基因芯片技术检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性临床应用评价

目的评价基因芯片技术检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性的临床应用效果。方法利用基因芯片技术对涂阳肺结核患者的痰标本和临床分离株进行利福平和异烟肼耐药基因位点检测,比较痰标本与菌株检测结果的差异;并以BACTEC MGIT 960药敏试验结果为对照评价基因芯片的检测性能。另外,通过对999株鉴定为结核分枝杆菌的临床分离菌株进行rpoB、katG和inhA基因耐药相关区域扩增产物测序,以验证基因芯片对核酸序列检测的准确性。结果在涂阳的1 108例标本中有100例经基因芯片菌种鉴定为非结核分枝杆菌。其余的1 008例痰标本基因芯片结果与BACTEC MGIT960培养阳性的菌株基因芯片结果比较仅有9例结果不一致,符合率为99.1%。以BACTEC MGIT960培养法药敏结果为对照,999株菌株基因芯片法检测利福平耐药性的符合率为98.1%,异烟肼的耐药性的符合率为94.5%。与DNA测序法相比,基因芯片法检测利福平和异烟肼耐药性的准确率分别为99.6%和99.8%。结论基因芯片技术能够快速、准确地进行结核分枝杆菌利福平和异烟肼的耐药性检测,并能直接用于痰标本检测。     

噬菌体生物扩增法快速测定结核分枝杆菌利福平耐药性

目的　建立快速测定结核分枝杆菌利福平耐药性的噬菌体生物扩增法 ,并探讨其在结核分枝杆菌利福平耐药性测定中的应用价值。方法　应用噬菌体生物扩增法测定 5 2 4株结核分枝杆菌利福平耐药性 ,并与绝对浓度法结果进行比较 ,对不符合的菌株采用BactecMGIT 96 0测定其最低抑菌浓度 (MIC)。结果　噬菌体法测定 5 2 4株结核分枝杆菌临床分离株利福平敏感 30 1株、耐药 2 2 3株 ,绝对浓度法敏感 313株、耐药 2 11株 ;两法测定均为敏感 2 88株、均为耐药 198株。在 38株噬菌体法与绝对浓度法测定结果不符的菌株中 ,35株噬菌体法与MIC测定结果相符合。如以绝对浓度法药敏结果为判断标准 ,则噬菌体法测定利福平耐药性的敏感性为 93 8%、特异性为 92 0 %、阳性预测值为88 8%、阴性预测值为 95 7%、准确性为 92 7%。结论　噬菌体生物扩增法测定利福平耐药性只需 2天时间 ,操作简便 ,不需特殊仪器设备 ,可作为结核分枝杆菌利福平耐药性的快速筛选方法。     

应用等位基因特异性多重聚合酶链反应同步检测结核分枝杆菌的耐药性

目的建立可同步检测结核分枝杆菌katG和ropoB基因突变的等位基因特异性多重聚合酶链反应（MAS-PCR）的方法，以快速检测结核分枝杆菌对利福平（RFP）和异烟肼（INH）的耐药性。方法根据结核分枝杆菌katG和rpoB基因序列，分别设计特异性寡聚核苷酸引物，采用MAS-PCR技术，分别检测katG基因315位点和rpoB基因中531、526和516三个最常见的突变位点。结果19株INH敏感株中均未发现katG基因315位点的突变，耐药株中发现有79．2％（61／77）的菌株存在突变；15株RFP敏感株中未发现rpoB基因突变。MAS-PCR方法可检测出81．5％（66／81）的利福平耐药株。结论MAS-PCR方法对katG和rpoB基因的同步检测有较高的敏感性和特异性，有望用于耐药结核分枝杆菌的快速检测。     

等位基因特异性多重聚合酶链反应方法用于快速检测结核分枝杆菌利福平耐药株

目的建立检测耐利福平(RFP)结核分枝杆菌的等位基因特异性多重聚合酶链反应(multiplex allele specific polymerase chain reaction,MAS-PCR)方法,快速、特异地检测rpoB基因核心突变区的主要突变,用于快速诊断结核分枝杆菌对利福平的耐药性。方法根据结核分枝杆菌的rpoB序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用MAS-PCR技术,分别检测rpoB基因上531、526、516这3个最常见的突变位点的突变。结果对临床分离的利福平敏感株(15株)及利福平突变株(81株)进行检测,以直接测序结果为参照,对利福平耐药株的总检出率为81.5%(66/81)。结论MAS-PCR方法敏感、特异,可快速、简便地检测结核分枝杆菌rpoB基因突变,有利于耐药结核分枝杆菌的快速检测。     

噬菌体生物扩增技术检测结核分枝杆菌及利福平耐药性的效果评价

目的评价噬菌体生物扩增法（Pha B）检测结核分枝杆菌（MTB）及利福平耐药性的临床效果。方法采用Pha B法检测360例结核病患者的痰液标本MTB及MTB对利福平的药物敏感性,以比例法测定结果作为参考,评价MTB检测的符合率及药物敏感性检测的灵敏度、特异性、准确度。结果 Pha B法检测MTB的符合率为88.6%;药物敏感性检测的灵敏度、特异性、准确度分别为81.8%、97.6%、94.2%。结论 Pha B法检测痰MTB及MTB对对利福平的药物敏感性结果较为准确。     

结核分枝杆菌利福平依赖性的初步研究

目的 从耐利福平（RFP）结核分枝杆菌临床分离株中筛选RFP依赖的菌株,并在小鼠模型中验证RFP依赖现象,同时分析RFP依赖菌株的特征。 方法 采用7H11培养基绝对浓度法对46例临床分离菌株进行RFP依赖菌株筛选。以筛选得到的体外具有典型的RFP依赖现象的05116菌株建立气溶胶感染的小鼠模型,小鼠按照给药的种类和给药单位剂量分成对照组0.5%羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose sodium,CMC）、10 mg/kg Rfb（Rfb₁₀）组、10 mg/kg RFP（RFP₁₀）组、20 mg/kgRFP（RFP₂₀）组,每组各10只,观察给药4、8周的体质量、肺荷菌量及组织病理学改变在各组之间差异,以验证小鼠体内是否存在RFP依赖现象。比较RFP耐药株和依赖株的rpoB基因突变位点,以鉴定RFP依赖株的特征。数据以(x±s)表示,采用SPSS 11.0软件,组间比较采用单因素方差分析,以 P<0.01为差异有统计学意义。 结果 从46例RFP耐药的结核分枝杆菌临床分离株中筛选到18例RFP耐药伴依赖的菌株和28例RFP耐药非依赖的菌株。感染小鼠模型给药8周,各组小鼠的活菌计数从高到低依次为：RFP₂₀组（lgCFU为6.60±0.82）、RFP₁₀组（lgCFU为6.44±0.36）、Rfb₁₀组（lgCFU为6.32±0.55）、对照组(lgCFU为6.20±0.28),接近于最初感染的菌量（lgCFU为5.93±0.14）,但与对照组相比差异无统计学意义（F值分别为0.68、2.21、2.45,各组P值均大于0.05）。RFP耐药株8例和依赖株11例,分别有3/8和4/11的菌株在rpoB基因526位发生突变,2/8和6/11的菌株在rpoB基因531位发生突变。 结论 RFP临床耐药株中RFP依赖菌的检出率高,其RFP依赖现象在小鼠体内得到初步验证。RFP耐药株和依赖株的rpoB基因突变位点基本相同,因此RFP依赖的原因是表型变异还是其他因素尚有待进一步的实验证实。     

应用基因芯片快速检测结核分枝杆菌利福平耐药基因的研究

在全球范围内,结核分枝杆菌耐药率不断上升,高耐药和耐多药菌株不断出现和传播,对化疗疗效及结核病流行产生很大影响。利福平(RFP)作为1种主要的抗结核药物,对其耐药常常导致化疗失败。     

基因芯片技术快速检测结核分枝杆菌异烟肼、利福平耐药性

目的研究基因芯片法快速检测结核分枝杆菌（MTB）异烟肼（INH）、利福平（RFP）耐药性的可能性及其临床应用价值。方法应用基因芯片技术同时检测62株MTB临床分离株对INH、RFP的耐药性,并与比例法结果进行比较。结果以比例法药敏结果为判断标准,基因芯片法测定INH耐药性的敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）及准确性分别为75％（12／16）、78．3％（36／46）、54．5％（12／22）、90％（36／40）、77．4％（48／62）;测定RFP耐药性的敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）及准确性分别：83．3％（15／18）、86．4％（38／44）、71．4％（15／21）、92．7％（38／41）、85．5％（53／62）。结论基因芯片法测定MTB对INH、RFP耐药性和比例法结果有较高的相符率,可作为MTB耐药性的快速筛选方法,是传统药敏方法的补充。     

应用基因芯片方法检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼的耐药性

目的 应用基因芯片方法检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)对利福平和异烟肼的耐受性,评价其临床应用价值。方法 应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增-基因芯片杂交的方法检测经常规药敏实验证实的30株Mtb利福平和异烟肼敏感株和50株耐利福平和异烟肼分离株的rpoB基因及katG和inhA基因突变,同时以PCR-直接测序法为对照。结果 应用PCR-基因芯片与基因测序方法检测30株Mtb利福平敏感株rpoB基因和异烟肼敏感株katG基因和inhA基因均为野生型。50株Mtb利福平耐药株中,PCR-基因芯片与基因测序分析3株rpoB基因均为野生型,41株均为突变型;6株PCR-基因芯片与基因测序结果不一致。50株Mtb异烟肼耐药株中,PCR-基因芯片与基因测序分析16株katG基因和30株inhA基因均为野生型,31株katG基因均为315位密码子突变,7株inhA基因均为15位突变型,其中2株为katG和inhA双重突变;3株katG和13株inhA PCR-基因芯片与基因测序结果不一致。结论 应用PCR-基因芯片方法可快速、有效地检出大多数Mtb耐多药分离株,指导临床用药。     

结核分枝杆菌rpoB基因突变特征与利福平耐药水平关系的研究

目的 了解结核分枝杆菌rpoB基因突变特征与利福平耐药水平的关系。方法 测定266株(109株利福平耐药株,157株利福平敏感株)结核分枝杆菌利福平MIC值及其rpoB基因序列,分析不同突变特征的菌株其利福平MIC值的差异。结果 109株利福平耐药株rpoB基因皆发生错义突变,常见突变密码子531与526的突变频率分别为69.7%与17.4%。利福平耐药株中单密码子突变株占82.6%,多重密码子突变株占17.4%。531单密码子突变株与526单密码子突变株之间平均利福平MIC值差异无统计学意义(P=0.87),但两独立样本T检验分析显示,多重密码子突变株平均利福平MIC值(115.8 μg/mL)显著高于单密码子突变株平均利福平MIC值(48.4 μg/mL)(t=2.659,P=0.016)。利福平敏感株未发生错义突变。5.5%(6/109)的利福平耐药株仅在rpoB基因起始端发生突变,突变密码子分别是247,251和253。结论 531与526是最常见突变密码子,且以单密码子突变为主;531与526单密码子突变株之间利福平耐药水平差异无统计学意义,但多重密码子突变株利福平耐药水平显著高于单密码子突变株利福平耐药水平;rpoB基因起始端突变可能是除利福平耐药决定区域之外导致利福平耐药的第2个耐药决定区;rpoB基因DNA序列分析有助于结核分枝杆菌利福平耐药表型和耐药水平的预测。     

Diagnostic performance of DNA microarray for detecting rifampicin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis

BackgroundWhile rifampicin (RFP) and isoniazid (INH) are the most commonly used first-line antituberculosis drugs, multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis poses a threat to the success of tuberculosis (TB) control programs. Clinical practice guidelines and expert consensuses recommend drug susceptibility testing (DST) before the initiation of antituberculosis treatment. However, traditional DST is time-consuming and has high requirements for laboratory conditions. The recently developed molecular diagnostic techniques, such as DNA microarray, offer new options. We thus investigated the diagnostic value of DNA microarray in detecting RFP + INH-resistant TB, with an attempt to identify simple, efficient, and accurate drug-resistant TB testing methods.MethodsThe clinical features and DST results of patients diagnosed with pulmonary tuberculosis by Bactec MGIT 960 liquid culture system (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) who received DNA microarray analysis in our center from July 2019 to July 2020 were retrospectively analyzed. Level of agreement between liquid culture and DNA microarray technology was assessed by using the Cohen kappa coefficient. With the results of liquid culture as the gold standard, the sensitivity and specificity of the DNA microarray were calculated, and the receiver operating characteristic (ROC) curves were used to assess the diagnostic values of the DNA microarray in detecting RFP + INH-resistant TB.ResultsA total of 825 patients were enrolled. The sensitivity and specificity of DNA microarray were 0.84 and 0.94, respectively, in the detection of RFP resistance, with an area under the curve (AUC) of 0.89 [95% confidence interval (CI): 0.87–0.91)] and a Cohen kappa coefficient of 0.78 (95% CI: 0.72–0.83). For INH resistance, the sensitivity and specificity of the DNA microarray were 0.73 and 0.97, respectively, with an AUC of 0.85 (95% CI: 0.82–0.87) and a Cohen kappa coefficient of 0.75 (95% CI: 0.70–0.80).ConclusionsThe DNA microarray had high specificity and sensitivity in detecting RFP + INH-resistant TB. As a rapid, accurate, and practical technique, it can be routinely performed in clinical laboratories.     

荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性的价值北大核心CSCD

目的分析南京市结核分枝杆菌(MTB)感染患者的耐药情况,评价荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌对利福平(RFP)和异烟肼(INH)耐药性的临床价值,探究RFP和INH耐药相关基因突变的特征。方法对鉴定为MTB的780株菌株同时进行绝对浓度法药物敏感性试验和荧光PCR熔解曲线法检测对RFP和INH的耐药性。以绝对浓度法药物敏感性试验结果为标准,分析熔解曲线法检测RFP和INH的灵敏度、特异度、符合率和一致性(Kappa检验)。结果780株MTB中,22株(2.82%)为RFP单耐药,62株(7.95%)为INH单耐药,143株(18.33%)为耐多药。以绝对浓度法药敏试验结果为标准,荧光PCR熔解曲线法检测MTB对RFP和INH耐药性的灵敏度分别为98.18%和85.85%,特异度分别为95.28%和97.39%,符合率分别为95.90%和94.36%,Kappa值分别为0.88和0.85。RFP分子耐药菌株中全部检测出rpoB基因位点突变,其中以rpoB 529~533位点为最常见的突变(63.87%,122/191),突变位点为rpoB 507~512的20株菌株中只有7株表型耐药,rpoB基因双位点突变的18株菌株全部表型耐药;INH分子耐药菌株中最常见的突变为katG 315位点(66.49%,127/191),其次是inhA启动子区(17.80%,34/191),90%以上的INH分子耐药菌株为表型耐药。结论南京市结核耐药情况严重,以耐多药结核病为主。荧光PCR熔解曲线法与药敏试验结果高度一致,且弥补了药敏试验对于低度耐药突变株菌检测的局限性。耐药相关基因突变位点的检测有利于结核病的及时诊断和个体化治疗的实施。     

Progressive rise of Mycobacterium tuberculosis resistance to rifampicin and streptomycin in Riyadh, Saudi Arabia

OBJECTIVE: The aim of this study was to investigate, for the first time, the factors associated with resistance to antituberculous drugs in Saudi Arabia, and to follow the long-term trends in drug resistance. METHODOLOGY: A retrospective study of patients with positive Mycobacterium tuberculosis recorded at the Riyadh Tuberculosis Center in 1990 was undertaken. The resistance figures from the same centre for the period July 1996 to June 1997 were reviewed for comparison. RESULTS: Resistance was significantly higher in those previously treated (71%) than in those who denied previous treatment (34%). There was a trend towards association of resistance with cavitatory, multilobar, and acid fast bacilli-positive cases. Nationality (Saudis, Yemenis, others) had no significant effect on resistance. The Riyadh Region now has the same high prevalence of rifampicin resistance as previously reported in the Western Region of the Kingdom. The figures on resistance for the years 1986-88, 1990, and 1996-97 were: isoniazid 19.5/13.8/11.1%, rifampicin 10/20.7/24.6%, streptomycin 5/22/27.4%, ethambutol 3.7/3.9/1.8%, respectively. The reduction in isoniazid and ethambutol resistance coincided with a rise in resistance to rifampicin and streptomycin. We speculate that this resulted from the fact that isoniazid and ethambutol are restricted only to the treatment of tuberculosis and cannot, by law, be dispensed by general practitioners or private pharmacies. Rifampicin and streptomycin, however, are widely used for brucellosis; an endemic disease in Saudi Arabia where up to 12 weeks of rifampicin therapy is recommended. CONCLUSIONS: There has been a significant increase in rifampicin and streptomycin resistance in Saudi Arabia over the last 10 years. Possible causes include poor compliance and wide use of these two drugs for non-tuberculosis conditions. These findings could jeopardize the benefits of the directly observed therapy short course policy which is being implemented in Saudi Arabia. Consideration should be given to prohibiting the routine use of rifampicin for the treatment of brucellosis.     

应用噬菌体裂解法快速鉴定结核分支杆菌

目的 研究噬菌体裂解试验对结核分支杆菌快速鉴定的意义。方法 应用结核分支杆菌噬菌斑技术快速检测结核分支杆菌、非结核分支杆菌和非分支杆菌及肺结核患者痰标本。结果 结核分支杆菌H37Rv、牛分支杆菌和非洲分支杆菌噬菌体裂解试验均为阳性,10株常见非结核分支杆菌和7株非分支杆菌均为阴性;30株结核分支杆菌临床分离株本法检测结果全部阳性;20份涂阳培阳肺结核患者痰标本,本法阳性19份（95％）;21份涂阴培阳痰标本,本法阳性15份（71％）;19份涂阴培阴痰标本,5份阳性（26％）。结论 噬菌体裂解试验可以快速鉴定结核分支杆菌,用其检测痰标本中的结核分支杆菌具有很高的特异性和较高的敏感性。     

显微镜观察药敏法检测结核分枝杆菌耐药性

目的评价显微镜观察药敏法(microscopic observation drug susceptibility,MODS)检测结核分枝杆菌临床分离株异烟肼(INH)和利福平(RFP)耐药性的可行性。方法使用MODS技术对本医院的共201株结核菌临床分离株分别进行INH、RFP的耐药性检测,并与罗氏比例法作比较。结果 MODS法检测平均时间为8d,以罗氏比例法为金标准,INH的灵敏度和特异性分别为98.5%和100.0%,RFP的灵敏度和特异性分别为99.3%和100%。结论 MODS法检测结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药性具有成本低、快捷、操作简便、准确等优点,为结核耐药检测提供了一种较好的方法 。     

环介导等温扩增法快速检测结核分枝杆菌的初步观察

目的建立1种用于结核分枝杆菌快速检测的LAMP技术平台,用于结核分枝杆菌的鉴定。方法使用了11株标准菌株,建立了一套用于结核分枝杆菌快速检测的平台,对灵敏度和特异性进行优化,随后使用47株临床分离株,和13株食源性致病菌对建立的方法进行了验证。结果经过标准菌株建立并优化检测平台,经过优化的LAMP反应体系检出限为1pg的模板DNA,在使用47株临床分离株,和13株食源性致病菌对方法进行验证,发现LAMP特异性为97.4%。结论通过这项研究发现LAMP应用于结核分枝杆菌的快速检测,具有检出浓度低、特异性强和检测周期短的优点。     

耐药结核分枝杆菌快速检测方法的研究进展

传统的耐药结核分枝杆菌的诊断依赖药物敏感试验.近年来,随着技术的进步,出现了大量的先进检测手段,在敏感性、特异性、检测周期方面皆优于传统方法.基于核酸扩增的分子生物学技术为临床耐药结核分枝杆菌的快速检测打开了一个广阔的前景.在自动测序分析的帮助下,耐药结核的确诊越来越简便、准确,对结核菌基因中耐药突变位点的快速检测还能够为临床诊疗提供早期的帮助信息,甚至能识别潜在的感染.本文对目前已有的快速检测方法的研究进展进行综述.     

探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌链霉素耐药突变

目的评价探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌链霉素耐药突变的应用价值,为临床应用提供依据。方法首先用中国药品生物制品检定所提供的含37份标准非结核分枝杆菌的标准盘进行特异性评价,然后将野生型结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA梯度稀释进行灵敏度考察,最后对906株结核分枝杆菌临床分离株（其中37份有药物敏感性试验结果）的链霉素耐药相关基因进行检测,并对突变菌株、有药敏结果的菌株以及疑似杂合的菌株进行测序分析。结果标准盘评价结果证实该体系特异检测H37Rv结核分枝杆菌。分析灵敏度为5~50拷贝每反应。在所有的906份结核分枝杆菌培养标本中,103份标本发生突变且与测序结果一致,18份标本存在杂合信号,17份标本无信号。37份有药敏结果的标本中,敏感的标本用探针熔解分析法所得结果均为野生型,耐药的16份标本仅检测到7份突变,另有9份耐药的标本实时检测为野生型,与测序结果相符。结论探针熔解分析技术特异性好,可以快速、准确地检测结核分枝杆菌链霉素耐药常见突变,有望直接用于临床标本链霉素耐药性检测。