有一定程度的恢复。和对照组相比,UVB照射组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比率和Beclin-1蛋白表达水平均降低（均为P<0.05)。和UVB照射组相比,UVB+RAPA组ARPE-19细胞中明显升高了LC3-II/LC3-I比率,UVB+NH₄Cl组进一步降低了LC3-II/LC3-I比率,RAPA和NH₄Cl在一定程度上恢复了UVB照射降低的Beclin-1蛋白表达水平（均为P<0.05)。和对照组相比,EPO组明显增加了ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比率、升高了Beclin-1蛋白表达水平（均为P<0.05)。与UVB照射组相比,UVB+EPO组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比率无明显改变(P>0.05),而Beclin-1蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,RAPA组细胞死亡率增多,两组间差异有统计学意义（P<0.05）,NH₄Cl组细胞无明显死亡,与UVB照射组相比,UVB+RAPA组和UVB+NH₄Cl组细胞死亡率均无明显改变（均为P>0.05）。细胞自噬的改变不能逆转UVB诱导的ARPE-19细胞死亡。结论　UVB照射抑制了ARPE-19细胞自噬的启动及自噬流,UPS的改变不影响UVB对于自噬流的抑制。UVB照射可通过减少RPE细胞、损害细胞自噬能力增加RPE细胞变性,增加年龄相关性黄斑变性发生的风险。     

视网膜色素上皮细胞 LncRNA MEG3在不同葡萄糖浓度下的表达情况及对VEGF和 TGF-β1表达的影响

目的　探讨长链非编码RNA母系表达基因3（LncRNA MEG3）在不同浓度葡萄糖下表达情况及对血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响。 方法　按照不同浓度d-葡萄糖培养ARPE-19细胞,随机分为5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、30 mmol·L^-1d-葡萄糖组。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测各组ARPE-19细胞LncRNA MEG3、VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平。ARPE-19细胞转染PCDNA-MEG3及PCDNA-NC质粒,建立LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞及转染空质粒的ARPE-19细胞。以含30 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM分别培养以下各组ARPE-19细胞:LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞(O组);转染空质粒的ARPE-19细胞（NC组）;加入PBS的正常ARPE-19细胞(G组);同时以含5 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM培养正常ARPE-19细胞（C组）;以上各组细胞培养24 h后,采用RT-qPCR法及Western blot法检测各组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白的相对表达水平。 结果　与5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组和30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与G组和NC组比较,O组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白相对表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论　高糖下调ARPE-19细胞LncRNA MEG3的表达,上调VEGF和 TGF-β1的表达。LncRNA MEG3过表达降低高糖诱导的VEGF和 TGF-β1表达的升高。LncRNA MEG3可能通过抑制VEGF和 TGF-β1的表达调节糖尿病视网膜病变的发展。     

OTUD6B-AS1通过miR-21-5p对高糖诱导的ARPE-19细胞增殖、迁移的影响

目的　探讨高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19)中含有卵巢肿瘤结构域的6B反义RNA 1(OTUD6B-AS1)的功能及其作用机制。方法　取ARPE-19细胞,加入含30 mmol·L^-1葡萄糖的培养基培养,设为高糖组,另取ARPE-19细胞不做任何处理设为对照组。用Lipofectamine^TM 2000转染试剂分别将过表达空质粒（pcDNA-NC组）、OTUD6B-AS1过表达质粒（pcDNA-OTUD6B-AS1组）和OTUD6B-AS1过表达质粒＋miR-21-5p 模拟物（pcDNA-OTUD6B-AS1+miR-21-5p mimics组）转染进高糖诱导的ARPE-19细胞。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测细胞中OTUD6B-AS1和miR-21-5p的表达;用CCK-8法检测各组细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况;细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力;荧光素酶报告基因实验验证OTUD6B-AS1与miR-21-5p的靶向关系。结果　与对照组比较,高糖组ARPE-19细胞中OTUD6B-AS1表达量显著降低、miR-21-5p表达量显著升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与对照组比较,高糖组细胞凋亡率显著升高,细胞增殖率和迁移率均显著降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05）。与pcDNA-NC组比较,pcDNA-OTUD6B-AS1组中细胞增殖率和迁移率显著升高,细胞凋亡率显著降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验显示,OTUD6B-AS1可靶向miR-21-5p。与pcDNA-OTUD6B-AS1组比较,pcDNA-OTUD6B-AS1＋miR-21-5p mimics组细胞凋亡率显著升高,细胞增殖率和迁移率显著降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05）。结论　OTUD6B-AS1可抑制高糖诱导的ARPE-19细胞凋亡,并促进细胞增殖和迁移,其作用机制与miR-21-5p有关。     

黄芪甲苷对蓝光诱导损伤的视网膜色素上皮细胞的保护作用及其机制

目的　探讨黄芪甲苷（AS-IV）对蓝光诱导损伤的视网膜色素上皮细胞的保护作用及其机制。方法　将传代后的ARPE-19细胞分为5组。空白组:在暗环境中培养细胞,不采用蓝光照射;光照组:采用辐射强度为(4.0±0.5) mW·cm^-2的蓝光照射细胞4 h;光照+AS-IV组:采用相同辐射强度的蓝光照射4 h +50 mg·L^-1 AS-IV培养细胞24 h;光照+AS-IV+siNC组:将细胞转染对照siRNA后,采用相同辐射强度蓝光照射4 h +50 mg·L^-1 AS-IV培养细胞24 h;光照+AS-IV+siPINK1组:将细胞转染siPINK1后,采用相同辐射强度蓝光照射4 h +50 mg·L^-1 AS-IV培养细胞24 h。采用CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位,DHE荧光探针法检测细胞内活性氧（ROS）含量,Western blot检测蛋白表达。结果　当连续蓝光照射4 h以上,ARPE-19细胞存活率均低于80%,故选择照射时间为4 h进行后续实验。光照+AS-IV组细胞存活率明显高于光照组［（93.85±1.79）%、（79.24±3.25）%,t=11.141、P<0.001］。光照+AS-IV组细胞凋亡率明显低于光照组［（11.03±1.65）%、（27.85±3.44）%,t=12.472、P<0.001］。光照组细胞线粒体膜电位高于空白组（绿/红色荧光强度比值分别为1.72±0.25、0.58±0.07,t=12.418、P<0.001）,但是光照+AS-IV组细胞线粒体膜电位（绿/红色荧光强度比值为0.81±0.10)则低于光照组（t=9.559、P<0.001）。光照+AS-IV组细胞ROS含量少于光照组（t=6.341、P<0.001）。蓝光照射4 h后,光照+AS-IV组ARPE-19细胞PINK1蛋白（1.18±0.14,t=9.035、P<0.001）和Parkin蛋白（0.77±0.09,t=8.106、P<0.001）相对表达量则明显高于光照组。与光照组相比,光照+AS-IV组ARPE-19细胞的细胞质细胞色素C（Cyt C）蛋白相对表达量降低至0.67±0.08（t=17.059、P<0.001）,线粒体Cyt C蛋白相对表达量升高至0.16±0.03（t=5.491、P<0.001）,总蛋白中LC3B-II/I蛋白表达比值升高至3.44±0.27（t=34.047、P<0.001）。与光照+AS-IV组相比,光照+AS-IV+siNC组ARPE-19细胞的细胞质和线粒体Cyt C蛋白相对表达量（0.70±0.09、0.15±0.03）、总蛋白中LC3B-II/I蛋白表达比值（3.26±0.33）差异均无统计学意义（均为P>0.05）,而光照+AS-IV+siPINK1组ARPE-19细胞的细胞质Cyt C蛋白相对表达量（1.20±0.15）较光照+AS-IV+siNC组升高（t=8.085、P<0.001）,线粒体Cyt C蛋白相对表达量降低至0.02±0.01（t=11.628、P<0.001）,总蛋白中LC3B-II/I蛋白表达比值则降低至0.85±0.13（t=19.224、P<0.001）。结论　AS-IV对蓝光诱导损伤的视网膜色素上皮细胞具有一定的保护作用,可抑制细胞产生大量ROS,缓解细胞线粒体损伤和细胞凋亡,维持细胞活力和自噬过程,其机制可能与AS-IV上调细胞PINK1/Parkin信号通路有关。     

miR-181a靶向沉默信息调节因子相关酶1在过氧化氢诱导的人小梁网细胞氧化应激中的调节作用

目的　探讨miR-181a对过氧化氢（H₂O₂）诱导的人小梁网细胞（HTMCs)氧化应激的调节作用及其机制。方法　HTMCs随机分为空白组（0 μmol·L^-1 H₂O₂）、200 μmol·L^-1 H₂O₂组、400 μmol·L^-1 H₂O₂组、600 μmol·L^-1 H₂O₂组,分别使用相应浓度H₂O₂处理HTMCs,24 h后MTT法检测各组细胞存活率,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测各组细胞miR-181a mRNA表达,Western blot检测各组细胞中沉默信息调节因子相关酶1（SIRT1）蛋白表达。根据转染物的不同分为miR-181a inhibitor组、miR-181a NC组、miR-181a mimics组、miR-181a inhibitor+si-SIRT1组和miR-181a inhibitor+si-NC组,使用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针检测各组细胞内活性氧（ROS）含量,使用超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）ELISA试剂盒检测各组细胞SOD和MDA活性,使用Annexin V FITC/PI联合流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测各组细胞中SIRT1蛋白表达,双荧光素酶报告基因实验对靶点进行验证。结果　与空白组比较,200 μmol·L^-1 H₂O₂组、400 μmol·L^-1 H₂O₂组、600 μmol·L^-1 H₂O₂组细胞存活率均降低（均为P<0.05）。细胞miR-181a mRNA的表达随着H₂O₂浓度的增加而增加,SIRT1蛋白的表达随着H₂O₂浓度的增加而降低（均为P<0.05）。与miR-181a NC组比较,miR-181a mimics组细胞凋亡率、MDA活性和ROS含量均升高,细胞SOD活性、SIRT1蛋白表达均降低,miR-181a inhibitor组细胞凋亡率、MDA活性和ROS含量均降低,细胞SOD活性、SIRT1蛋白表达均升高（均为P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-181a靶向抑制SIRT1蛋白的表达。与miR-181a inhibitor+si-NC组比较,miR-181a inhibitor+si-SIRT1组细胞凋亡率、MDA活性和ROS含量均升高,SOD活性降低（均为P<0.05）。结论　miR-181a可能通过靶向SIRT1调节H₂O₂诱导的HTMCs氧化应激作用。     

高糖对人晶状体上皮细胞沉默信号调节蛋白6（SIRT6）表达的影响

目的　观察高浓度葡萄糖对人晶状体上皮细胞(SRA01/04)活性及沉默信号调节蛋白6（SIRT6）表达的影响。方法　将SRA01/04细胞在不同葡萄糖浓度（5.5 mmol·L^-1、15.5 mmol·L^-1、25.5 mmol·L^-1、35.5 mmol·L^-1、45.5 mmol·L^-1、55.5 mmol·L^-1、75.5 mmol·L^-1）培养基中培养48 h后,用光镜观察SRA01/04细胞形态;CCK-8试剂盒检测各组细胞的活性;Western blot检测各组细胞SIRT6蛋白的表达水平。然后将SRA01/04细胞用55.5 mmol·L^-1葡萄糖干预,培养不同时间（0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h）后,Western blot检测不同时间SRA01/04细胞SIRT6蛋白表达水平。免疫荧光技术检测对照组（5.5 mmol·L^-1葡萄糖）和高糖组（55.5 mmol·L^-1葡萄糖）细胞的SIRT6蛋白表达情况。结果　随着葡萄糖浓度增加,SRA01/04细胞的数量逐渐降低。CCK-8检测结果显示,与5.5 mmol·L^-1葡萄糖组相比,随着葡萄糖浓度增加,SRA01/04细胞的活性逐渐降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。Western blot检测结果显示,SRA01/04细胞的SIRT6蛋白表达与葡萄糖呈浓度和时间依赖性,45.5 mmol·L^-1、55.5 mmol·L^-1、75.5 mmol·L^-1葡萄糖组与5.5 mmol·L^-1葡萄糖组比较,以及24 h组、48 h组和72 h组与0 h组比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。细胞免疫荧光结果显示,SRA01/04细胞中的SIRT6蛋白主要在细胞核表达,高糖组SRA01/04细胞中SIRT6蛋白表达较对照组显著降低（P<0.05),且高糖组细胞核出现明显的核固缩和核碎裂现象。结论　高浓度葡萄糖可以降低SRA01/04细胞的增殖活性,降低SIRT6蛋白的表达水平。     

褪黑素联合锌对H2O2诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的　探讨褪黑素（MT）联合锌（Zn）对H₂O₂诱导的人视网膜色素上皮（ARPE）细胞氧化损伤的保护作用。方法　常规培养ARPE细胞株（ARPE-19）,利用不同浓度H₂O₂处理ARPE-19细胞,将细胞存活率接近50%的H₂O₂浓度作为氧化损伤浓度。将ARPE-19细胞分为:不同浓度MT（10^-5 mol·L^-1、10^-6mol·L^-1、10^-7mol·L^-1）+ZnCl₂（15 μmol·L^-1）组,ZnCl₂组（采用15 μmol·L^-1 ZnCl₂培养细胞）,H₂O₂组（不添加MT和ZnCl₂培养细胞）,空白对照组（细胞不做任何处理）。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。采用试剂盒测量各组细胞内活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的含量。ELISA检测各组细胞内白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达量。结果　当H₂O₂浓度为300 μmol·L^-1时,细胞存活率为(54.31±1.91)%,此时细胞存活率接近50%,后续实验中均选择该浓度作为氧化损伤浓度。ZnCl₂组、10^-5 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-6 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-7 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞凋亡率分别为3.05%、1.17%、1.50%、1.71%,与空白对照组（0）相比差异均无统计学意义（均为P>0.05）。H₂O₂组、ZnCl₂组、10^-7mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内ROS含量分别为空白对照组的1.76倍、1.59倍、1.41倍,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;10^-5 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-6 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内ROS含量分别为空白对照组的1.13倍和1.25倍,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。H₂O₂组细胞内MDA的含量较空白对照组显著提高 （P<0.05）;ZnCl₂组、10^-5 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-6 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-7 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内MDA的含量均较空白对照组稍增加,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。H₂O₂组、ZnCl₂组、10^-7 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内IL-6和TNF-α的表达量均显著高于空白对照组,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;10^-5 mol·L^-1MT+ZnCl₂组和10^-6 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内IL-6和TNF-α的表达量均略高于空白对照组,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　MT联合Zn能有效降低H₂O₂损伤所致ARPE-19细胞内ROS的含量,随之减少细胞内MDA的含量,同时也能抑制IL-6和TNF-α的表达量,从而起到保护RPE细胞的作用。     

自噬在高糖条件下视网膜色素上皮细胞表达血管内皮生长因子促进RF/6A细胞血管生成中的作用

目的　研究高糖条件下诱导的人视网膜色素上皮细胞株（ARPE-19）自噬对其表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），及恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞（RF/6A）迁移和管腔形成的影响。方法　根据不同干预将ARPE-19细胞随机分为对照组、高糖组及3-甲基腺嘌呤（3-MA）+高糖组。对照组细胞在无糖DMEM培养基中常规培养24 h，高糖组细胞在DMEM培养基中加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h，3-MA+高糖组细胞先用10 mmol·L^-1 3-MA处理24 h，然后更换培养基再加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h。Western blot法检测细胞自噬标志性蛋白微管相关蛋白1 轻链 3（microtubule-related protein 1 light chain 3，LC3）II型和I型的比值(LC3-II/LC3-I)、Beclin-1及细胞中自噬相关基因3（autophagy-related gene 3，Atg3）的蛋白表达。ELISA法检测ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达。比较三组ARPE-19细胞LC3-II/LC3-I、Beclin-1、Atg3及VEGF的蛋白表达量。然后将以上三组ARPE-19细胞上清液分别加入RF/6A细胞培养基中，将RF/6A细胞也按以上方法分组，分别采用Transwell法及Matrigel胶法检测并比较三组RF/6A细胞迁移数及细胞管腔形成数。结果　对照组、高糖组和3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比值分别为0.405±0.095、0.932±0.024和0.635±0.048；Beclin-1蛋白相对表达量分别为0.205±0.035、0.590±0.120和0.425±0.082；Atg3蛋白相对表达量分别为0.277±0.035、0.539±0.071和0.389±0.019。ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达量三组分别为（44.03±9.08）ng·L^-1、（205.70±17.90）ng·L^-1和（112.52±21.06）ng·L^-1；RF/6A细胞迁移数三组分别为（125.60±6.35）个、（153.60±19.20）个和（67.40±7.95）个；细胞管腔形成数三组分别为（12.22±0.84）个、（18.44±1.68）个和（5.44±0.51）个；整体比较差异均有统计学意义（均为P<0.01）。与对照组相比，高糖组ARPE-19细胞的LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1及Atg3蛋白相对表达量均明显增加（均为P<0.01），VEGF表达水平均明显升高（P<0.01），RF/6A细胞迁移数和管腔形成数均明显增加（均为P<0.01），3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/I比值、Beclin-1和Atg3蛋白相对表达量、VEGF表达量、RF/6A细胞迁移数和细胞管腔形成数均较高糖组明显降低（均为P<0.01）。结论　高糖激活ARPE-19细胞自噬，进而上调VEGF的表达并促进RF/6A细胞迁移和管腔形成，自噬抑制剂3-MA可抑制ARPE-19细胞自噬，并下调VEGF的表达从而抑制RF/6A细胞的血管形成能力。     

杞黄颗粒对H2O2诱导的人视网膜色素上皮细胞炎症损伤的保护作用

目的　探讨杞黄颗粒（QHG）对H₂O₂诱导的人视网膜色素上皮（RPE）细胞系ARPE-19炎症损伤的保护作用。方法　常规培养ARPE-19细胞,随机分为对照组、H₂O₂损伤组(200 μmol?L^-1 H₂O₂处理细胞）、QHG低剂量组（1 g?L^-1 QHG作用24 h后再加入H₂O₂处理细胞）和QHG高剂量组（2 g?L^-1QHG作用24 h后再加入H₂O₂处理细胞）。使用相差显微镜观察各组ARPE-19细胞形态;流式细胞仪检测各组ARPE-19细胞凋亡率,Real-time PCR检测各组ARPE-19细胞β淀粉样蛋白（Aβ)mRNA表达,ELISA检测各组ARPE-19细胞Aβ以及攻膜复合物（MAC）的蛋白表达水平。结果　相差显微镜下可见,QHG低剂量组、QHG高剂量组ARPE-19细胞形态改变均较H₂O₂损伤组轻。对照组、H₂O₂损伤组、QHG低剂量组、QHG高剂量组ARPE-19细胞凋亡率分别为（6.85±0.14）%、（43.60±1.80）%、（23.23±1.43）%、（17.90±0.78）%,H₂O₂损伤组细胞凋亡率较对照组明显增加,QHG低剂量组及QHG高剂量组细胞凋亡率均较H₂O₂损伤组明显降低,且QHG高剂量组较QHG低剂量组降低更明显,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与对照组相比,H₂O₂损伤组ARPE-19细胞Aβ mRNA及Aβ、MAC蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义（均为P<0.01）。与H₂O₂损伤组相比,QHG低剂量组及QHG高剂量组均可明显降低ARPE-19细胞Aβ mRNA 相对表达量及Aβ、MAC蛋白的表达水平,差异均有统计学意义（均为P<0.01）。结论　QHG能有效抑制H₂O₂诱导的人RPE细胞凋亡,减少细胞Aβ及MAC表达,从而起到保护人RPE细胞的作用。     

视网膜色素上皮细胞通过分泌含有miR-4488的外泌体抑制糖尿病视网膜病变进展的机制研究

目的　探讨视网膜色素上皮细胞通过分泌含有miR-4488的外泌体抑制糖尿病视网膜病变进展的分子机制。方法　将人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞分为空白组、高糖组。将人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）分为NG组、HG组、NG+外泌体组和HG+外泌体组。空白组、NG组和NG+外泌体组细胞用含5.5 mmol·L^-1正常浓度葡萄糖的培养基培养24 h;高糖组、HG组和HG+外泌体组细胞用含30 mmol·L^-1高浓度葡萄糖的培养基培养24 h;NG+外泌体组和HG+外泌体组细胞在培养基中分别加入空白组或高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体40 μg·L^-1。PKH67绿色荧光标记外泌体;利用CCK-8法、Transwell小室法检测HRMECs增殖、迁移和血管生成。取空白组和高糖组ARPE-19细胞外泌体进行miRNA微阵列分析。采用双荧光素酶报告分析检测miR-4488和转化生长因子β受体Ⅱ（TGFβR2）基因序列的靶向关系。采用Western blot或免疫荧光染色检测各组HRMECs中TGFβR2、Smad2、p-Smad2ser467或Desmin、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。结果　空白组和高糖组ARPE-19细胞分泌的被PKH67标记的外泌体加入培养基后都可被HRMECs吸收。与NG组相比,HG组HRMECs细胞增殖率、迁移率、血管结点数和血管总长度、TGFβR2和p-Smad2ser467蛋白表达量、Desmin和α-SMA蛋白荧光强度均增加（均为P<0.05）;与HG组相比,HG+外泌体组上述指标均被逆转（均为P<0.05）;NG+外泌体组与NG组上述指标相比差异均无统计学意义（均为P>0.05）。与空白组相比,高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体中miR-4488相对表达量增加,且miR-4488模拟物和TGFβR2wt共转染可增加双荧光素酶活性（均为P<0.05）。结论　在高糖条件下,ARPE-19细胞释放的外泌体可通过miR-4488/TGFβR2/Smad信号通路抑制HRMECs间充质转化。     

纳豆激酶对高糖缺氧诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

目的 探讨纳豆激酶(NK)对高糖缺氧导致的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)损伤的保护作用。方法 不同浓度的葡萄糖和氯化钴(CoCl₂)诱导培养ARPE-19细胞24 h后,观察细胞形态变化,采用CCK-8法检测ARPE-19细胞活性。Western blot和RT-qPCR检测紧密连接蛋白-1(ZO-1)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、白细胞介素(IL)-1β、IL-18的表达情况,筛选最佳葡萄糖和CoCl₂浓度构建体外高糖缺氧的细胞模型。CCK-8法筛选合适的NK浓度,将ARPE-19细胞分为正常糖组(5.5 mmol·L^-1葡萄糖,NC组)、高糖+CoCl₂组(25.0 mmol·L^-1葡萄糖+200μmol·L^-1 CoCl₂,HG+CoCl₂组)和NK处理组(1.0μmol·L^-1 NK+25.0 mmol·L^-1葡...     

潜伏转化生长因子β结合蛋白2(LTBP2)对氧化型低密度脂蛋白诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的影响

目的 探索潜伏转化生长因子 β结合蛋白2(LTBP2)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人视网膜色素上皮(ARPE)细胞氧化损伤的影响.方法 0 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1和200 mg·L-1 ox-LDL处理ARPE-19细胞,CCK-8试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒检测细胞活力和凋...     

自噬激活剂雷帕霉素对A2E诱导视网膜色素上皮细胞自噬调节的影响

目的 探讨自噬激活剂雷帕霉素对N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬调节的影响。方法 取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)进行培养。将细胞分为4组,其中,对照组：使用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组：使用含20μmol·L^-1 A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素组：使用含100 nmol·L^-1雷帕霉素的DMEM-F12完全培养基预处理细胞1 h后,再用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素联合A2E组：使用100 nmol·L^-1雷帕霉素预处理细胞1 h后,再用含20μmol·L^-1 A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞。使用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,Procarta细胞因子分析试剂盒检测各组细胞培养上清液中细胞因子表达情况。透射电镜观察各组细胞超微结构,Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白Beclin-1和P62的表达,免疫荧光染色法检测...     

自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对A2E诱导视网膜色素上皮细胞自噬的调节以及相关细胞因子表达的影响

目的 探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2 E)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬的调节以及相关细胞因子表达的影响.方法 取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)进行培养.将细胞分为4组.对照组:仅使用正常DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组:将ARPE-...     

Bax抑制因子1对紫外线B诱导下人晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用

目的 探讨Bax抑制因子1(BI-1)对紫外线B(UVB)诱导下人晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用.方法 取对数生长期的人晶状体上皮细胞(HLEC)系SRA01/04细胞,将BI-1过表达质粒及其空载质粒转染至SRA01/04细胞中,分别记为BI-1组、Vector组,另取不做任何处理的SRA01/04细胞作为blank组...     

脂褐素成分A2E诱导人视网膜色素上皮细胞自噬及损伤的研究

目的 探讨N-亚视黄基-N-视黄基-乙醇胺(A2 E)能否诱导人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)的自噬及损伤反应,并从自噬的角度探索其与年龄相关性黄斑变性(AMD)发病相关的分子机制.方法 CCK-8法筛选A2E作用于ARPE-19细胞的最佳浓度用于后续实验.采用多重细胞因子检测技术检测A2E作用于ARPE-1...