X连锁无汗性外胚叶发育不良家系的基因突变检测

目的 鉴定X连锁无汗性外胚叶发育不良(EDA)家系的基因突变及其突变类型,为建立对该病的基因诊断与遗传咨询提供依据。方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析法,结合DNA测序,检测了汉族人X连锁EDA一家系的基因突变位点与突变方式。结果 EDA致病基因(EDA1基因)外显子1的PCR产物经SSCP分析显示,患者及其携带者母亲出现异常单链条带。DNA测序表明,先证者该基因外显子1的第404位碱基胞嘧啶C被鸟嘌呤G颠换,致使EDA蛋白跨膜区第54位组氨酸突变成谷胺酰胺(H54Q),其母亲同一位置碱基呈现C～G杂合双峰。结论 本EDA家系中患者EDA1基因外显子1存在错义突变(404C→G),这可能是导致EDA发病的分子机制之一。     

痒疹样营养不良型大疱性表皮松解症一家系的基因突变

目的 鉴定一痒疹样营养不良型大疱性表皮松解症家系的基因突变,为进一步开展基因诊断和基因治疗奠定基础.方法 应用聚合酶链反应(PCR)、DNA直接测序明确突变位点,根据突变位点设计等位基因特异性引物,用PCR来检测突变位点以及采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和克隆测序进一步确定该家系的致病原因.结果 该家系中患者COL7A1基因的87号外显子存在剪接位点突变,导致87号外显子被剪切,Ⅶ型胶原的胶原区合成后缺少了23个氨基酸.健康对照不存在此突变.结论 COL7A1基因剪接位点的突变是引起该家系临床症状的特异突变,而非多态性改变.     

先天性角化不良的一个新的基因突变

目的 检测一例先天性角化不良(DKC)患者DKC1基因的突变情况。方法 采用PCR技术扩增DKC1基因的15个外显子,然后采用变性高效液相色谱(DHPLC)技术进行基因突变筛查,对筛查结果异常的外显子进行DNA测序:基因突变的验证在100例无相关遗传性疾病的无关男性中进行。结果 患者DKC1基因的第12号外显子呈异常的DHPLC洗脱峰,家庭其他成员及正常群体对照未见此异常洗脱峰。测序结果显示患者DKC1基因第12外显子的1236位碱基由G→T,导致W412C突变,家庭其他成员及正常群体对照均未见此突变。结论 我们检测到的患者DKC1基因W412C是一个新的散发性突变,它可能导致患者先天性角化不良。     

多发性家族性毛发上皮瘤致病基因的确定

目的 对多发性家族性毛发上皮瘤一家系进行基因定位及候选基因突变检测。方法 共用18对覆盖9p21和16q12-q13的微卫星标记对一个多发性家族性毛发上皮瘤家系进行局部基因组扫描,并用Linkage软件进行两点参数连锁分析,最后PCR扩增CYLD1基因的17个编码外显子及其邻近剪接子并进行双向直接测序。结果 ①两点参数连锁分析在常染色体显性遗传模式下,外显率为99.9%、基因频率0.00001时在D16S3068位点处得出LOD值=3.31(θ=0.00),排除与9号染色体连锁;②突变分析在CYLD1基因第18号外显子出现连续的4个碱基缺失,即c.2355-2358delCAGA。结论 多发性家族性毛发上皮瘤存在着遗传异质性,本家系的致病基因位于16q12-q13,而不在9p21。     

A型着色性干皮病中XPAC基因的无义突变

目的 检测国内一A型着色性干皮病家系中XPAC基因的突变。方法 PCR扩增XPAC基因的全部外显子,并行DNA测序。针对所发现的突变以DdeⅠ内切酶行限制性片段长度多态性(RFLP)分析。结果 PCR结合DNA测序发现患者XPAC基因第5外显子存在异常:第631位碱基由胞嘧啶突变为胸腺嘧啶,使第211位氨基酸由精氨酸变为终止密码(R211X),导致其编码的XPA蛋白缺失了C端的63个氨基酸。其父母皆为杂合子。RFLP结果证实了此突变的存在。结论 本A型着色性干皮病家系中存在XPAC基因突变,突变致使XPA蛋白功能缺陷,DNA损伤的修复功能受损,导致临床上出现皮肤老化和癌变。     

角膜炎、鱼鳞病、耳聋综合征的GJB2基因突变研究

目的 检测国内首例先天性角膜炎、鱼鳞病、耳聋综合征(KID)患者的GJB2基因和GJB6基因突变.方法 提取KID综合征患者及家族成员的基因组DNA,采用聚合酶链反应扩增GJB2基因和GJB6基因所有的外显子及其邻近的剪切点,并进行双向直接测序.结果 KID综合征患者的GJB6基因未见变化,GJB2基因核苷酸序列exon2第148位碱基由G突变成A,导致蛋白第50位的天冬氨酸转换成天冬酰胺(D50N).结论 GJB2基因突变可能是本例角膜炎、鱼鳞病、耳聋综合征的致病基因.     

一个先天性角化不良家系中DKC1基因突变的检测

目的 研究先天性角化不良(DKC)一家系的基因突变情况和遗传方式.方法 采用聚合酶链反应-DNA直接测序方法检测DKC1基因的突变,并用限制性内切酶酶切方法鉴定和检测DKC1基因的突变.结果 家系中2例患者均存在DKC1基因的1058C→T突变,从而导致编码蛋白—角化不良素(dyskerin)发生A353V突变.其母亲和姐姐为该突变的杂合子,但表型正常.结论 该家系为X性联隐性遗传型DKC,存在DKC1基因1058C→T突变.     

X性连锁少汗性外胚层发育不良家系ED1基因突变检测

目的 探讨X性连锁少汗性外胚层发育不良(XLHED)家系中ED1基因突变。方法 收集2个X性连锁少汗性外胚层发育不良家系外周血标本;采用聚合酶链反应(PCR)结合DNA直接双向测序的方法。结果 家系1中ED1基因的第8个外显子下游与内含子8交界处存在一个新的剪接点缺失突变(IVS8+5 del G)。家系2中第9个外显子处存在一个错义突变(A959G)。这些突变未在两个家系的正常人及188例无关正常对照者中出现。结论 中国人ED1基因突变可引起XLHED,且IVS8+5del G为一个新的突变。     

一遗传性对称性色素异常症家系ADAR基因突变检测

目的 探讨遗传性对称性色素异常症(DSH)一家系ADAR基因突变情况。方法 收集1个遗传性对称性色素异常症家系的外周血标本,采取PCR结合DNA直接测序的方法,检测了该家系中4例患者及3例表型正常者和150例无亲缘关系健康个体的ADAR基因突变情况。结果 该家系中患者存在ADAR基因上第2879位碱基腺嘌呤(A)转换成鸟嘌呤(G),使得ADAR基因的第10号外显子960位密码子由TAT突变成TGT,导致正常的酪氨酸(Tyr)被半胱氨酸(Cys)替代,而该家系的正常人对照及无关健康个体不存在此突变。结论 DSH家系中患者ADAR基因存在错义突变(2879 A→G),这可能是导致DSH发病的分子机制之一。     

伴丘疹性损害的先天性无毛症一例及其基因突变的研究

目的 研究1例伴丘疹性损害的先天性无毛症患者及其家系中无毛基因的突变情况。方法 取患者皮损进行组织病理检查;提取家系成员的基因组DNA,采用聚合酶链反应扩增无毛基因的全部编码序列并结合DNA直接测序方法,检测患者无毛基因的突变。结果 患者无毛基因存在两处杂合突变:第3外显子的1010位碱基由鸟嘌呤变为腺嘌呤,使第337位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸(G337D);第4外显子的1491位碱基由胞嘧啶变为胸腺嘧啶,使第498位氨基酸由谷氨酸突变为终止密码(Q498X)。而其父母及一弟该基因仅存在其中的一处杂合突变。结论 该患者无毛基因中G337D及Q498X两处突变可能使该基因无法编码正常的蛋白,为导致临床表现的特异突变。     

三个表皮松解性掌跖角化症家系KRT9基因突变的研究

目的 探讨表皮松解性掌跖角化症家系的KRT9基因突变与临床表现的关系。方法 PCR扩增KRT9基因编码氨基酸的7个外显子,对扩增产物进行变性高效液相色谱分析、DNA测序。结果 在所研究的3个EPPK家系中,发现KRT9基因第1外显子第497位核苷酸A缺失并插入GGCT,导致角蛋白9分子第166位酪氨酸缺失并插入色氨酸和亮氨酸,即Y166delinsWL。片段特异性PCR证实了该突变不是一个常见的多态性,而是国际中间纤维突变库(http://www.interfil.org)中未报道过的一种新突变。结论 KRT9基因497delAinsGGCT突变可能是部分中国人EPPK患者发病的遗传基础。     

皮肤癌组织中p53基因的光突变

目的 了解皮肤癌皮损中p53基因的突变特点。方法 以聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和自动DNA分析检测p53基因5～8外显子的序列变化。结果 32.5%(13/40例)的皮肤癌组织出现p53基因突变,其中92.3%(12/13例)发生于曝光部位,包括36.4%(8/22例)的鳞状细胞癌和27.8%(5/18例)的基底细胞癌。在13处突变中,12处为单核苷酸突变,占92.3%;10处为错义突变,占76.9%;3处为无义突变,占23.1%.其中6处为光致突变,占46.2%,包括发生于双胞嘧啶位置的C→T突变5处和CC→TT突变1处。结论 光照参与皮肤癌患者的发病机制;光照导致的p53基因突变参与光致癌过程;尚有其他致癌因素参与皮肤癌的发生。     

Hallopeau-Siemens型营养不良型大疱性表皮松解症一例产前诊断

目的 鉴定一常染色体隐性遗传营养不良型大疱性表皮松解症家系的突变后,对患者的下一代开展产前诊断.方法 首先对患者和患者妻子进行COL7A1基因全部118个外显子的扩增和直接测序.然后从孕15周患者妻子的羊水中提取胎儿的DNA,应用聚合酶链反应(PCR)、DNA直接测序和限制性片段长度多态性(RFLP)的方法来检测突变位点,从而进一步确定该胎儿是否患病.结果 发现该患者COL7A1基因的1条等位基因第2号外显子上存在S48P的错义突变,而另1条等位基因第27号外显子上存在3625del11缺失突变,造成编码区阅读框架的移位,最终导致蛋白终止密码(PTC)的产生.患者妻子该基因全序列完全正常.胎儿COL7A1基因的1条等位基因第27号外显子上存在3625del11缺失突变,而另1个第2号外显子序列正常.因此证实该胎儿为携带者,胎儿出生后临床表型正常.结论 完成我国首例常染色体隐性遗传的营养不良型大疱性表皮松解症的DNA基础的产前诊断.     

板层状鱼鳞病TGM1基因突变研究

目的 探讨一个板层状鱼鳞病家系转谷氨酰胺酶1基因(TGM1)的突变.方法 提取板层状鱼鳞病患者及家族成员的基因组DNA,采用PCR扩增TGM1基因所有的外显子及其邻近的剪切点并进行双向直接测序,并对TGM1基因的同源性进行分析.结果 板层状鱼鳞病患者TGM1基因存在异常:外显子3的第504位碱基由胞嘧啶突变为胸腺嘧啶,使第142位氨基酸由精氨酸(R)转变为半胱氨酸(C),即R142C错义突变;外显子7的第1122位碱基由胞嘧啶突变为胸腺嘧啶,使348位氨基酸由精氨酸(R)突变为终止密码(R348X),导致其编码的蛋白缺失了C端的470个氨基酸.其父亲为R142C杂合子,母亲为R348X突变杂合子;R142C错义突变位于TGM1基因保守区域.结论 该板层状鱼鳞病患者存在转谷氨酰胺酶1基因的R142C错义突变和R348X无义突变.     

板层状鱼鳞病患者转谷氨酰胺酶1活性缺失及其基因突变

目的 检测一板层状鱼鳞病家系中患者转谷氨酰胺酶1的活性及其编码基因的突变。方法 以免疫组化法检测患者转谷氨酰胺酶1的活性,PCR扩增该基因的全部编码序列,并行DNA测序。结果 患者皮肤转谷氨酰胺酶1的活性完全缺失。PCR结合DNA测序发现患者该基因第4外显子存在异常:第604位碱基由胞嘧啶突变为胸腺嘧啶,使第202位氨基酸由谷氨酰胺(Q)变为终止密码(R202X),导致其编码的蛋白缺失了C端的615个氨基酸。其父母皆为杂合子。结论 板层状鱼鳞病患者转谷氨酰胺酶1的活性完全缺失,是其转谷氨酰胺酶1基因的无义突变,引起编码的蛋白缺陷。     

系统性红斑狼疮患者DNaseⅠ基因突变与血清DNaseⅠ活性的关系

目的 探讨SLE患者血清中脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)活性下降与DNaseⅠ基因突变的内在联系。方法 选择SLE患者70例,用DNA-甲基绿比色法测定血清DNaseⅠ的活性,并以正常人作平行对照;收集SLE患者100例,应用限制性片段长度多态性检测患者体细胞DNaseⅠ基因组第172位A→T的基因突变。突变后的基因产生一个NSPⅠ酶切位点,在适当条件下进行酶切可鉴别出发生突变的基因。结果 该组病例中未发现体细胞DNaseⅠ基因组第172位A→T的突变。结论 我国SLE人群中暂未发现该突变位点,SLE患者DNaseⅠ活性降低可能与该基因突变无关。     

一例显性营养不良型大疱性表皮松解症的基因突变检测

目的 研究1例营养不良型大疱性表皮松解症家系中的基因突变情况.方法 经组织病理、电镜及免疫荧光方法结合临床诊断为显性营养不良型大疱性表皮松解症1例,采用聚合酶链反应(PCR)DNA直接测序,限制性内切酶反应及应用D3S1359、D20S161、D5S818、D17S1293、CSFIPO五个座位微卫星DNA多态标志的方法对此例患者家系进行基因突变情况检测.结果 家系中患者存在COL7A1上第6240位鸟嘌呤G被腺嘌呤A替代突变导致Ⅶ胶原第2043位的甘氨酸被精氨酸替代,而其父母及对照的健康人均不存在此突变.结论 G2043R是引起该家系临床病变的特异突变,不是多态性变化,且此突变为一个denovo突变.     

β联蛋白和淋巴样增强因子1在恶性黑素瘤中的表达

目的 探讨β联蛋白、淋巴样增强因子1在恶性黑素瘤中的表达及意义.方法 采用免疫组化PowerVision^TM二步法检测25例皮内痣、45例恶性黑素瘤中β联蛋白、淋巴样增强因子1的表达情况.结果 β联蛋白在恶性黑素瘤中异常表达率为73%,皮内痣为36%,两组差异有统计学意义;淋巴样增强因子1在恶性黑素瘤中阳性表达率为62.2%,皮内痣组为0,两组差异有统计学意义.肿瘤组织中淋巴样增强因子1高表达率与淋巴结转移、TNM分期密切相关(P<0.05),而β联蛋白异常表达率与淋巴结转移及TNM分期无明显关系;β联蛋白异常表达与淋巴样增强因子1高表达之间存在正相关(P<0.05).结论 β联蛋白、淋巴样增强因子1异常表达可能与恶性黑素瘤发病相关.     

遗传性对称性色素异常症一家系致病基因的定位和突变研究

目的 探讨遗传性对称性色素异常症家系的致病基因。方法 明确先证者的临床诊断后,收集该家系成员的血样抽提基因组DNA,应用基因分型和连锁分析的方法进行基因定位,并对该定位区域内DSRAD基因直接测序,分析其突变位点。结果 基因分型和连锁分析将该家系的致病基因定位于1号染色体,和已知报道的区域一致。突变研究发现该家系所有患者的DSRAD基因2号外显子均携带CAA→TAA的突变,使得517位氨基酸由谷氨酰胺变成中止密码子。结论 该遗传性对称性色素异常症家系中的患者存在DSRAD基因的无义突变。     

人乳头瘤病毒cp6108的序列研究

目的 对尖锐湿疣中人乳头瘤病毒(HPV)cp6108进行序列研究。方法 应用TA克隆后测序和PCR产物直接测序进行HPV cp6108的基因序列测定。结果 5例HPV cp6108阳性的尖锐湿疣的模板DNA经TA克隆后测序和PCR产物直接测序结果显示,两种测序结果一致,BLAST比对结果显示,与基因库中HPV cp6108提交序列有99%的一致性,排在比对结果第1位,所有标本的cp6108的序列与网上提交序列对比后发现均有3处相同的密码子发生改变(以起始密码子GCA之G为第1位):第210位核苷酸G(鸟嘌呤,)突变为A(腺嘌呤),导致第70位密码子GAG→GAA,发生同义突变;第229位核苷酸G(鸟嘌呤)突变为A(腺嘌呤),导致第77位密码子GAT→AAT,编码的氨基酸由天冬氨酸(Asp,D)变为天冬酰氨(Asn,N),即发生D77N错义突变;第346位核苷酸A(腺嘌呤)突变为C(胞嘧啶),导致第116位ACT→CCT,编码的氨基酸由苏氨酸(Thr,T)变为脯氨酸(Pro,P),即发生T116P错义突变。结论 与基因库提交序列相比,本研究检测到的HPV cp6108序列中有3处突变,其中G70A为同义突变,D77N和T116P为错义突变。