前列腺特异抗原3慢病毒表达载体的构建与包装

背景与目的：前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3,PCA3)作为一种长链非编码RNA(lncRNA)已被证实在前列腺癌中高度特异性表达,暗示其可能在前列腺癌中发挥重要作用,为深入研究,我们将完整的PCA3基因转入真核表达载体,并构建慢病毒包装系统。方法：从前列腺癌细胞株LNCaP细胞中提取总RNA,运用重叠延伸方法扩增到PCA3基因,测序正确后定向接入真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP,酶切鉴定并测序正确后进行慢病毒包装和滴度测定。结果：经PCR鉴定及测序,PCA3表达质粒序列与Gene Bank序列进行Blast比对分析,同源性为99.8%,PCA3慢病毒滴度测定为2×108。结论：PCA3成功插入真核表达载体并完成了慢病毒包装,为深入研究PCA3基因在前列腺细胞中的作用奠定了基础,进而为探索前列腺癌的治疗提供了新的途径。     

慢病毒载体及其研究进展

慢病毒载体（lentivirus vector, LV）是目前分子及细胞生物实验中非常有效的工具,在基因转染方面有着许多独特的优势,例如,对细胞是否处于有丝分裂期没有特别的要求,基因转染效率高,可容纳较大基因片段等。本文将就慢病毒载体的来源、分子特征及研究进展等进行综述。     

胃癌细胞中TWIST慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 探讨胃癌细胞中TWIST慢病毒表达载体的构建及构建。方法 参考Genbank的人TWIST基因序列设计出1对TWIST全基因扩增引物,从人胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR中扩增TWIST基因,聚合酶链反应（PCR）产物线性化克隆入慢病毒表达载体GV341中,构建重组载体GV341-TWIST。将重组载体GV341-TWIST转染至人胃癌293T细胞包装病毒,免疫荧光检测293T细胞形态改变,蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞TWIST表达水平,实时PCR法检测病毒滴度。结果 成功构建了GV341-TWIST慢病毒表达载体,经限制性酶切后出现651 bp的条带,DNA测序分析证实重组慢病毒载体GV341-TWIST的插入序列有近100%的正确率,重组慢病毒载体转染293T细胞后,Western blot检测TWIST融合蛋白为25 kD。实时PCR测定重组慢病毒载体GV341-TWIST病毒滴度2.00E+8 TU/ml。结论 本实验成功构建了人重组慢病毒载体GV341-TWIST慢病毒表达载体,在人胃癌293T细胞中高效表达了TWIST蛋白。     

miR-494慢病毒表达载体的构建

目的:构建miR-494基因的慢病毒表达载体。方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增hsa-miR-494基因,用XhoⅠ、BamHⅠ双酶切携带EGFP的慢病毒载体pGIPZ,酶切产物电泳后回收约11kb的载体片段。使用DNA连接试剂盒中的Solution I将其与miR-494连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,PCR筛选正向阳性克隆,随后将选定的含有阳性克隆的单菌落摇菌,提取质粒并行酶切鉴定及对插入的miR-494测序,所构建载体命名为pGIPZ-miR-494-eGFP,获pGIPZ-miR-494-eGFP后按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产。将慢病毒颗粒以最适滴度感染人体肺腺癌细胞株A549,通过Aldefluor流式分选出带有目的基因和空载病毒的细胞,用Real-Time PCR检测感染效率。结果:目的基因与慢病毒载体连接成功。共转染293T细胞包装病毒与浓缩后滴度达1.02×108TU/ml,并转染到肺腺癌细胞株A549上,Aldefluor流式分选出的细胞后通过Real-Time PCR检测结果显示miR-494慢病毒表达载体感染的A549细胞miR-494表达高于对照组达10倍以上。结论:成功构建携带人miR-494基因的慢病毒表达载体pGIPZ-miR-494-eGFP,为相关后续研究打下了良好基础。     

重组SV40大T抗原慢病毒表达载体的构建

目的 构建含有重组SV40大T抗原基因的慢病毒表达载体pLentiGFP-Tag,转染真核细胞Eca-9706并检测SV40大T抗原基因在真核细胞内的表达.方法 以PCR方法从含有SV40大T抗原基凶的质粒上扩增出SV40大T抗原基因作为靶基因;将其连接至pGEM-T Easy载体上,并对靶基因进行DNA测序确认;再将靶基因与慢病毒表达载体pLentiGFP重组构建成为PLentiGFP-Tag;以脂质体介导转染真核细胞Eca-9706,观察慢病毒表达载体所携带的GFP基闪在细胞内的表达,使用RT-PCR检测SV40大T抗原基因在细胞内的表达水平.结果 成功克隆SV40大T抗原基因,经由DNA测序确认;成功筛选出含SV40大T抗原基因正插子的慢病毒表达载体pLentiGFP-Tag;转染真核细胞Eca-9706后48 h,观察到绿色荧光的广泛表达并检测出宿主细胞内高效表达的SV40大T抗原mRNA.结论 成功构建含SV40大T抗原基因的慢病毒表达载体pLentiGFP-Tag,并观察到SV40大T抗原在真核细胞中的成功表达.     

CDK2AP1 基因过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建CDK2AP1基因慢病毒过表达载体,感染人口腔鳞癌细胞系SCC-25细胞系中,为CDK2API基闲体内外实验研究奠定实验基础。方法：将pCDH—CMV—GFP慢病毒载体sall和XbaI酶切位点插入CDK2APl基因序列,构建pCDH—GFP—CDK2API慢病毒质粒。经PCR鉴定、测序验证CDK2API基因后,将其和慢病毒包装质粒混合物共同转染病毒包装细胞293TN,转染24小时后产生藿组病毒GFP—CDK2API慢病毒颗粒。经病毒浓缩纯化后,感染SCC-25口腔鳞痛细胞系并测定感染效率。结果：GFP—CDK2AP1病毒中携有转染正确的CDK2API璀因,感染人SCC-25细胞系后能稳定表达。结论：成功地在舌鳞癌细胞系SCC-25中构建了CDK2APl基因的重组慢病毒过表达载体,为研究其住头颈鳞癌的生物学功能奠定基础。     

ＰＳＭＡ-ＣＡＲ慢病毒颗粒包装浓缩及感染 ＣＩＫ细胞的研究

目的：探讨前列腺特异性膜抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｍｅｍｂｒａｎｅａｎｔｉｇｅｎ,ＰＳＭＡ） 嵌合抗原受体（ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ,ＣＡＲ）慢病毒颗粒的浓缩方法及提升感染 ＣＩＫ细胞效率的方法。方法：本研究通过超速离心法、超滤管浓缩 法、ＰＥＧ ８０００浓缩法三种方法浓缩 ＰＳＭＡ ＣＡＲ慢病毒颗粒,通过比较三种方法获得的 ＰＳＭＡ ＣＡＲ慢病毒颗粒感染 ＣＩＫ细胞的效率,确定其最佳浓缩方法;其次,通过比较 ＣＩＫ细胞的感染效率,确定联合室温 ＋长时间 ＋低速离心的 方法是否可以提高 ＰＳＭＡ ＣＡＲ慢病毒颗粒感染 ＣＩＫ细胞的效率。结果：测定 ＰＳＭＡ ＣＡＲ慢病毒颗粒感染 ＣＩＫ细胞 的效率,超滤管浓缩法为 ６．９８％ ±０．７７％,超速离心法为 ３２．０４％ ±１．６６％,ＰＥＧ ８０００浓缩法为 ５３．４７％ ±４．７２％ （Ｆ＝１８９７０,Ｐ＜０．０１）,３种方法的感染效率差异有统计学意义;室温（２６℃）＋长时间（４ｈ）＋低速离心（１５０ｇ）的 方法可使 ＣＩＫ细胞的感染效率提高至 ３２．０４％ ±１．６６％,而常规方法感染 ＣＩＫ细胞的感染效率仅为 ２．７３％ ± ０．７５％。结论：ＰＥＧ ８０００浓缩法为制备 ＰＳＭＡ ＣＡＲ慢病毒颗粒的最佳浓缩方法,室温 ＋长时间 ＋低速离心的方法可 提高其对 ＣＩＫ细胞的感染效率。     

EB病毒BHRF1基因慢病毒载体的构建及功能鉴定

目的:构建并制备能够有效表达EB病毒BHRF1基因的重组慢病毒载体,观察BHRF1表达对人胚肺成纤维细胞(KMB17)凋亡的影响。方法:采用RT-PCR法,从B95-8细胞扩增EBV BHRF1基因,克隆至pWPI GW慢病毒载体上,与pVSVG及pSPAX质粒共转染人胚肾293T细胞,包装出重组慢病毒。将纯化后的重组慢病毒直接感染293T和KMB17细胞,荧光显微镜、实时定量RT-PCR、免疫印迹等方法检测BHRF1在细胞中的表达水平。流式细胞仪检测BHRF1表达对凋亡诱导剂或无血清培养诱发KMB17细胞凋亡的影响。结果:重组慢病毒介导BHRF1在293T和KMB17细胞内获得表达,能有效地抑制KMB17细胞的凋亡。结论:成功构建了表达BHRF1基因的重组慢病毒载体。     

SET基因shRNA慢病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达鉴定

目的： 构建SET基因shRNA慢病毒表达载体,为研究SET在三氯乙烯毒性机制中的作用提供技术支持。 方法：通过NCBI检索SET序列,设计合成5对shRNA片段,退火后连接到慢病毒载体pLVX-shRNA1 vector。挑取筛选的单菌落,经PCR和测序鉴定后提取质粒。将质粒共转染到293T细胞,收集病毒上清,转导入L-02肝细胞中,利用嘌呤霉素筛选得到SET缺陷型细胞,最后利用荧光定量PCR和Western blot鉴定干扰效果。结果：PCR和测序结果证明双链shRNA正确插入慢病毒载体pLVX-shRNA1 vector,共转染293T细胞得到高滴度病毒,转导L-02细胞筛选出SET基因缺陷型细胞。结论：利用慢病毒介导的RNAi技术成功构建了SET基因缺陷型细胞。     

慢病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用

载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。目前常用的有病毒载体和非病毒载体两类,病毒载体由于转导效率较高且可以用于体内和体外的基因转导,是目前基因治疗研究和临床应用的主要工具,包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体等。慢病毒载体是近来受到广泛注意的一种逆转录病毒载体,由于具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点,适于体内基因治疗,因此有望成为理想的基因转移载体。本文以HIV-1为代表对慢病毒载体构建,结构优化及其在肿瘤基因治疗中的应用作一综述。     

PSMA-CAR-CIK转基因细胞体外杀伤三种前列腺癌细胞株效率的研究北大核心

目的:本研究通过检测前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)-肿瘤特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)-细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell,CIK)转基因细胞杀伤三种前列腺癌细胞株的效率,鉴定其用于后期治疗前列腺癌的可行性。方法:通过已经构建的二代PSMA-CAR慢病毒表达载体转染CIK细胞,构建PSMA-CAR-CIK转基因细胞;通过CCK8法检测CIK细胞及PSMA-CAR-CIK转基因细胞杀伤三种前列腺癌细胞株PC3、LNCaP、DU145的效率及效靶比。结果:转基因PSMA-CAR-CIK细胞构建成功;3 h~3.5 h为检测效应细胞对靶细胞细胞毒活性时与CCK8试剂孵育的最佳时间;两种效应细胞均在效靶比为10∶1、15∶1、20∶1时,杀伤率逐步增高,无统计学意义(P>0.05),但与其它组相比差异显著(P<0.05)。结论:两种效应细胞对于前列腺癌细胞的杀伤,只要效靶比达到10∶1的比例,就能起到一个较好的杀瘤效果,并且随着效应细胞的增加,其抗肿瘤能力逐步加强;转基因PSMA-CAR-CIK细胞的构建为CAR技术治疗前列腺癌的临床应用奠定了基础。     

Screening for prostate cancer in Dutch hereditary prostate cancer families

It is common belief that in families with hereditary prostate cancer (HPC), unaffected men should be screened periodically with PSA, but little is known about the effects of such screening. We studied test and tumor characteristics in unaffected 50-75-year-old screenees from HPC families. In the Netherlands, 153 verified HPC families are registered; 132 unaffected men in these families were not under surveillance for prostate cancer and gave informed consent for PSA testing by their GP and referral to a urologist in the case of a PSA level >or= 3.0 ng/ml. Results were compared to published data from the Rotterdam and G?teborg sections of the European Randomized Study of Screening for Prostate Cancer (ERSPC). A PSA >or= 3.0 ng/ml was found in 20 men: referral rate, 15.1% (ERSPC Rotterdam: 20.1%; ERSPC G?teborg: 12.0%). Only 3 cases of prostate cancer were diagnosed in these men: detection rate in the first screening round 2.3% (ERSPC Rotterdam: 5.3%; ERSPC G?teborg: 2.3%). Frequent opportunistic PSA testing made it impossible to estimate the detection rates in subsequent screening rounds. In the first and subsequent PSA screening rounds, 11 cases of cancer were detected. All but 1 had favorable tumor characteristics (cT1c/pT2; Gleason < 7). These results raise the question as to whether men from all HPC families should be considered at high-risk. We suggest that the same PSA testing guidelines should apply to HPC families and the general population. A more aggressive screening policy in HPC families does not seem to be justified.     

miR-513a-5p慢病毒载体的构建及其对人骨肉瘤细胞放疗敏感性的影响

目的:构建miR-513a-5p慢病毒过表达载体,转染人骨肉瘤细胞株,观察miR-513a-5p对人骨肉瘤细胞放疗敏感性的影响。方法:PCR法扩增人miR-513a-5p基因,克隆入pLentis-CMV-GFP-MCS-PGK-PURO载体获得重组质粒pLentis-miR513a,双酶切鉴定并测序后将正确的重组质粒和对照质粒转染293FT细胞制备慢病毒,分别转染骨肉瘤HOS和U2OS细胞,qRT-PCR法及荧光显微镜鉴定转染结果。克隆形成实验、MTT法检测miR-513a-5p高表达HOS和U2OS细胞在X射线照射下细胞存活情况。结果:双酶切及测序结果确定成功构建miR-513a-5p慢病毒载体pLentis-miR513a。qRT-PCR结果提示,转染骨肉瘤细胞株后miR-513a-5p表达显著升高。克隆形成实验结果显示miR-513a-5p高表达后骨肉瘤细胞在X射线照射下细胞增殖减慢。MTT结果提示miR-513a-5p高表达骨肉瘤细胞经X射线照射后细胞存活减少。结论:成功构建了miR-513a-5p慢病毒载体,建立了高效稳定表达miR-513a-5p的骨肉瘤细胞株,高表达miR-513a-5p能显著增加X射线照射后骨肉瘤细胞的放疗敏感性。     

前列腺特异膜抗原对前列腺疾病的临床诊断意义

目的评价血清中前列腺特异膜抗原（PSMA）浓度对前列腺疾病的辅助诊断意义。方法采用Western印迹分析检测患者血清中PSMA的浓度,前列腺特异抗原（PSA）检测采用通用的免疫化学发光法检测。分析二者在不同分组中的浓度差异及相关性。结果前列腺癌患者的血清中PSMA浓度显著高于正常人群,良性前列腺增生和前列腺炎的患者则低于正常人群,而PSA浓度无论是前列腺癌还是前列腺良性病变均高于正常人。结论前列腺特异膜抗原浓度可以作为区分前列腺癌和良性前列腺增生的辅助诊断标志物。     

The Relationship of PSA, PSAD and Clinicopathological Stage in Patients with Prostate Cancer

OBJECTIVE To investigate the relationship between the clinicopatho- logical stage and serum prostate specific antigen(PSA)concentration and PSAdensity(PSAD)in patients with prostate cancer. METHODS The clinicopathological stage was determined on the basis of a pathological examination and clinical data in 65 prostate cancer patients treated by radical prostatectomy.PSA and PSAD were measured before the operation.The Spearman rank correlation was applied to evaluate the relationship between the clinicopathological stage,serum PSAconcentration and PSAD. RESULTS Patients with higher PSA and PSAD were significantly more likely to have higher clinical stages,a higher Gleason score,positive surgical margins,capsular penetration,and seminal vesicle invasion(each P<0.05). But there was no significant association between PSA and lymph node metastasis(P=0.053).The levels of serum PSA concentration and PSAD were significantly correlated with the clinical stage(P<0.05)in the prostate cancer patients. CONCLUSION The level of both PSA and PSAD were significantly correlated with the clinical stage(P<0.05)in the prostate cancer patients.But PSAD may be a more powerful predictor of clinical stage and prognosis than PSA.     

PSA正常的前列腺癌患者临床特点分析北大核心

目的:根据PSA低于4 ng/mL的前列腺患者的临床资料及随访情况,探讨此类前列腺癌患者的临床特点,对PSA正常的前列腺癌患者的诊断及治疗提供临床思路。方法:收集2013年01月至2018年01月西京医院及西安交通大学第二附属医院收治的35例PSA正常的前列腺癌患者的临床资料。观察此类患者的发病情况、临床就诊特征、病理学特征、危险程度分级、Gleason评分、治疗及预后。总结PSA正常的前列腺癌患者的临床诊断及治疗特征。结果:PSA正常的前列腺癌患者占同期确诊前列腺癌的5.72%。35例患者中,28例主要因为排尿困难为症状就诊,血清PSA 0.91~3.96 ng/mL,平均(2.73±0.77)ng/mL。f/tPSA>0.16为5例,占14.3%,前列腺体积平均值为(68.4±36.66)cm^(3),12例患者行磁共振检查,10例报告提示前列腺癌可能,2例报告为前列腺增生,未发现前列腺癌影像学证据。13例患者行B超引导下经直肠前列腺穿刺活检术,11例患者病理诊断为前列腺癌,2例患者未发现肿瘤证据。行经尿道前列腺电切术共24例,其中包括2例穿刺活检未发现肿瘤证据患者,并于术后12周行前列腺癌根治性手术。病理结果显示:29例为前列腺腺癌,2例为肉瘤,2例为小细胞癌,1例为鳞癌,1例为黏液腺癌。切缘阳性10例(28.6%),侵犯精囊9例(25.71%),淋巴结阳性13例(37.14%)。TNM分期:T期6例,T期10例,T期7例,T期12例。危险度分级:低危患者5例(14.28%),中危9例(25.71%),高危21例(60%)。Gleason评分7分以下为6例(20.69%),7分为9例(31.03%),7分以上为14例(48.28%)。随访时间13~72月,术后密切监测PSA水平,术后生化复发共13例(37.14%),21例患者死亡,16例为前列腺特异性死亡。术后1、2、3年的生存率分别为:97.14%,88.57%,77.14%。结论:PSA正常的前列腺癌因无明显的临床就诊特征,精囊侵犯检出率高、Gleason评分及危险程度均偏高,3年生存率仅为77.14%。对于此类患者,不应以惯性思维认为PSA水平低,临床风险小,应更积极的完善检查,调整治疗策略,给此类患者带来更多的生存获益。     

血清铁蛋白联合前列腺特异性抗原检测对前列腺癌的诊断价值

目的探讨血清铁蛋白(Ferr)、总前列腺特异性抗原(tPSA)、游离前列腺特异性抗原(f PSA)、fPSA/tPSA联合检测对前列腺癌(PCa)的诊断价值。方法选择90例PCa患者、84例前列腺良性病变患者和50例健康男性体检者分别作为PCa组、良性组和对照组,检测3组研究对象的血清Ferr、tPSA、fPSA水平并计算fPSA/tPSA,分析Ferr、tPSA、fPSA、fPSA/tPSA联合检测对PCa的诊断价值。结果PCa组患者的血清Ferr、tPSA、fPSA水平均高于良性组和对照组,fPSA/tPSA低于良性组和对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。良性组患者的血清Ferr、tPSA、fPSA水平均高于对照组,fPSA/tPSA低于对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。PCa患者的血清Ferr与tPSA、fPSA均呈正相关,tPSA与f PSA呈正相关,tPSA与fPSA/tPSA呈负相关(P﹤0.05)。血清Ferr、tPSA、fPSA、fPSA/tPSA联合检测诊断PCa的灵敏度、特异度、曲线下面积均高于四个指标的三联、两联、单独检测。结论PCa患者的血清Ferr、t PSA、fPSA水平均高于前列腺良性病变患者,fPSA/tPSA低于前列腺良性病变患者。血清Ferr、tPSA、f PSA、f PSA/tPSA联合检测对PCa具有较高的诊断价值,值得在临床中推广应用。