腺苷对葡萄膜黑色素细胞和葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的影响

目的探讨腺苷受体在正常人葡萄膜黑色素细胞和葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达以及腺苷对其细胞增殖能力的影响。方法体外培养正常人葡萄膜黑色素细胞（U95）和葡萄膜黑色素瘤细胞（$65）,采用Real—timePCR检测4种不同亚型腺苷受体（、A1、A2A、A2B、A3）mRNA在U95和S65中的表达情况。以0、0．1、1、10和100μmol／L的腺苷分别作用U95和S65细胞24h和48h后,采用MTT法检测细胞光密度值和抑制率,分析不同时间、不同浓度的腺苷对U95和S65增殖能力的影响。对上述所得数据进行单因素方差分析或独立样本t检验。结果U95和S65细胞中4种类型腺苷受体A1、A2A、A3的mRNA均有表达。在U95细胞中,A1、A孙A2B、A3受体mRNA表达值分别为1．32±0．47、0．28±0．05、1．03±0．10、0．20±0．07,四者之间差异有统计学意义（F=15．90,P〈0．01）,A1和A2B的mRNA表达水平相似,且明显高于A2A和凡的表达;在$65细胞中,A1、A2A、A3气受体mRNA表达值分别为1．03±0．27、2．23±0．35、127．34±18．69、0．17±0．07,四者之间差异有统计学意义（F=163．20,P〈0．01）,A2HmRNA表达水平明显高于其他3种腺苷受体亚型。A2A和A。在S65中的表达明显高于其在U95中的表达量（A2A：t=9．35,P〈0．0l;A2B2Bt=11．43,P〈0．01）。作用时间24h,0．1、1、10和100μmol／L腺苷对S65细胞的抑制率分别为3．47％、14．93％、19．79％和26．04％：作用时间48h,各浓度腺苷对S65细胞的抑制率分别为11．43％、23．10％、34．76％和46．67％;随着腺苷浓度的增高,S65细胞的增殖受到明显的抑制,呈现明显的浓度效应依赖关系。而腺苷对U95细胞的增殖无明显影响。结论腺苷能够明显抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖,但不影响正常葡萄膜黑色素细胞的生长。腺苷和／或腺苷受体激动剂也许可以作为一种新的药物用于葡萄膜黑色素瘤的治疗。     

非编码RNA对葡萄膜黑色素瘤发生机制影响研究新进展

葡萄膜黑色素瘤是成人最常见的一种眼内原发性肿瘤,恶性程度高,患者长期存活率低,易于肝转移。MicroRNA(miRNA)是一种单链非编码微小RNA,参与调节信使RNA的转录后翻译。长链非编码RNA(lncRNA)是一种长链(长度大于200 nt)核糖核酸,不具有蛋白质编码的功能。有研究表明,miRNAs和lncRNAs在葡萄膜黑色素瘤的发生发展过程中均起到调控作用。本文总结了近五年关于miRNAs和lncRNAs对葡萄膜黑色素瘤发生机制影响研究新进展,以期发现更多的可用于该病诊疗的新靶点。     

蛋白酶活化受体2在葡萄膜黑色素瘤中的表达及对细胞增殖和侵袭的影响

目的：探讨蛋白酶活化受体2(protease-activated receptor 2,PAR2)在葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)中的表达,以及沉默人UM 细胞系M23中PAR2基因对细胞增殖和侵袭的影响。

方法：选取2012-02/2017-12在我院行手术治疗且资料完整的UM患者45例45眼,选取同期因眼部外伤行眼球摘除且葡萄膜正常的患者30例30眼,实时荧光定量PCR术检测UM和正常脉络膜组织中PAR2基因表达,培养M23细胞并分为PAR2干扰组、阴性对照序列组和空白组,实时荧光定量PCR技术检测细胞中PAR2基因表达,MTT法检测细胞增殖能力,Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力。

结果：UM组织中PAR2 mRNA相对表达量为1.73±0.13,正常脉络膜组织中PAR2 mRNA相对表达量为1.06±0.10,差异有统计学意义(t=23.732,P<0.01); UM组织中PAR2 mRNA相对表达量与病理学类型、巩膜浸润、视盘受累和眼外生长有关,差异有统计学意义(P<0.05); PAR2干扰组细胞中PAR2 mRNA相对表达量低于阴性对照序列和空白组,差异有统计学意义(P<0.05); PAR2干扰组细胞24、48、72和96h时吸光度A值低于阴性对照组和空白组,差异有统计学意义(P<0.05); PAR2干扰组迁移细胞数和侵袭细胞数低于阴性对照序列组和空白组(P<0.05)。

结论：PAR2在UM组织中呈高表达,且与肿瘤高转移风险有关,特异性沉默M23细胞中PAR2基因表达可有效抑制细胞增殖、迁移及侵袭。     

HMGA1在葡萄膜黑色素瘤中的表达及对细胞增殖和侵袭的影响

目的：探讨高迁移率族蛋白A1(HMGA1)蛋白在葡萄膜黑色素瘤(UM)组织中的表达,以及抑制该基因表达对细胞增殖和侵袭的影响。

方法：选取2014-02/2019-08在我院接受手术治疗的UM患者53例53眼,同期留取因外伤摘除眼球的正常葡萄膜组织34例34眼。采用免疫组织化学法检测组织中HMGA1蛋白表达。将体外培养的人UM细胞系M23分为HMGA1下调组、阴性对照组和空白组,分别转染HMGA1干扰序列、阴性对照序列和不作任何处理,采用实时荧光定量PCR术检测HMGA1 mRNA表达,CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力。

结果：UM组织中HMGA1蛋白阳性表达率为77%,高于正常葡萄膜组织中的29%(P<0.001); 与未发生巩膜浸润、未累及睫状体和未发生眼外生长相比,HMGA1蛋白在发生巩膜浸润、累及睫状体和发生眼外生长的组织中阳性表达率升高(均P<0.05)。与阴性对照组和空白组相比,HMGA1 mRNA在HMGA1下调组细胞中相对表达量降低,且HMGA1下调组细胞培养24、48、72、96h时吸光度OD值降低,迁移细胞数和侵袭细胞数均明显减少(均P<0.05)。

结论：UM组织中HMGA1蛋白阳性表达率升高,下调M23细胞中HMGA1表达可减少细胞增殖,抑制细胞迁移和侵袭。     

LncRNA MT1JP对葡萄膜黑色素瘤细胞迁移和侵袭的影响

目的 研究LncRNA MT1JP对葡萄膜黑色素瘤细胞迁移和侵袭的影响及机制.方法 实时荧光定量PCR测定Ln-cRNA MT1JP在葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5、M23及正常视网膜色素上皮细胞系ARPE-19中的表达,将SP6.5细胞分成3组,即MT1JP组、siMT1JP组和NC组,分别转染pcDNA3.1-MT1JP、pcDNA3.1-siMT1JP及pcDNA3.1空载体,采用细胞划痕实验和Transwell实验测定3组划痕愈合率和侵袭细胞数,Western blot测定P53蛋白表达水平.结果 葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5和M23中LncRNA MT1JP的相对表达量分别为0.20±0.02和0.31±0.01,均显著低于正常视网膜色素上皮细胞系ARPE-19的1.0(均为P＜0.01).siMT1JP组划痕愈合率为61.5％±3.7％,MT1JP组为10.6％±1.7％,NC组为20.0％±2.1％,3组间两两相比差异均有统计学意义(均为P＜0.01).在200倍视野下,siMT1JP组侵袭细胞数为(75.6±6.8)个,MT1JP组侵袭细胞数为(10.3±2.6)个,NC组为(29.50±3.9)个,3组间两两相比差异均有统计学意义(均为P＜0.01).siMT1JP组P53蛋白相对表达量为0.41±0.04,显著低于NC组的1.0(P ＜0.01);MT1JP组P53蛋白相对表达量为5.73±0.62,显著高于NC组的1.0(P＜0.01).结论 LncRNA MT1JP抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的转移和侵袭,其机制可能与上调P53蛋白表达有关.     

miRNA-19对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其机制研究

目的 探讨miR-19在葡萄膜黑色素瘤(UM)细胞中的表达及其对UM细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其作用机制.方法 qRT-PCR检测正常视网膜上皮细胞系ARPE-19和UM细胞系 SP6.5、M23中 miR-19的表达.将 M23细胞分为 miR-19 inhibitor 组(转染 miR-19-inhibit...     

miR-26a对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及机制研究

目的 分析miR26a在葡萄膜黑色素瘤中的表达及对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响.方法 对葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5、M23及正常葡萄膜上皮细胞系ARPE-19行RT-PCR实验,检测3种细胞系中miR-26a的相对表达差异;将葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5分成miR-26a模拟物组和NC组,分别转染miR-26a mimics和对照序列scramble,用CCK-8实验和流式细胞术分别检测两组细胞增殖和凋亡;采用细胞划痕实验及Transwell实验分别检测两组细胞的迁移和侵袭能力;采用Western blot检测其下游蛋白组蛋白甲基化转移酶果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)的表达水平.结果 葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5中miR-26a相对表达量为0.250±0.029,细胞系M23中为0.350±0.017,正常葡萄膜上皮细胞系ARPE-19中miR-26a相对表达量为1.0,在细胞系SP6.5及M23中miR-26a的相对表达量均低于正常葡萄膜上皮细胞系ARPE-19中miR-26a的相对表达量(均为P＜0.001).miR-26a模拟物组在培养72 h、96 h、120 h OD450值(0.69 ±0.09、1.23 ±0.15、2.12±0.23)均显著低于NC组(1.39±0.11、2.35 ±0.25、3.53±0.27),差异均有统计学意义(均为P＜0.05).miR-26a模拟物组细胞凋亡率(15.60±2.30)％高于NC组(5.00±0.70)％(P＜0.01);miR-26a模拟物组划痕愈合率(23.7±2.1)％低于NC组(68.9 ±5.1)％(P＜0.01);侵袭细胞数(45.1±3.9)个低于NC组(115.3±8.9)个(P＜0.O1).miR-26a模拟物组EZH2蛋白相对表达量(0.39±0.09)低于NC组(1.0;P＜0.01).结论 miR-26a在葡萄膜黑色素瘤中低表达,过表达miR-26a显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖,促进凋亡,并抑制迁移和侵袭,其可能是通过下调EZH2的表达来发挥作用的.     

星形胶质细胞活化基因-1（AEG-1）在葡萄膜黑色素瘤中的表达及其与临床组织病理学的关系

目的　研究葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma,UM）组织中星形胶质细胞活化基因-1 （astrocyte elevated gene-1,AEG-1）的表达及其与临床组织病理学的关系。方法　收集北京同仁医院眼科2013年1月至2017年5月,经眼科病理室确诊为UM且临床资料完善的50例患者（50眼）UM石蜡组织标本为实验组,11例（11眼）因外伤行眼球摘除但大部分葡萄膜组织正常的石蜡组织标本为对照组。应用免疫组织化学法检测所有石蜡标本中AEG-1的表达,并分析UM临床病理学特征与AEG-1的相关性。结果　AEG-1蛋白染色呈粉红色或者红色,主要定位于UM核周、细胞浆和细胞膜。实验组中,AEG-1阴性表达21眼（42.0%）,阳性表达29眼（58.0%）;对照组中AEG-1均呈阴性表达,两组AEG-1表达比较差异有显著统计学意义（P=0.000）,提示AEG-1在UM中高表达。在实验组中,当UM患眼存在临床组织病理学高危因素时,即存在肿瘤累及睫状体、虹膜新生血管生成、肿瘤基底最大直径>16 mm、肿瘤高度>8 mm、肿瘤细胞为混合细胞型、肿瘤细胞属于上皮样或混合细胞型、肿瘤眼外生长的患者,其AEG-1阳性表达率分别为73.1%、73.9%、95.2%、82.4%、83.3%、74.1%、69.4%,明显高于非高危因素患者,以上各特征组AEG-1表达比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）。而患者性别、眼别、年龄、累及视盘与否、继发视网膜脱离与否、上皮样细胞型、侵犯巩膜导管与否组AEG-1表达差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　AEG-1在UM组织中高表达,且与UM临床组织病理学多种高危因素呈显著相关性,提示AEG-1的高表达有可能成为判断UM患者预后的重要指标之一。     

长链非编码RNA(LncRNA)母系表达基因3(MEG3)对糖尿病视网膜病变大鼠模型视网膜血管内皮细胞凋亡的影响

目的 探讨长链非编码RNA(LncRNA)母系表达基因3(MEG3)对糖尿病视网膜病变(DR)大鼠模型视网膜血管内皮细胞凋亡的影响。方法 取SPF级雄性SD大鼠以及体外培养的人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC),均随机分为对照组、模型组、LncRNA MEG3过表达组、miR-145-5p agomir组、共转染(LncRNA MEG3过表达质粒+miR-145-5p agomir)组、共转染阴性对照(LncRNA MEG3空载质粒+miR-145-5p agomir阴性对照质粒)组,采用腹腔注射链脲佐菌素建立DR大鼠模型,25 mmol·L^-1葡萄糖诱导DR细胞模型。对照组大鼠腹腔注射柠檬酸缓冲液,对照组细胞以正常培养基培养,将大鼠与细胞均分组进行处理,以LncRNA MEG3质粒、miR-145-5p agomir转染处理后,通过伊文思蓝(EB)检测大鼠视网膜血管通透性;TUNEL染色检测大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡率;EdU染色与Hoechst 33258染色分别检测细胞增殖、凋亡情况;依照试剂盒测量大鼠房水中及HRMEC炎症因子白细胞介素(IL)-6、IL-...     

长链非编码RNA 母系表达基因3调控miR-34a对糖尿病视网膜病变Müller细胞活化及炎症因子分泌的影响

目的　探讨母系表达基因3（maternally expressed gene 3,MEG3）对糖尿病视网膜病变（DR）Müller细胞的活化及炎症因子分泌的影响及机制。方法　高脂饮食联合链脲佐菌素腹腔注射构建小鼠DR体内模型。高糖刺激人视网膜Müller细胞株MIO-M1构建DR体外模型。免疫荧光化学染色及Western blot检测小鼠视网膜及Müller细胞中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。Western blot及酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠视网膜及细胞培养基上清中血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达。ELISA检测小鼠视网膜及细胞培养基上清中IL-1β蛋白的表达。分别或同时向Müller细胞中转染pcDNA-MEG3及miR-34a mimic对其表达进行干预。qRT-PCR检测MEG3 mRNA及miR-34a表达。结果　与正常对照组小鼠比较,DR组小鼠视网膜中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均增多（均为P<0.05）,MEG3 mRNA表达降低(P<0.01)。与对照组比较,高糖组Müller细胞中MEG3 mRNA表达降低(P<0.01),而GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均升高（均为P<0.05）。与高糖组比较,高糖+pcDNA-MEG3组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均降低（均为P<0.05）。与正常对照组比较,DR组小鼠视网膜及高糖刺激的Müller细胞中miR-34a表达均升高(均为P<0.05)。与pcDNA组比较,pcDNA-MEG3组中miR-34a表达减少(P<0.01)。与pcDNA+NC mimic组比较,pcDNA+miR-34a mimic组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均升高（均为P<0.05）,而pcDNA-MEG3+NC mimic组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均减少（均为P<0.05）。与pcDNA-MEG3+miR-34a mimic组比较,GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达水平均升高（均为P<0.05）。结论　MEG3在DR小鼠视网膜及高糖刺激的Müller细胞中表达均降低,其可通过负向调控miR-34a抑制Müller细胞活化及炎症因子的分泌。过表达MEG3可能成为DR治疗的新靶点。     

葡萄膜恶性黑色素瘤转移相关的非编码RNA表达谱及竞争性内源RNA调控网络分析

目的:利用生物信息学方法分析与葡萄膜恶性黑色素瘤转移相关的非编码RNA,以及它们作为竞争性内源RNA的作用机制.方法:从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库下载80例葡萄膜恶性黑色素瘤患者的RNA测序数据和临床资料,采用edgeR算法分析转移与非转移患者组织中差异表达(dif...     

RNA干扰技术在葡萄膜黑色素瘤治疗中的展望

葡萄膜黑色素瘤是成年人中最多见的一种恶性肿瘤。该肿瘤恶性程度高，预后较差，易行血流转移，主要通过眼球摘除术及相应的放疗、化疗治疗，但效果均不理想和确切。RNA干扰技术的出现已成为生命科学研究和临床治疗的又一次革命。利用RNA干扰技术，体外合成葡萄膜黑色素瘤中的相关的小片段核苷酸（19核苷酸），通过基因工程方法构建质粒，转染人葡萄膜黑色素瘤细胞，对葡萄膜黑色素瘤基因表达产生抑制作用，将会成为治疗葡萄膜黑色素瘤的一条新途径。     

Parthenolide inhibits the proliferation and induces the apoptosis of human uveal melanoma cells

AIM: To explore the effect of parthenolide (PTL) on human uveal melanoma (UM) cells (C918 and SP6.5 cells) and its molecular mechanism. METHODS: Carboxyfluorescein succinimidyl amino ester (CFSE) assays and cell counting kit-8 (CCK-8) were performed to detect the cell viability. Flow cytometry was used to analyze cell cycle and apoptosis. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot assays were performed to measure proliferation-related and apoptosis-related factors. RESULTS: Firstly, PTL decreased the viability of C918 and SP6.5 cells in a dose-dependent manner, and the effect of PTL on C918 cells was stronger than on SP6.5; however, it did not affect normal cells. Secondly, PTL increased the proportion of cell number at cell cycle G1 phase in C918 cells, and decreased the proportion of cell number at S phase, but the proportion did not change at G2 phase. In addition, PTL induced the apoptosis of C918 cells, and decreased the expressions of Cyclin D1, B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) and B-cell lymphoma-extra large (Bcl-XL). Also, PTL increased Cyclin inhibition protein 1 (P21), Bcl-2-associated X protein (Bax), Cysteinyl aspartate specific proteinas-3 (Caspase-3) and Caspase-9 expression. However, the expression of Caspase-8 was not changed. CONCLUSION: PTL inhibites proliferation and induces apoptosis in UM cells by arresting G1 phase and regulating mitochondrial pathway, however, it does not affect normal cells.     

纺锤体动粒相关复合体-1(SKA1)促进葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的分子机制研究

目的 研究纺锤体动粒相关复合体-1(SKA1)促进葡萄膜黑色素瘤(UM)细胞增殖的分子机制.方法 利用SKA1敲减及空载体慢病毒感染MUM-2B细胞分别作为SKA1敲减组和对照组,再以MTT法、流式细胞术及Caspase-3/7法检测各组细胞增殖、凋亡表型的变化;利用基因表达谱芯片筛选差异基因,KEGG富集分析探寻SK...     

石蒜碱对葡萄膜黑色素瘤细胞的作用及其可能机制

目的 探讨石蒜碱对葡萄膜黑色素瘤细胞的作用,并分析其可能机制。方法 取B16F10葡萄膜黑色素瘤细胞株,按石蒜碱浓度为0μmol·L^-1(对照组)、1.560μmol·L^-1、3.125μmol·L^-1、6.250μmol·L^-1、12.500μmol·L^-1、25.000μmol·L^-1进行分组培养,24 h后,CCK-8法检测各组B16F10细胞的存活率;RT-PCR分析各组B16F10细胞VEGF-A mRNA的表达,ELISA检测各组B16F10细胞VEGF-A蛋白表达;流式细胞仪检测各组B16F10细胞的细胞周期及凋亡情况。结果 与对照组相比,1.560μmol·L^-1、3.125μmol·L^-1、6.250μmol·L^-1、12.500μmol·L^-1、25.000μmol·L^-1石蒜碱作用于B16F10细胞24 h后,能够呈浓度依赖性...