星形孢菌素产生菌电转化条件的优化及其高产菌株的构建

目的 提高星形孢菌素的产量。方法 本研究以星形孢菌素产生菌(Streptomyces sp. ST-07)为出发菌株，采用电转化方法和应用PCR扩增星形孢菌素生物合成的调控基因staR，成功构建含不同启动子(kasO*p和ermE*p)的加强表达staR基因的重组工程菌，分别命名为ST-D-5和ST-H-23。结果 通过对电转化条件的甘氨酸浓度、电场强度、菌丝体浓度、质粒浓度、孵育时间和孵育温度等关键参数优化，使电转化的效率从4×10⁶提高至9.6×10⁸(CFU/μg DNA)；工程菌摇瓶发酵结果表明，与星孢菌素原始菌株ST-07相比，采用kasO*p启动子构建的工程菌ST-D-5星形孢菌素的产量提高了17%，最高单位可达923 mg/L。结论 本文系统摸索了星形孢菌素产生菌的电转化条件，显著提高了电转化效率，不但为该菌株的高产遗传改造奠定了基础，而且对其他放线菌的遗传操作体系建立提供了有益借鉴。     

高产量非达霉素工程菌的构建及其发酵优化

本试验将橙色指包囊菌(Dactylosporangium aurantiacum)NRRL 18085中的非达霉素生物合成基因簇与本实验室保存的德干高原游动放线菌(Actinoplanes deccanensis) SIPI-XR01的测序结果进行对比,找到SIPI-XR01中含有与已报道的合成基因簇中编码LuxR家族调节因子的转录激活因子tiaR1基因类似的基因片段,并将其命名为xrr1,根据该基因设计引物,并通过PCR扩增和质粒构建的方法将其整合到菌株基因组上,成功构建了过量表达xrr1工程菌,命名为SIPIXR02。结果表明SIPI-XR02相比SIPI-XR01产量有明显提高,经过培养基碳氮源优化后摇瓶产量最高可达4592μg/ml,并随后在10 L发酵罐上进行验证,发酵后产量达到3 930μg/ml,具有工业应用价值。     

重组水蛭素Ⅲ的工程菌的培养及高密度发酵

为提高重组水蛭素Ⅲ工程菌的产水蛭素量，采用正交实验法确定了较佳培养基组分，优化了摇瓶发酵工艺和发酵条件，工程菌摇瓶水蛭素产量稳定在2000ATU／ml左右，30L发酵罐批式发酵水蛭素产量达到4000ATU／ml，补料一批式发酵水蛭素产量达到8000ATU／ml。     

四霉素A组分高含量基因工程菌的构建

目的通过阻断不吸水链霉菌S91中的四霉素生物合成途径P450单加氧酶基因ttm D,获得四霉素A组分高含量基因工程菌株。方法构建大肠杆菌-链霉菌穿梭重组质粒p KC-D3,通过接合转移将缺失592 bp的ttm D基因以双交换的方式置换不吸水链霉菌S91染色体的ttm D基因,采用摇瓶发酵,采用HPLC检测发酵液中四霉素的组分含量。结果 ttm D基因阻断菌株不吸水链霉菌S91-D不再产生四霉素B,获得了四霉素A高含量的菌株,四霉素A产量提高了47%。结论将不吸水链霉菌S91中的ttm D基因失活,可以阻断四霉素A生成四霉素B,从而提高四霉素A的含量及产量。     

重组复合干扰素摇瓶发酵条件的研究

目的对表达重组复合干扰素(con-IFN)的工程菌E.coli DH5α的摇瓶发酵条件进行研究。方法利用单因素比较实验及正交试验等方法考查工程菌摇瓶发酵条件,探讨发酵条件对工程菌的生长和con-IFN表达的影响。结果优化后条件为培养基含玉米粉6%、牛肉膏5.5%、谷氨酸钠0.5%,发酵液初始pH 7.2,30℃培养7 h后升温至42℃诱导表达6 h,转速220r/min,装样量10%,接种量2%。结论优化后平均蛋白质表达量达到36.39%,和LB培养基相比,目的蛋白质表达量提高了4.8%,为工程菌的大规模发酵提供参考。     

头霉素C基因簇大片段敲除促进克拉维酸合成

摘要：目的 本研究以棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)F613-1为出发菌株，构建头霉素C基因簇中orf10、blp、lat、pcbAB和pcbC 5个完整基因片段(cep)的基因缺失突变菌株，探究头霉素C和克拉维酸(clavulanic acid，CA)生物合成的关系。方法 通过生物活性测定法检测出发菌株F613-1和两株cep片段基因缺失突变菌株(△cep::apra-2和△cep::apra-4)中的头霉素C产量，同时通过HPLC检测上述菌株的生物量以及CA产量，分析头霉素C和CA生物合成之间的关系。结果 与出发菌株F613-1相比，△cep::apra-2和△cep::apra-4菌株的表型没有明显变化；固体发酵168h，F613-1菌株中头霉素C产量为0.8875g/L，△cep::apra-2和△cep::apra-4菌株中的头霉素C产量均为0；液体发酵144h，突变菌株△cep::apra-2和△cep::apra-4中CA产量的分别为4.28和4.26g/L，较F613-1(3.16g/L)分别提高了35%和34%。结论 在头霉素C生物合成能力缺失的情况下，CA产量明显提高，说明头霉素C和CA的生物合成存在明显的竞争作用，这对于探究CA与头霉素C生物合成之间的关系提供有力的证据，并且为提高CA产量提供新思路，对CA的工业生产有一定的指导意义。     

双拷贝tylD、tylF和tylJ弗氏链霉菌工程菌株构建及其发酵性能研究

以弗氏链霉菌工业生产菌株基因组DNA为模板，扩增泰乐星生物合成及组分转化关键基因tylD、tylF和tylJ，构建双拷贝tylD、tylF、tylJ弗氏链霉菌工程菌株。通过摇瓶发酵验证了工程菌株泰乐菌素发酵效价，并对筛选的一株工程菌利用荧光定量PCR检测其tylD、tylF和tylJ基因表达情况。研究结果表明，双拷贝tylD、tylF、tylJ弗氏链霉菌工程菌株泰乐菌素摇瓶发酵效价较出发菌株最高提高了28.1%，该菌株tylD、tylF、tylJ表达水平高于出发菌株，并且在进入稳定期后期表达量达到最大值。构建双拷贝tylD、tylF、tylJ弗氏链霉菌工程菌株可解除泰乐菌素合成限速环节，大幅度的提高泰乐菌素产量。     

农杆菌转化法高效构建顶头孢霉sorA和sorB双缺失菌株提高头孢菌素C产量

目的 获得顶头孢霉sorA和sorB双缺失菌株，以阻断sorbicillinoids的合成，并研究其与头孢菌素C(CPC)产量的关系。方法 通过根癌农杆菌转化法，依据同源双交换的原理，同时敲除合成sorbicillinoids骨架结构的两个聚酮合酶基因sorA和sorB，并通过摇瓶发酵实验检测缺失菌和野生菌的产量。结果 筛选并验证了6株A. chrysogenum-?pks菌株，遗传稳定，转化效率约为20%。通过发酵实验测定发现，缺失菌株产CPC能力比野生菌提高了70%。结论 农杆菌转化法是一个高效的顶头孢霉遗传操作系统，并且顶头孢霉中sorbicillinoids的缺失可以提高CPC产量。     

达托霉素高产菌株选育及发酵条件优化

目的 通过对达托霉素产生菌进行诱变选育,并对其发酵条件优化,以提高其达托霉素发酵水平,降低生产成本。方法 以玫瑰孢链霉菌(DT-9#F2)为出发菌株,分别采用紫外诱变、微波诱变、LiCl诱变及复合诱变并结合链霉素抗性筛选进行菌株选育,同时,对其发酵培养基中氮源、碳源及生长因子进行优化,以进一步提高其发酵产量。结果 得到一株达托霉素高产突变株DT-37,其摇瓶发酵产量达到12.2mg/L,较出发菌株提高20.79%;优化后的发酵培养基为：酵母粉(YP300)1.65%、FeSO4 0.043%、葡萄糖1.50%、玉米淀粉7.20%、糖蜜0.72%,VB12 1.50μg/mL、硫辛酸5.00μg/mL。其摇瓶发酵产量达到30.56mg/L,较初始培养基提高了297.92%。经100L发酵罐上放大验证,达托霉素的产量达到了2872mg/L,较优化前提高了14.88%。结论     

60Coγ射线对南昌霉素产生菌的诱变选育

采用不同剂量的^60Coγ射线，对南昌霉素产生菌南昌链霉菌80-5.3-116菌株的孢子进行处理。结果表明，7.74c/kg的诱变剂量在对孢子致死率为90％左右时，具有较好的诱变效应；初筛摇瓶产量正变率达到21.08％；复筛摇瓶发酵效价比出发菌株提高50％以上的有10株，占初筛菌株的5％；连续四批摇瓶发酵试验平均产量比出发菌株的产量提高50％以上；有6个菌株摇瓶产量分别比出发菌株提高60％，其中3株平均摇瓶产量比出发菌提高70%以上。     

利用均匀实验优化利福霉素SV发酵培养基氮源配比

应用均匀设计的方法对利福霉素SV发酵培养基中的氮源配比进行优化。研究了氮源中各成分对发酵效价的影响。确定各成分的最佳配比并用实验验证，使摇瓶发酵效价提高了10％以上。并对利福霉素SV产生菌在新、老培养基中的代谢特性进行了比较。     

费氏链霉菌脱氢酶NeoE的生物信息学分析及其对产新霉素的影响

目的 NeoE是费氏链霉菌合成新霉素途径中一种重要的NAD(P)+依赖性脱氢酶,本研究的目的是预测其生物学性质及其对新霉素合成能力的影响。方法 由NCBI网站蛋白质数据库获得NeoE氨基酸序列,利用生物信息学网站及软件分析预测其特征。随后构建neoE过表达质粒,以接合转移方式得到高产重组菌株SF-neoE。最后经摇瓶发酵以及相关基因的转录分析探究NeoE对新霉素生物合成的影响。结果 NeoE由340个氨基酸组成,理论相对分子质量约为35228.33 Da,理论pI值5.14,不存在信号肽和跨膜区,是一个疏水性的稳定胞内蛋白。对含空载质粒菌株和重组菌株摇瓶发酵与RT-qPCR分析,结果表明第48小时neoE的相对表达水平较对照菌株提高了2.1倍,且NeoE的过量表达使得新霉素效价提高42%。结论 该结果为提高新霉素效价提供思路,并为后续定向改造NeoE探究其对费氏链霉菌生长代谢的影响奠定理论基础。     

12C离子束辐射选育庆大霉素高产菌株及其罐发酵水平

采用^12C离子束对庆大霉素产生菌23-18^#进行诱变，通过大量摇瓶筛选，选出5株进行2T罐中试，通过中试，选出2株高产变株在50T罐放大试验中发酵水平较出发菌株有重大突破，发酵水平及批总亿均提高10％以上。     

新型常压室温等离子体-紫外复合诱变选育埃莎霉素I高产菌株#br#

目的 通过对埃莎霉素Ⅰ产生菌WSJ-IA进行诱变选育研究,以期获得埃莎霉素Ⅰ高产菌株。方法 使用多功能等离子体诱变系统(multifunctional plasma mutagenesis system, MPMS)对出发菌株的孢子进行等离子体和紫外复合诱变,设定不同的诱变时间处理孢子悬液,通过致死率确定合适的诱变条件,利用突变株摇瓶发酵效价筛选出正突变菌株。结果 在MPMS射频功率为100W,处理距离5mm,气体流量12.5SLM,等离子体-紫外辐射时间为50s时,菌株致死率为96.08%。在此诱变条件下,以突变株的初筛效价为指标的突变率、正突变率分别达到63.96%和22.52%,复筛效价是出发菌株1.5倍以上的有5株,占复筛菌株的9%。最终筛选出一株发酵单位比出发菌株提高221%、埃莎霉素Ⅰ组分含量提高192%的正突变株IA-425。42L自动发酵罐发酵结果表明,该菌株埃莎霉素Ⅰ产量达到(2000±200)μg/mL左右。结论 新型等离子体复合紫外诱变方式,可有效提高菌株的埃莎霉素Ⅰ发酵产量和组分含量。这为埃莎霉素Ⅰ的大规模发酵和临床前研究奠定了良好基础。     

青霉素高产菌株的理性筛选

以青霉素生产菌种87117#为出发菌种，采用紫外线诱变复合前体动态后处理的方法，结合限氧条件下的摇瓶筛选，从177支前体抗性株中筛出XY-137#高产突变株。该菌株摇瓶效价平均提高了8．8％，且遗传特性稳定，单位菌丝产物合成能力强。XY-137#菌株在百吨罐中经过近百批的生产验证，其放罐效价、发酵指数、罐批产量平均提高了3．83％、5．66%和2．69％。     

响应面法优化替考拉宁发酵培养基及其扩大培养

目的 通过响应面法,优化替考拉宁发酵培养基,并对发酵工艺参数进行优化,来提高其发酵产量。方法 以游动放线菌TC19-3p-103为试验菌株,采用单因素试验确定发酵培养基考察因素的参考范围;利用最陡爬坡试验确定响应面试验的中心区域;利用Box-Behnken响应面法,确定了发酵培养基中的有机氮源最佳浓度组合;并对起始搅拌转速与通气量这两个发酵工艺参数进行单因素考察;在发酵过程中,采用流加技术控制碳源浓度。结果 经优化的发酵培养基,其摇瓶产量提高了31.6%;50L罐发酵工艺参数优化后,发酵水平达到8558 mg/L。结论 优化后的发酵工艺,显著提高了替考拉宁的产量,为其工业化生产奠定了基础。     

替考拉宁高产菌选育及发酵条件优化

摘要：目的 获得一株稳定遗传的高产新菌株,并提高替考拉宁产量。方法 以替考拉宁产生菌游动放线菌T19为出发 菌株,通过常压室温等离子(ARTP)诱变技术,获得一株具有稳定遗传性的高产新菌株,并对转速、接种量、温度和pH等发酵 条件进行了优化,确定了最佳的发酵工艺条件,从而提高了替考拉宁的产量。结果 诱变后菌株的发酵效价水平较出发菌株提 高了42%;在转速为220 r/min,接种量为7.5%,温度为28℃,pH为6.5时,该菌株发酵效价水平比出发菌株提高了80%。结论 ARTP诱变技术可有效用于游动放线菌的诱变选育,可大幅度提高替考拉宁的产量,为其工业化生产奠定了基础。     

海洋小单孢菌株产抗肿瘤新化合物FW05-0328-1的诱变#br# 选育及发酵工艺研究

目的 获得抗肿瘤化合物FW05-0328-1高产菌株,提高其发酵产量。方法 采用紫外(UV)及常压室温等离子体技术(ARTP)复合诱变筛选化合物FW05-0328-1高产菌株,结合高产菌株摇瓶发酵特性,优化100L全自动发酵罐发酵工艺。结果 获得1株高产FW05-0328-1菌株Micromonospora sp. FIM0O123,其在100L全自动发酵罐发酵效价达187.3mg/L,较原始菌株提高了17倍。结论 高产菌株的筛选及100L全自动发酵罐发酵工艺优化能有效提高化合物FW05-0328-1产生能力。