凝血酶对大鼠尾状核区神经细胞DNA损伤的动态研究

目的　研究脑出血血液凝固释放的凝血酶对神经细胞DNA的损伤 ,探讨脑出血神经细胞损伤的机制。方法　采用立体定位技术 ,将 15U凝血酶注入大鼠右侧尾状核 ,并用凝血酶的特异抑制剂水蛭素进行干预 ,于不同时相点测定TUNEL阳性细胞及caspase 3免疫反应性 (Immunoreactivity ,IR)细胞的表达。结果　凝血酶组TUNEL阳性细胞于造模后 12h出现 ,3d达到高峰 ,1周仍有较多表达 (P <0 0 1) ;caspase 3IR 6h开始表达 ,1d达高峰 ,1周仍有少量表达。水蛭素干预组TUNEL阳性细胞较凝血酶组明显减少 (12h ,1d ,3d ,1周 ,P <0 0 1) ;caspase 3IR较凝血酶组明显降低 (6h ,12h ,1d ,3d ,P <0 0 1;1周 ,P <0 0 5 )。结论　 15U的凝血酶可导致大鼠尾状核区神经细胞DNA损伤 ,损伤持续时间 1周以上 ;凝血酶释放很可能是脑出血神经细胞凋亡的机制之一。     

凝血酶与出血性脑组织损伤的相关性动物实验研究

目的 观察大鼠脑内注入凝血酶或全血后神经细胞凋亡和脑组织水肿的动态改变，并观察凝血酶特异性抑制剂（水蛭素）能否减轻凝血酶对脑组织的损伤。方法 成年168只SD大鼠随机分为5组，即凝血酶组、脑出血组、凝血酶加水蛭素组、脑出血加水蛭素组和生理盐水对照组，分别向大鼠右侧基底节区注入凝血酶、全血、凝血酶加水蛭素、全血加水蛭素和生理盐水，于注射后6、24、72h，7d取脑组织，检测脑组织水含量（干湿重法）、神经细胞的凋亡情况（Tunel法）。结果 与生理盐水对照组比较，凝血酶组和脑出血组的脑组织水含量及凋亡细胞数明显增加。时效学研究显示脑出血组脑组织水肿和神经细胞凋亡开始于术后6h，72h达高峰，7d后下降；凝血酶组开始于术后6h，24h达高峰，72h下降。与生理盐水对照组比较，脑出血组术后6h凋亡细胞数无统计学差异（P〉0、05），凝血酶组注入凝血酶后6h凋亡细胞数有明显增加（P〈0、05）。水蛭素干预后脑出血组和凝血酶组的脑组织水含量和神经细胞凋亡数明显降低（P〈0、05）。结论 大剂量凝血酶诱导的组织水肿和细胞凋亡在24h达高峰，脑出血后组织水肿及细胞凋亡均于72h达高峰可能与脑出血后凝血酶逐渐由血肿释放有关，水蛭素能显著减轻脑组织水肿和神经细胞凋亡。     

低强度微波辐射对大鼠皮层神经细胞的损伤作用

[目的]观察低强度微波辐射对大鼠皮层神经细胞的损伤作用.[方法]在对体外新生大鼠大脑皮层神经细胞进行原代培养的基础上,以频率900MHz,功率密度为0.05mW/cm2的低强度微波辐射4、8、12、16、20、24小时.检测乳酸脱氢酶(LDH)活性及细胞死亡率.[结果]低强度微波辐射12小时组神经细胞LDH活性和细胞死亡率均明显增高(LDH活性P＜0.05,细胞死亡率P＜0.01),且随着辐射时间的延长,LDH活性和细胞死亡率也逐渐上升.[结论]低强度微波辐射对培养大鼠皮层神经细胞存在损伤作用.     

重组人红细胞生成素对肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤的保护作用

目的 探讨磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)-糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)通路对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺血再灌注(IR)损伤过程中细胞凋亡的调控以及重组人红细胞生成素(rHuEPO)对其保护作用.方法 正常培养的HK-2细胞,分为7组:正常对照组、IR组、LY294002干预组(P13K-Akt阻断剂,10 μmol/L)、LiCl干预组(GSK-3β阻断剂,20 μmol/L)、rHuEPO干预组(20 U/L)、rHuE-PO+LY294002干预组、rHuEPO+LiCl干预组.Western印迹法检测Akt(Ser473)、GSK-3β(Set9)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)活性;MTT法检测细胞活力;Annexin V和PI染色结合流式细胞仪技术检测细胞凋亡.结果 IR损伤诱导HK-2细胞凋亡率上调(15.20%±1.43%)、Akt活性水平下降、GSK-3β及caspase-3酶活性水平上调,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);与IR组相比,LY294002干预使细胞凋亡率进一一步上调(18.20%±2.06%)、Akt活性水平下调、GSK-3β及caspase-3酶活性上调,LiCl干预使细胞凋亡率下调(12.30%±0.85%)、Akt活性水平上调、GSK-3β及caspase-3酶活性下调,差异均有统计学意义(P＜0.05).rHuEPO干预组与IR组相比,细胞凋亡率下降(11.10%±1.62%)、Akt活性水平升高,GSK-3β及caspase-3酶活性下调,差异有统计学意义(P＜0.05).与rHuEPO干预组相比,rHuEPO+LY294002干预组细胞凋亡率升高(13.40%±1.94%)、Akt活性水平下降,GSK-3β及caspase-3酶活性上调,rHuEPO+LiCl双干预细胞凋亡率下调(7.50%±1.31%)、Akt活性水平上升,GSK-3β及caspase-3酶活性下降,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 IR损伤可引起肾小管上皮细胞凋亡,Akt活性降低,GSK-3B活性升高影响caspase-3依赖的外源性凋亡途径可能是其凋亡机制之一.rHuEPO可通过增强Akt活性,降低GSK-3β及caspase-3酶活性,减轻细胞凋亡,对HK-2IR损伤有一定的保护作用.     

凝血酶对食管癌细胞EC109细胞迁移的影响

目的：探讨凝血酶对食管癌细胞EC109细胞迁移的影响。方法：EC109分别接种于96孔培养板各孔,贴壁后划痕,分别加入不同浓度的凝血酶,作用时间12、24、48、72h。同时设置水蛭素组、凝血酶＋水蛭素组及无药组。拍照并测量计算细胞迁移距离。结果：凝血酶组各浓度在不同作用时间的迁移距离与水蛭素组、凝血酶＋水蛭素组和无药组比有统计学意义（P〈0.05）,水蛭素组、凝血酶＋水蛭素组与无药组比无统计学意义,凝血酶组各浓度间比无统计学意义。结论：凝血酶可增强EC109细胞迁移能力。     

环王巴明加剧大鼠脑缺血再灌注损伤

目的 探讨环王巴明(Cyc)对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响.方法 60只SD雄性大鼠随机分成假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注对照组(Con组)和脑缺血再灌注Cyc干预组(Cyc组),每组20只.于脑缺血再灌注后3h腹腔注射Cyc(10 mg/kg)或无水乙醇,连用7d.采用Longa评分法行脑缺血后1d和14d神经功能缺损评分.脑缺血24 h时,干湿质量法检测脑含水量,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色测脑梗死体积,H-E染色观察病理改变,原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡.免疫化学法检测缺血后24 h NeuN、caspase-3蛋白及14 d时胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达.结果 Cyc和Con组大鼠神经功能缺损评分、脑含水量、脑梗死体积、TUNEL阳性细胞计数、caspase-3和GFAP蛋白表达均高于假手术组(P＜0.05),且Cyc组较Con组更高(P＜0.05).Cyc和Con组NeuN蛋白表达低于假手术组(P＜0.05),且Cyc组较Con组更低(P＜0.05).组织病理见Cyc组细胞和间质水肿、神经细胞变形、核固缩、细胞坏死等重于Con组.结论 Cyc可加剧大鼠脑缺血再灌注损伤.     

乌司他丁拮抗炎性因子致血管内皮细胞凋亡的实验研究

目的 探讨乌司他丁(UTI)拮抗重度子痫前期血清及其肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对血管内皮细胞损伤的效应及机制,为UTI治疗重度子痫前期提供依据.方法 重度子痫前期孕妇10例,均留取血清冷藏备用.人脐静脉血管内皮细胞培养后分组:(1)空白对照组:不给予干预;(2)5％、10％、15％、20％血清组:血管内皮细胞中分别加入5％、10％、15％、20％重度子痫前期患者血清;(3)100U/ml、200 U/ml TNF-α组:在血管内皮细胞中分别加入100 U/ml、200 U/ml TNF-α;(4) UTI联合血清组(UTI+血清组):在20％血清组中分别加入50 U/ml、100 U/ml、500 U/ml、1 000 U/mlUTI;(5) UTI联合TNF-α组(UTI+ TNF-α组):在200 U/ml TNF-α组中分别加入50 U/ml、100 U/ml、500 U/ml和1 000 U/ml UTI.每组设6个复孔,分别干预12、24 h.采用噻唑蓝比色法检测血管内皮细胞增殖活性;采用流式细胞术检测血管内皮细胞凋亡及线粒体跨膜电位的变化.结果 (1)血管内皮细胞增殖活性:干预12 h、24 h时,15％、20％血清组OD值均低于空白组(P＜0.05);干预24 h时,100 U/ml TNF-α组、200 U/ml TNF-α组的OD值均低于空白组(P＜0.05).(2)血管内皮细胞凋亡:干预12 h、24 h时,20％血清组的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率均高于空白组(P＜0.05);干预24 h时,500 U/ml、1 000 U/ml UTI组细胞早期凋亡率、晚期凋亡率均低于20％血清组(P＜0.05).50 U/ml、100 U/ml UTI联合TNF-α组的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率与200 U/ml TNF-α组比较,差异无统计学意义(P＞0.05),而500 U/ml、1 000 U/ml UTI联合TNF-α组的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率低于200 U/ml TNF-α组(P＜0.05).(3)血管内皮细胞线粒体跨膜电位:50 U/ml、100 U/ml UTI干预组的细胞凋亡率与20％血清组比较差异无统计学意义(P＞0.05),而500 U/ml、1 000 U/ml UTI组的细胞凋亡率低于20％血清组(P＜0.05);50 U/ml、100 U/ml UTI联合TNF-α组的细胞凋亡率与200 U/ml TNF-α组比较,差异无统计学意义(P＞0.05),而500 U/ml、1000 U/ml UTI联合TNF-α组的细胞凋亡率低于200 U/ml TNF-α组(P＜0.05).结论 乌司他丁可降低TNF-α和重度子痫前期患者血清导致的血管内皮细胞凋亡率,可能与其维持线粒体的跨膜电位平衡有关,提示UTI可作为拮抗妊娠期高血压疾病炎性反应的候选药物.     

糖痛方对施万细胞凋亡及Bcl-2、caspase-3、caspase-9表达的影响

目的 探讨中药糖痛方对高糖诱导的施万细胞凋亡的影响.方法 将原代培养的施万细胞共分为对照组、高糖组、高糖加川芎嚷组、高糖加黄芪多糖组、高糖加川芎嗪和黄芪多糖混合组、高糖加糖痛方含药血清组,各组干预细胞48h后用流式细胞仪检测细胞Annexin V/PI标记的细胞凋亡率、用Western blot法和PCR法检测caspase-3、caspase-9及Bcl-2表达.结果 糖痛方组细胞凋亡率与高糖组相比显著降低（P＜0.05）;糖痛方组细胞caspase-3、caspase-9蛋白及mRNA表达与高糖组相比显著降低（P＜0.05）,Bcl-2蛋白及mRNA表达与高糖组相比显著升高（P＜0.05）.结论 中药糖痛方对神经细胞的损伤修复作用可能是通过提高Bcl-2、下调caspase-9和caspase-3的活性表达从而抑制施万细胞的凋亡来实现的.     

红花对兔肺缺血再灌注损伤时细胞凋亡及caspase-3的影响

目的:探讨细胞凋亡与肺缺血再灌注损伤的关系以及红花注射液的干预作用及其机制.方法:健康日本大耳白兔36只,随机分为对照组(C组)、缺血再灌注组(IR组)和红花干预组(SI组).复制在体肺缺血再灌注损伤模型.对比观察各组肺湿干重比(W/D)、肺泡损伤数定量评价指标(IQA);采用原位缺口末端标记(TUNEL)法观测肺组织细胞凋亡指数,原位杂交技术检测肺组织细胞caspase-3基因的表达.结果:IR组W/D、IQA、肺组织细胞凋亡指数及caspase-3mRNA表达均显著高于C组(P＜0.01).SI组上述各指标明显低于IR组(P＜0.01或P＜0.05).肺组织细胞凋亡指数与W/D、IQA及caspase-3mRNA均呈显著正相关(r分别=0.920,0.925,0.927;P均＜0.01).结论:肺组织细胞凋亡参与了肺缺血再灌注损伤的发生,红花注射液可能通过下调caspase-3的表达抑制肺组织细胞凋亡,从而减轻肺缺血再灌注损伤.     

大鼠急性脊髓损伤后神经细胞凋亡及caspase-3、AIF的表达

目的 研究大鼠急性脊髓损伤后神经细胞凋亡及caspase-3、凋亡诱导因子(AIF)的表达.方法 将78只成年健康Sprague-Dawley(SD)鼠按Nystrom法建立大鼠脊髓(T8、T9)急性压迫损伤模型,HE染色观察脊髓组织病理学变化,免疫组化测定各时间点AIF和caapase-3的表达变化,原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)标记法(TUNEL法)检测神经细胞的凋亡水平.结果 免疫组化结果显示正常及假手术组大鼠脊髓神经细胞caspase-3,AIF,TUNEL阳性细胞较少,脊髓损伤后1 d,AIF阳性细胞数明显增多(P<0.05),5 d表达减弱.caspase-3阳性细胞数在脊髓损伤后8 h明显增多,3 d迭高峰(P<0.01),7 d表达减弱.TUNEL阳性细胞数也在8 h明显增多,3 d达高峰(P<0.01),7 d表达减弱.结论 脊髓损伤后存在广泛的细胞凋亡现象,caspase-3、AIF均参与了细胞凋亡的调节.     

基于凝血酶合并缺氧诱导PC12细胞损伤的模型研究

目的：探索凝血酶合并缺氧对PC12细胞损伤的最佳反应时间点,为进一步研究凝血酶在缺血性脑损伤中的意义提供实验方法。方法建立体外缺氧合并凝血酶诱导的PC12细胞损伤模型。按照常规细胞培养方法,采用三气培养箱（1％ O2,5％ CO2,94％ N2）和无糖DM EM培养液造成细胞缺氧模拟缺血,并同时加入不同浓度的凝血酶（0、50、100、150和200 U／mL ）,再将每组都作用于1、6、12、24 h后,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）分析细胞的存活率、TUNEL法检测细胞的凋亡程度。结果随着缺氧时间的延长和凝血酶浓度的增加,细胞存活率逐渐下降,TUNEL细胞阳性率和凋亡率逐渐升高。低浓度凝血酶（50 U／mL）在缺氧1 h后,与对照组（0 U／mL）相比细胞存活率有所升高,提示低凝血酶可能有保护作用。尤以缺氧12 h后开始细胞损伤更为明显,150 U／m L凝血酶组作用12 h后与对照组相比细胞存活率显著下降（ P＜0．01）,凋亡率显著增加（ P＜0．05）;且200 U／mL凝血酶作用12 h和150、200 U／mL 凝血酶组作用24 h后细胞存活率与对照组比较差异均有统计学意义（ P＜0．05）。结论150 U／mL凝血酶在缺氧作用12 h后为研究凝血酶合并缺氧对PC12细胞损伤的最佳模型条件。     

凝血酶预处理对海马神经元的保护作用

目的:研究凝血酶预处理(TPC)对大剂量凝血酶(TM)诱导海马神经元凋亡的影响,阐明TPC的保护作用。方法:海马神经元分别经生理盐水(Sham组)、小剂量TM(TPC组)及凝血酶受体激活肽(TRAP组)预处理48h后再加大剂量TM作用24 h。TUNEL法及流式细胞术检测凋亡细胞数和凋亡百分率,应用免疫细胞化学方法检测神经元Bc l-2及Bax蛋白表达。结果:与Sham组比较,TPC组TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率明显降低(P<0.01),Bc l-2表达上调,Bax表达明显下调(P<0.01)。与Sham组比较,TRAP预处理组TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率明显降低(P<0.01),Bc l-2表达上调,Bax表达明显下调(P<0.01)。TRAP预处理组与TPC组相比差异无显著性(P>0.05)。结论:TPC可抑制TM导致的神经细胞凋亡,激活PAR-1,促进Bc l-2的表达和降低Bax的表达,可能是TPC抑制细胞凋亡的机制之一。     

生地注射液对中风模型神经元保护的实验研究

目的运用凝血酶复制中风后神经元损伤模型,观察生地注射液对该损伤神经元的保护作用。方法将培养7 d后的胎鼠大脑皮层神经元分为3组,即正常对照组、模型组与中药组,继续培养24 h后检测培养液中乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDH）活性与存活率指标（methyl thiazdyl tetrazolium,MTT）值。结果正常组与中药组LDH值较模型组低,与后者比较具统计学意义（P〈0.01）;正常组与中药组MTT值较模型组高,与后者比较亦具统计学意义（P〈0.01）。结论生地注射液能够减轻凝血酶导致的神经元损伤,提高神经元损伤后的细胞存活率,从而显示了较好的神经元保护作用。     

凝血酶对人肝癌细胞株HepG_2增殖影响及诱导凋亡作用研究

目的 观察凝血酶对人肝癌细胞株HepG_2增殖的影响及其诱导凋亡的作用.方法 体外培养人肝癌细胞HepG_2,MTT法观测不同浓度凝血酶在不同时间点对肝癌细胞增殖的影响,TUENL法检测其诱导凋亡作用.结果 高浓度凝血酶对肝癌细胞增殖有明显抑制作用(P<0.05),当浓度大于100 U/ml作用时间在48 h后,其抑制率最高可达到(39.08±2.32)%,且不随浓度的提高和时间的延长而增加;高浓度凝血酶能够诱导肝癌细胞凋亡,当浓度大于100 U/ml且作用时间大于48 h后,各组凋亡指数无显著性差异(P>0.05).结论 高浓度凝血酶能够明显抑制体外生长的人肝癌细胞株HepG_2并诱导肝癌细胞凋亡,且存在一定时间(48 h内)及浓度(<100 U/m1)依赖性.     

银杏叶提取物抗N-甲基-D-天冬氨酸受体介导兴奋毒性作用及机制研究

目的 观察银杏叶提取物(GBE)对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体过度激活导致海马神经元和脑损伤作用的影响并探讨其可能机制.方法 用锥虫蓝染色和乳酸脱氢酶(LDH)测定等方法评估GBE对海马神经元兴奋毒性损伤的影响,并运用全细胞膜片钳记录观察GBE对大鼠海马急性分离神经元NMDA受体激活电流的调制作用;以Longa评分、红四氮唑、神经元核蛋白和微管相关蛋白-2免疫组化染色等方法评估GBE对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用.以上GBE干预作用均与NMDA受体特异性拮抗剂MK-801作比较.结果 150μg/ml GBE预处理可有效地保护暴露于NMDA+甘氨酸的海马神经元,使细胞生存率提高到85.2%±5.2%,LDH漏出减少到87 U/L±8U/L,但此效应弱于MK-801(P＜0.05);预加0.1 mg/ml GBE可明显抑制由NMDA和甘氨酸共同作用能引起的内向电流(INMDA),抑制率为40%±17%,50 μmol/L MK-801的抑制率为78%±18%,两组差异有统计学意义(P＜0.01);用标准细胞外液进行冲洗后,GBE组INMDA可恢复至91%±8%,而MK-801组不能(P＜0.05).GBE预处理可有效缓解大鼠局灶性脑缺血损伤,其保护作用弱于MK-801(P＜0.05),但没有MK-801所引起大鼠严重的行为学毒性反应.结论 GBE预处理能对抗NMDA受体过度激活所致海马神经元毒性损伤和大鼠局灶性脑缺血损伤,可能与通过拮抗NMDA受体有关,此保护作用及其与NMDA受体结合力均弱于MK-801,无行为学毒性反应,使抗兴奋毒性临床干预成为可能.     

老龄大鼠慢性脑灌注不足对海马区神经元的影响

目的　初步探讨海马CA1区神经细胞凋亡与丢失在血管性痴呆形成中的作用。方法　采用Pulsinelli四血管阻断 ( 4 vesselolclusion ,4VO)改良法建立血管性痴呆大鼠模型 ,穿梭箱系统检测大鼠的学习记忆能力。应用免疫组化法检测海马CA1区caspase 3蛋白的表达 ,TUNEL法测定神经细胞的凋亡。应用甲苯胺蓝染色计数CA1区残余大锥体细胞。结果　 4VO 3d组大鼠CA1区caspase 3蛋白的表达及TUNEL阳性细胞最多 ,随后逐渐减少 ,2周组与对照 (CO)组相比仍有非常显著差异 (P <0 0 1) ,而 4周组基本达稳定状态 ,与CO组相比无显著差异 (P >0 0 5 )。 4VO各组大鼠CA1区大锥体细胞丧失率随术后时间的延长逐渐增加 ,大鼠CA1区大锥体细胞丧失率与AAR比率呈非常显著负相关 (r =-0 979,P <0 0 1)。结论　海马CA1区神经细胞凋亡可导致大锥体细胞严重丢失 ,CA1区大锥体细胞的丢失是血管性痴呆形成的重要病理学基础之一。     

缺氧、再给氧对培养大鼠心肌细胞的损伤和尼可地尔的保护作用

本实验观察缺氧、再给氧对培养大鼠心肌细胞的损伤和尼可地尔(Nicorandil)的保护作用。缺氧组和缺氧加Nicorandil组给予充氮生长液;正常组和正常加Nicorandil组给予正常生长液。各组在实验9h时均用正常生长液置换原生长液。缺氧组心肌细胞在3h后搏幅减弱,频率变慢,节律失常。9h后约有1/3细胞停搏,细胞形态改变,上清液内乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)明显增高。更换正常生长液后15h内细胞病变和酶谱变化更趋严重,停搏细胞持续增加。缺氧加Nicorandil组内在Nicorandil剂量为0.5～2mg/ml时,细胞形态基本正常,很少节律失常,上清液内LDH和CK明显低于缺氧组。正常组和正常加Nicorandil组细胞搏动频率、节律和上清液内LDH、CK均无明显改变。     

阿尔茨海默病大鼠海马组织PI3K—AKt—caspase-9相关蛋白的表达

目的探讨磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-Kinase,PDK）-蛋白激酶B（v-akt routine thymoma viral oncogenehomolog,AKt）-半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶9（caspase-9）相关蛋白在阿尔茨海默病大鼠海马表达的动态变化。方法24只SD大鼠随机分为2组：模型组（腹腔注射D-半乳糖60mg／kg）和假手术组,焦油紫染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法（terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL法）检测其海马区细胞形态学变化、神经元凋亡;免疫组织化学染色检测p—PI3K、p-AKt和caspase-9P35的表达水平。结果和假手术组相比,模型组大鼠海马区锥体细胞层损伤严重,可见到较多TUNEL阳性神经元;p—P13K和p—AKt的活性明显降低,caspase-9P35的表达明显增加。结论阿尔茨海默病大鼠存在海马区细胞凋亡及P13K—AKt—caspase-9信号转导通路的改变。