人表皮生长因子受体2模拟表位的筛选

目的:从噬菌体12肽库中筛选出人表皮生长因子受体2（Her2）的抗原模拟表位。方法:以曲妥珠单抗为靶分子,在噬菌体12肽库中进行3轮淘选,以ELISA方法及竞争抑制实验鉴定阳性克隆,并对阳性克隆株进行测序。结果:经过3轮淘选,与曲妥珠单抗结合的噬菌体得到了有效富集,回收率从（2.00×10-8）%增加到（2.87×10-5）%,ELISA显示20个克隆中筛选获得了18个与曲妥珠单抗具有较高亲和性的阳性噬菌体,对阳性克隆测序获得两种氨基酸序列:HTSSLWHLFRST、VHWDFRQWWQPS。结论:噬菌体展示技术可成功筛选到表皮生长因子2模拟表位,为探索乳腺癌的防治研究创造了条件。     

随机十二肽噬菌体展示文库筛选血型B抗原模拟多肽的实验研究

目的:筛选出替代血型B抗原的模拟多肽,用多肽抗原替代糖类抗原.方法:抗血型B抗原的单克隆抗体作为固相筛选靶分子,对随机十二肽噬菌体展示文库进行生物淘选(bio-panning),经包被-结合-洗脱-扩增等循环3轮,对筛选的克隆ELISA鉴定,并通过剂量依赖实验验证其结合特异性.最后提取DNA测序,确定模拟肽氨基酸序列.结果:3轮筛选结束,得到2个亲和力较强的十二肽序列TKNMLSL-PVGPG和HSLKHTQMSYSS.结论:经过生物筛选得到模拟多肽序列,利用噬菌体展示技术筛选糖类抗原的模拟肽具有可行性,为糖类抗原的研究提供一种新思路.     

全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定

目的对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定,筛选肝癌抗体,同时对抗体的活性及特异性进行鉴定。方法PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率。先以人成纤维细胞吸附后再以体外培养的肝癌细胞SMMC7721为抗原对所建抗体库进行3轮“吸附洗脱扩增”的亲和筛选。将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定;通过ELISA法及FCM鉴定其与人肝癌细胞及正常细胞的结合活性。结果ScFv基因插入率为70%。在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第3轮为第1轮的214倍。筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定,均可检测到目的基因。ELISA分析结果显示18个克隆与SMMC7721呈阳性反应,阳性率为90%,15个克隆与成纤维细胞有交叉反应。得到3株肝癌单链抗体。ScFv的FCM鉴定表明,以正常胎肝细胞L02为对照,ScFv与肝癌结合比率为41.3%。特异性鉴定表明,其与肝癌细胞结合活性明显高于正常细胞。结论利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性。     

全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定

目的：对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定，筛选肝癌抗体，同时对抗体的活性及特异性进行鉴定。方法：PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率。先以人成纤维细胞吸附后再以体外培养的肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行3轮“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选。将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定；通过ELISA法及FCM鉴定其与人肝癌细胞及正常细胞的结合活性。结果：ScFv基因插入率为70％。在亲和筛选过程中，肝癌噬菌体单链抗体得到富集，收获率逐轮得到提高，第3轮为第1轮的214倍。筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定，均可检测到目的基因。ELISA分析结果显示18个克隆与SMMC-7721呈阳性反应，阳性率为90％，15个克隆与成纤维细胞有交叉反应。得到3株肝癌单链抗体。ScFv的FCM鉴定表明，以正常胎肝细胞L-02为对照，ScFv与肝癌结合比率为41．3％。特异性鉴定表明，其与肝癌细胞结合活性明显高于正常细胞。结论：利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因，且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性。     

人源噬菌体抗体对Peroxiredoxin I高表达肺腺癌细胞增殖的抑制作用

背景与目的：研究表明过氧化物酶Peroxiredoxin I （Prx I）与癌症的发展有密切关系。我们已通过噬菌体展示技术构建了肺腺癌相关的人源单链抗体库。本研究对该库进行筛选,得到抗PrxI肺腺癌单链抗体,并检测其对肺腺癌细胞A549增殖的抑制作用。方法：PCR法检测TG1中scFv基因插入率,1％琼脂糖凝胶电泳鉴定蹄I和Not I双酶切质粒的结果,以A549细胞及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白PrxI为靶抗原分别对抗体库进行3轮筛选富集。将阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测。放射性核素计数法测定细胞单链抗体内摄水平,MTT法及流式细胞术检测单链抗体对A549细胞的增殖抑制和凋亡情况,免疫印迹法检测抗体作用A549细胞后PrxI的表达水平。结果：scFv基因插入率为77％,双酶切鉴定检测到目的条带。在亲和筛选过程中．肺腺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍。ELISA法检测到在随机选取的10个克隆中．有6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率60％。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗Prx I肺腺癌单链抗体。被A549细胞内摄的单链抗体介导了细胞的凋亡以及细胞内PrxI蛋白表达水平的下降。结论：从噬菌体抗体库中筛选获得具有较高特异性的抗PrxI肺腺癌单链抗体。单链抗体与肺腺癌细胞有特异性亲和力,并能有效抑制其增殖。     

抗人肺癌噬菌体展示可溶性ScFv的筛选与鉴定及其序列测定

目的:制备抗人肺癌单链抗体(single chain Fv ferment antibody,ScFv),并对抗体生物学特性进行初步研究.方法:以人肺腺癌细胞系A2为抗原,对5 F-11杂交瘤细胞噬茵体抗体库进行富集和筛选.以人肺腺癌细胞系A2和正常人淋巴细胞为抗原,进行酶联免疫吸附试验,从富集后的噬菌体抗体库中筛选出只与A2细胞结合的阳性克隆.筛选的噬茵体克隆转染大肠埃希茵HB2151,得到可溶性单链抗体分泌克隆.可溶性抗体分泌克隆测序.应用 ELISA、竞争性ELISA、SDS-PAGE及蛋白质印迹法对其中的2A7-1克隆进行初步鏊定.结果:以肺腺癌细胞A2为抗原进行了4轮富集.进一步筛选得到18个仅识别A2细胞而与人淋巴细胞无反应的融合抗体分泌克隆.转染大肠埃希茵HB2151后筛选到能与A2细胞特异结合的可溶性抗体分泌克隆2A7-1.竞争性ELISA结果显示,5F-11能强烈抑制2A7-1与A2细胞的结合.SDS-PAGE蛋白质印迹法显示得到大小约为30×103的单链抗体.结论:通过噬菌体抗体技术成功分离到了鼠单抗5F-11的可溶性ScFv分泌克隆,为进一步的抗体应用研究奠定了基础.     

人源抗肝癌单链抗体库的构建及初步鉴定

目的构建人源抗肝癌单链抗体基因噬菌体表面呈现文库。方法利用噬菌体表面呈现技术,构建基因文库,经过panning筛选富集后,用ELISA方法检验抗原结合活性。结果从30个噬菌体克隆中筛选到8个具有肝癌细胞株SMMC7721结合活性的阳性克隆。结论从外周血淋巴细胞中获取可变区基因,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗肝癌单链抗体的策略是可行的。     

全人源食管癌噬菌体单链抗体库的筛选及特异性鉴定

目的：我们应用噬菌体抗体库技术构建了食管癌相关的人源单链抗体文库，本文目的在于对该抗体库进行鉴定，筛选食管癌抗体，同时对抗体的活性进行检测。方法：PCR鉴定TG1中食管癌单链抗体scFv的插入率；1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定Sfi I和NotI双酶切质粒的结果；先以人正常食管上皮细胞吸附后再以食管癌细胞Eca109为抗原对所建抗体库进行4轮的亲和筛选；将阳性重组噬菌体克隆感染Ecoli HB2151进行可溶性抗体表达及经亲和柱层析纯化；用SDS—PAGE测定该抗体的相对分子量；用Western blot鉴定该抗体；用ELISA法、免疫组化法鉴定该抗体与人食管癌细胞的结合的特异性。结果：seFv基因插入率为91．7％；酶切后检测到目的基因片段。在亲和筛选过程中，食管癌噬菌体单链抗体得到富集，收获率逐轮得到提高，第4轮为第1轮的141倍；SDS—PAGE与Western blot结果显示抗体的相对分子量为左右和30kd条带染色；在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅染食管癌组织，而肝癌组织和胃癌组织不染色。免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使Eca109细胞染色。ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的免疫活性，能与Eca109细胞结合，而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合。结论：利用噬菌体抗体库技术的阴性、阳性筛选得到了食管癌噬菌体单链抗体，且筛选后的抗体片段与人食管癌细胞有特异性的结合活性。     

与肺癌源性HSP70特异性结合单链融合抗体的筛选与序列分析

目的从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选与肺癌源性HSP70特异性结合的融合抗体。方法以肺癌源性的HSP70为抗原,对人源性肺癌噬菌体单链抗体库中经四轮筛选,单克隆噬菌体抗体与抗原HSP70结合经ELISA检测筛选出阳性菌株,再经PCR进一步鉴定,确定含有单链抗体基因的克隆并测序,测序结果通过GeneBank比对进行同源性分析。结果获得了1个特异性强的阳性噬菌体克隆。经DNA测序后,在Genebank中与人的免疫球蛋白库进行比对,确定为单链抗体片段。结论从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选到与HSP70特异性结合的具有功能活性的单链融合抗体,为进一步的HSP70可溶性抗体的制备以及以可溶性HSP70抗体为载体的药物导向抗肿瘤治疗奠定了基础。     

人源噬菌体抗体对Peroxiredoxin Ⅰ高表达肺腺癌细胞增殖的抑制作用

背景与目的:研究表明过氧化物酶Peroxiredoxin Ⅰ(Prx Ⅰ)与癌症的发展有密切关系。我们已通过噬菌体展示技术构建了肺腺癌相关的人源单链抗体库。本研究对该库进行筛选,得到抗Prx Ⅰ肺腺癌单链抗体,并检测其对肺腺癌细胞A549增殖的抑制作用。方法:PCR法检测TG1中scFv基因插入率,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定Sfi Ⅰ和Not Ⅰ双酶切质粒的结果,以A549细胞及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白Prx Ⅰ为靶抗原分别对抗体库进行3轮筛选富集。将阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测。放射性核素计数法测定细胞单链抗体内摄水平,MTT法及流式细胞术检测单链抗体对A549细胞的增殖抑制和凋亡情况,免疫印迹法检测抗体作用A549细胞后Prx Ⅰ的表达水平。结果:scFv基因插入率为77%,双酶切鉴定检测到目的条带。在亲和筛选过程中,肺腺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍。ELISA法检测到在随机选取的10个克隆中,有6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率60%。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗PrxI肺腺癌单链抗体。被A549细胞内摄的单链抗体介导了细胞的凋亡以及细胞内Prx...     

结肠癌单抗MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段的制备

背景与目的：MC5是一种特异性良好的针对人结肠癌的鼠源性单克隆抗体,而将鼠源性抗体小型化可使其用于在体研究时引起人抗鼠抗体反应的可能性大大降低。本研究的目的是制备MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段（ScFv)。方法：从分泌MC5的杂交瘤细胞分离mRNA,RT-PCR分别扩增抗体的重,轻链可变区DNA（VH和VL DNA）,两者经linker DNA连接形成ScFvDNA,将ScFvDNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7辅助噬菌体感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv,以高表达MC5结合抗原的细胞株SW480对重组噬菌体抗体ScFv进行两轮筛选后,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现MC5 ScFv的噬菌体单克隆,经竞争ELISA对阳性克隆结合抗原的能力进行鉴定。结果：VH,VL和ScFvDNA分别约为340bp,320bp和750bp,在随机筛检的25个克隆中得到10个呈现MC5ScFv的噬菌体单克隆,其中结合抗原能力强的克隆有3个,结论：用噬菌体呈现技术成功地制备了单抗MC5的ScFv,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。     

鼻咽癌人源抗独特型单链抗体的制备及筛选

背景与目的:抗独特型抗体作为肿瘤抗原替代物可用于肿瘤治疗,这已在临床试验中得到证实。但由于目前所使用的抗独特型抗体多为鼠源性,用于人体可产生人抗鼠抗体反应,从而影响疗效。本实验拟构建噬菌体人源抗独特型抗体库,并从中筛选出能模拟鼻咽癌相关抗原的β型抗独特型单链抗体scFv(Ab2βscFv),以解决鼠源性抗独特型抗体用于临床所产生的人抗鼠抗体反应。方法:体外致敏并用EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)转化鼻咽癌患者的外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC),用RT-PCR分别扩增VH和VL基因并连接成scFv基因,将scFv基因与载体fUSE5连接后,转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型scFv库。在用单抗FC2对文库进行4轮筛选后,用SandwichELISA和结合抑制法从中筛选出β型Ab2scFv。结果:用单抗FC2体外致敏并经EBV转化的10例鼻咽癌患者的PBMC中,8例有鼻咽癌抗独特型抗体产生。经PCR分别扩增出5种VH(γ、μ)和7种VL(κ、λ)基因,经连接组成14种scFv基因。在与载体连接后,导入大肠杆菌MC1061,得到库容为1.5×108的初级噬菌体抗独特型抗体库。经富集筛选后,从中随机挑取270个克隆进行ELISA筛选,得到91个Ab2scFv单克隆,阳性率为33.7%。再用结合抑制法从中初步筛选出5个可能为β型的Ab2scFv。结论:联     

ISOLATION OF ENDOTOXIN-SPECIFIC ANTIBODIES BY SELECTION OF AN SINGLE CHAIN PHAGE ANTIBODY LIBRARY

The development of antibody is now in the era of genetic engineered antibody after polyclonal antibody and monoclonal antibody. Among this, the technique of phage antibody library that is based on Smith抯 phage surface display system reported in 1985[1] has great potential in not only the preparation of human originated antibody but also the diagnosis and treatment of tumor. According to recent data, related papers have been increasingly reported on malignant melanoma[2-4], tumor-associated an…     

肿瘤特异单链抗体库的构建及肿瘤血管特异性结合抗体的体内筛选

目的:研究化疗药物依托泊苷对腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内表达水平的影响。方法:携带外源基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-EGFP(MOI为1或10)单独或联合终质量浓度为0.2、2、20、40、80、100和200μg/ml的依托泊苷感染体外培养的肿瘤细胞NCI-H446(人非小细胞肺癌细胞株)、A549(人肺腺癌细胞株)、SMMC-7721(人肝癌细胞株)、SGC7901(人胃癌细胞株)、SKBR-3(人乳腺癌细胞株)和BTT(小鼠膀胱移行上皮癌细胞株)后不同时间,流式细胞仪分析肿瘤细胞EGFP阳性率和平均荧光强度,Western blotting检测EGFP蛋白表达,RT-PCR和实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞内EGFP的mRNA表达量和DNA拷贝数。结果:不同剂量的依托泊苷可不同程度地提高Ad5-CMV-EGFP在7种肿瘤细胞内的表达水平,但对EGFP阳性率无明显提高。10MOI的Ad5-CMV-EGFP联合40μg/ml依托泊苷分别感染肿瘤细胞NCI-H446、NCI-H460、A549、SMMC-7721、SGC7901、SKBR-3和BTT24h后,细胞内EGFP的荧光强度分别是单独感染的3.3、3.5、3.1、6.2、7.0、5.4和3.4倍。Ad5-CMV-EGFP联合应用依托泊苷后肿瘤细胞内EGFP蛋白表达增加2~5倍,EGFP mRNA表达量提高,但DNA拷贝数未见明显改变。结论:依托泊苷可提高腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内的表达水平,该作用可能是在转录水平上发挥作用的。     

乳腺癌干细胞新型多肽标志物的筛选

目的:从噬菌体随机十二肽库中筛选出能够与乳腺癌干细胞(breast cancer stem cell,BCSC)特异性结合的噬菌体,筛选后提取多肽以研究其与BCSC的亲和力和特异性。方法:通过"无血清-有血清"交替培养法培养人乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞系,以求最大化富集BCSC,将hs578bst正常人乳腺细胞和普通培养的乳腺癌细胞用作减性筛选细胞,筛选噬菌体随机肽库;然后根据筛选结果选取阳性噬菌体进行单克隆扩增并测序,得到测序结果后依据合成多肽,标记以FITC;最后,建立乳腺癌动物模型,并在体外观察合成多肽与BCSC结合的特异性。结果:经过3轮筛选,噬菌体富集约200倍;随机选出10株单克隆噬菌体,与BCSC共同培养,其中与MCF7和MDA-MB-231乳腺癌干细胞阳性结合的噬菌体数目分别为6株和8株;分别从中选取1个阳性噬菌体进行测序,合成多肽后分别命名为A3和B8;多肽A3特异性结合MCF7乳腺癌干细胞,同时多肽B8特异结合MDA-MB-231乳腺癌干细胞。结论:噬菌体随机肽库可成功筛选出能够特异性结合BCSC的多肽,为BCSC的靶向治疗和进一步研究奠定了理论基础。     

噬菌体随机12肽库筛选肝癌患者血清肿瘤标记物的初步研究

目的：从噬菌体随机多肽文库中,筛选出能与肝癌患者血清特异性结合的短肽分子.方法：采用肝癌患者血清作为配基,筛选以融合蛋白形式在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ表达的随机12肽文库.按吸附一洗脱一扩增的淘筛过程,经3轮淘筛后,随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性,评价分析其诊断肝癌的价值.结果：经3轮淘筛后,特异性结合的噬菌体富集增加近100倍.用.ELISA检测第3轮筛选后随机挑取的单个噬菌体克隆,其中特异性最好的3个克隆具有诊断肝癌的潜在价值.结论：噬菌体展示肽库技术,可以有效进行肝癌相关抗原肽的筛选研究,为获得特异性诊断试剂进而为肝癌的诊断提供依据.     

T7噬菌体展示文库筛选肺癌早期检测分子标志群

目的从肺癌T7噬菌体展示文库筛选出能用于肺癌早期检测的分子标志群。方法亲和筛选肺癌T7噬菌体展示文库,对纯化后的富集肺癌相关肽的文库进一步行两轮ELISA检测,PCR扩增阳性噬菌体插入片段,测序后经过NCBI上的BLAST序列比对。结果筛选出13个有意义噬菌体,测序结果显示1个为未知功能的新基因,其余的均已确定与癌症相关;且13个基因中包含有三组相同的基因。结论从T7噬菌体构建的肺癌cDNA文库中筛选出的一组阳性噬菌体表达的抗原,可能是潜在的肺癌诊断分子标志群。