RFLP基因分型在动态监测乙型肝炎病毒基因变异中的应用

目的探讨基因分型结合克隆后测序方法在动态监测ＨＢＶ基因变异中的价值。方法分析１例重型肝炎患者发 病后血清,用 ＰＣＲ扩增血清中 ＨＢＶ ｐｒｅＳ／Ｓ基因片段并克隆,２份标本各随机挑取 ３个阳性克隆进行测序;同时用 ＲＦＬＰ方法分析２份血清中ＨＢＶ毒株的基因型。结果ＰＦＬＰ分析２份血清为Ｂ基因型为主的Ｂ／Ｃ基因型混合毒株感 染;６个克隆中仅１株为Ｃ基因型。比较２份血清ＨＢＶ ｐｒｅＳ／Ｓ克隆核酸序列,有１７０个点位的差异,剔除Ｃ基因型株 后,仅５４个位点差异。结论克隆后测序结合ＲＦＬＰ对ＨＢＶ基因型测定有助于更准确地对ＨＢＶ基因变异进行动态分 析。     

丙型肝炎病毒包膜蛋白基因片段的克隆与表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ和基因重组技术，从湖南地区丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者血清中克隆了ＨＣＶ包膜蛋白基因片段（Ｅ１，Ｅ２／ＮＳ１）经与已知基因型的ＨＣＶ－１，ＨＣＶ－Ｊ，ＨＣＶ－Ｊ６和ＨＣＶ－Ｊ８进行核苷酸序列的比较分析，这些基因片段属１ｂ型ＨＣＶ基因。将克隆基因重组于表达质粒ＰＭＡＬ－ＣＲＩ中，在大肠杆菌内进行高效表达，获得了融合蛋白ＭＢＰ－Ｅ１，ＭＢＰ－Ｅ２／ＮＳ１，经ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ分析证实     

首例中国株乙型肝炎病毒D基因型全序列测定及分析

目的　测定并分析１例中国慢性无症状携带者感染的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｄ基因型的全基因序列。方法　用聚合 酶链式反应（ＰＣＲ）扩增ＨＢＶ全基因,将ＰＣＲ产物克隆后对其进行核酸序列分析并与已发表的ＨＢＶ毒株全序列进行 同源性比较;对 ＧｅｎＢａｎｋ中已发表的３０株ＨＢＶ Ｄ基因型毒株的全序列进行系统进化树分析。结果　该病毒全基因长 ３１８２ｂｐ,为ａｙｗ亚型,Ｄ基因型;此毒株全基因ＧｅｎＢａｎｋ　ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ为ＡＦ２８０８１７;与ＧｅｎＢａｎｋ中已发表的ＨＢＶＤ 基因型全序列同源性为９８．３％～９４．5％,与已发表的 Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ和Ｇ基因型全序列同源性均小于８９．５％。结论　首例中 国株 ＨＢＶ Ｄ 基因型全序列与源于瑞典的四株 ＨＢＶ Ｄ 基因型全基因的进化距离最近。     

恶性疟原虫海南株丝氨酸重复抗原部分基因序列分析

该文采用ＰＣＲ方法特异性扩增恶性原虫海南株（ＦＣＣ－１／ＨＮ）ＳＥＲＡ基因片段,并将该基因片克隆于Ｍ１３噬菌体,用双脱氧链末端终止法进行测序,ＰＣＧＥＮＥ软件对该基因序列进行了分析,结果显示该基因片段长度为４５３ｂｐ,Ａ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ为２．６：１,符合恶性瓶原虫结构基因的特点。同源性分析显示在不同虫株间高度保守,我国ＦＣＣ－１／ＨＮ虫株ＳＥＲＡ与Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３（巴西）株及Ｓ１６（塞内加尔）株仅一个     

丙型肝炎病毒基因高变区（E1,E2／NS1）的分子克隆及基因型鉴定

对广东省一个患血血清中的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因高变区进行分子克隆及基因型鉴定。采用微粒吸附法提取ＨＣＶ ＲＮＡ，随机引物逆转录后进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）。所用引物位于Ｅ１，Ｅ２／ＮＳ１区，扩增产物８０６ｂｐ，产物提纯后定向插入ｐＢＶ２２０质粒载体，重组体转染ＤＨ５α菌株，筛选菌落经增殖后碱变性法提取质粒，再通过ＰＣＲ及酶切法鉴定阳性克隆。我们还用酶切法对此株克隆的基因型作了初步鉴定，证明属于     

丙型肝炎病毒基因高变区（E1，E2／NS1）的分子克隆及基因型鉴定

对广东省一个患者血清中的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因高变区进行分子克隆及基因型鉴定。采用微粒吸附法提取ＨＣＶＲＮＡ，随机引物逆转录后进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）。所用引物位于Ｅ１，Ｅ２／ＮＳ１区，扩增产物８０６ｂｐ，产物提纯后定向插入ｐＢＶ２２０质粒载体，重组体转染ＤＨ５α菌株，筛选菌落经增殖后碱变性法提取质粒，再通过ＰＣＲ及酶切法鉴定阳性克隆。我们还用酶切法对此株克隆的基因型作了初步鉴定，证明属于１组Ⅱ型。     

乙型肝炎病毒前S1／S2功能区变化与临床转归的可能联系

目的 研究乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）前Ｓ１／Ｓ２基因变异规律及其与ＨＢＶ感染临床转归的关系。方法 选择急性自限性乙型肝炎患者,慢性ＨＢＶ携带者及慢性重型乙型肝炎患者各３例,用半巢式ＰＣＲ法从此９例ＨＢＶ感染者血清中扩增出前Ｓ１／Ｓ２片段,并用标准分子生物学方法对ＰＣＲ产物进行克隆和序列分析．每个感染者随机选择１０个克隆,总共测定了９０个克隆。通过核苷酸、氨基酸序列同源性比较分析前Ｓ１／Ｓ２区内肝细胞结     

Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2/NS1基因的克隆与序列分析

目的构建插入Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的真核表达载体，分析该基因片段的核苷酸一级结构。方法利用逆转录套式ＰＣＲ扩增Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２／ＮＳ１基因片段，通过定向克隆将其克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上，采用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。结果构建出含有Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的克隆，该区基因片段的核苷酸一级结构和Ⅲ型日本株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｊ６）的同源性为８８．３７％，Ⅱ型中国株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｃ２）的同源性为７０．６９％，其推定的氨基酸同源性分别为８９．２９％和７５．５５％。结论基因的核苷酸一级结构在同一基因型中有较高的同源性，而不同基因型之间的同源性则相对较低。对不同基因型之间Ｅ２／ＮＳ１基因一级结构的研究将有助于ＨＣＶ疫苗的研制。     

贵州HCV感染株基因分型研究

为了解本地区ＨＣＶ感染株的基因型及现有分型方法的适用性，从贵州２０６例慢性肝炎和血液病患者中筛出３５份抗－ＨＣＶ阳性血清，用逆转录套式聚合酶链反应作ＨＣＶＲＮＡ检测。３０份ＨＣＶＲＮＡ阳性血清用３种分型方法（核心区特异引物ＰＣＲ，非结构５区特异探针核酸杂交，５′末端非编码区限制性长度多态性分析）进行ＨＣＶ基因分型。结果３份血清为ＨＣＶ２ａ感染，２７份为ＨＣＶ１ｂ感染。对８份ＨＣＶ１ｂ、１份ＨＣＶ２ａ血清的ＰＣＲ扩增产物直接测序，核酸序列分型结果与原型别一致。表明ＨＣＶ１ｂ是贵州地区ＨＣＶ感染株的主要基因型，ＨＣＶ２ａ感染并不常见。以ＨＣＶ基因组不同区域为基础的各方法分型结果间有很好的相符性。     

中国东北地区HCVRNA阳性血清RT－PCR产物的RFLP分型

为了解东北地区ＨＣＶ感染的基因型，对东北地区４５例ＨＣＶＲＮＡ阳性血清的ＰＣＲ产物用ＲＦＬＰ分析进行基因分型，结果：ＨＣＶⅡ型占８２．２％，Ⅲ型占１５．６％，Ⅱ／Ⅲ混合型占２．２％型。与国内其它地区ＨＣＶ基因型构成比无显著性差异。证明东北地区ＨＣＶ感染也以Ⅱ型为主。     

乙型肝炎病毒毒株X基因/C基因启动子的热点变异

目的ＨＢＶ／Ｘ基因存在调控ＨＢＶ复制的调节序列,Ｘ基因变异将影响这些调节序列功能,研究中国ＨＢＶ毒株Ｘ基因／Ｃ基因启动子（ＢＣＰ）区的变异情况。方法设计ＢＣＰ下游反义链错配引物,将点突变附近的一个碱基（ｎｔ１７６７）由Ａ→Ｔ,则正好可在ＢＣＰ变异株中引进一个ＢｃｌＩ（Ｔ↓ＧＡＴＣＡ）酶切位点,结合限制性片段长度多态性分析（ＲＦＬＰ）筛检１４３例中国人感染的ＨＢＶ毒株ＢＣＰ区变异,并与前Ｃ区变异比较。结果１１４例血清ＨＢＶＤＮＡ阳性慢性ＨＢＶ感染者,ＢＣＰ区和／或前Ｃ区变异者４９例（４３％）,ＢＣＰ变异者３７例（３２％）。ＢＣＰ变异无论在ＨＢｅＡｇ阳性或阴性慢性肝炎病例的发生率均显著高于慢性ＨＢＶ无症状感染者。ＢＣＰ可与前Ｃ终码变异共存或单独出现。结论在中国ＨＢＶ毒株ＢＣＰ区存在热点变异。ＨＢＶ毒株ＢＣＰ变异可能影响ＨＢＶ前Ｃ基因组ｍＲＮＡ转录,是ＨＢＶ感染持续和肝病变进展的原因之一。     

贵州HICV感染株基因分型研究

为了解本地区ＨＣＶ感染株的基因型及现有分型方法的适用性，从贵州２６例慢性肝炎和血液病患者中筛出３５份抗－ＨＣＶ阳性血清，用逆转录套式聚合酶链反应作ＨＣＶ ＲＮＡ检测，３０份ＨＣＶ ＲＮＡ阳性血清用３种分型方法进行ＨＣＶ基因分型。结果３份血清为ＨＣＶ２α感染，２７份为ＨＣＶ１ｂ感染。对８份ＨＣＶ１ｂ，１份ＨＣＶ２ａ血清的ＰＣＲ扩增产物直接测序，核酸序列分型结果与原型另一致。     

错配PCR—RFLP检测乙型肝炎病毒X基因／C基因启动子变异

设计错配ＰＣＲ－限制性片段长度多态性分析（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）检测中国ＨＢＶ毒株Ｃ基因启动子（ＢＣＰ）区第２个ＡＴ丰富区的一对点突变；核苷酸（ｎｔ）１７６２的碱基由Ａ→Ｔ和１７６４的碱基由Ｇ→Ａ变异。结果发现在３２例慢性ＨＢＶ感染者中ＢＣＰ变异者有１０例总检出率为３１．２％。提示在我国ＨＢＶ毒株ＢＣＰ区这一联合估变较常见。ＰＣＲ－ＲＦＬＰ技术与序列分析结合，对于研究这一新发现的热点变异与临床的关系具     

中国东北地区HCV RNA阳性血清RT—PCR产物的RFLP分型

为了解东北地区ＨＣＶ感染的基因型，对东北地区４５例ＨＣＶ ＲＮＡ阳性血清的ＰＣＶ产物用ＲＦＬＰ分析进行基因分型，结果：ＨＣＶⅡ型占８２．２％，Ⅲ型占１５．６％，Ⅱ／Ⅲ混合型占２．２％型。与国内其它地区ＨＣＶ基因型构成比无显著性差异。证明东北地区ＨＣＶ感染也以Ⅱ型为主。     

利用PCR技术构建GM—CSF／Fcγ2融合蛋白载体

目的：构建 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体。方法：利用 Ｐ Ｃ Ｒ技术,将人 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ基因与人免疫球蛋白 Ｉｇ Ｇ２ 的 Ｆｃ 段基因联接,构建融合基因ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２;并将此片段定向克隆到真核表达质粒ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２ 载体。结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示 Ｐ Ｃ Ｒ扩增出了 １．３ ｋｂ 的融合基因片段;限制性内切酶图谱分析,成功地完成了 Ｇ Ｍ  Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体的构建。结论：（１）经 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增技术由质粒 Ｐ Ｃ Ｄｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ和 Ｐ Ｓ Ｖ Ｖ Ｎ Ｐ Ｈ Ｖ２ 分别扩增到了所需的ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段和 Ｉｇ Ｇ２ 从绞链区到 Ｃ Ｈ３ 的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 片段。（２）利用 Ｐ Ｃ Ｒ介导,扩增出了融合基因片段ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２。（３）构建了真核细胞表达载体ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２／ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２ 。     

Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2／N21基因的克隆与序列分析

目的 构建插入Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的真核表达载体,分析该基因片段的核苷酸一级结构。方法 利用逆转 录套式ＰＣＲ扩增Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２／ＮＳ１基因片段,通过定向克隆将其克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,采用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。结果 构建出含有Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的克隆,该区基因片段的核苷酸一级结构和Ⅲ型日本株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｊ６     

丙型肝炎病毒山东分离侏核衣壳蛋白区cDNA的序列测定

①目的 通过核衣壳蛋白区（Ｃ区）基因序列分析，对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）山东分离株进行定型。②方法 应用反康 套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）方法，从山东省ＨＣＶ抗体阳性血清听主增出ＨＣＶ Ｃ区基因的一个片段（４３２ｂｐ），对其进行ＴＡ克隆及测序，并通过ＤＮＡＳＩＳ软件和Ｇｅｎｅｂａｎｋ进行序列分析。③结果此分离株与基因型１ｂ的ＨＣＶ分离株同源性最高，与４个已知１ｂ型分离株的核苷酸相应     

中国株HGV部分基因的分子克隆与核苷酸序列分析

采用ＲＴ－ＰＣＲ对广东地区３３例肝炎病血清进行ＨＧＶＲＮＡ检测，结果２例（６．１％）阳性，对其中１株输血后ＨＧＶ（ＣＨ－Ｓ）基因组５端非翻译区（５′ＵＴＲ）进行分子克隆与测序，并分别与Ｌｉｎｎｅｎ等报道的２株ＨＧＶ（ＰＮＦ２１６１，Ｒ１０２９１）和Ｌｅａｒｙ等报道的ＧＢＶ－Ｃ相比较，其核苷酸序列的同源性分别为８９．２％，８８．７％，８７．１％，本研究首次证实我国华南地区存在ＨＧＶ感染，ＨＧＶ高度保     

HBVC基因启动子变异患者血清铁蛋白对干扰素治疗的影响

目的：探讨血清铁蛋白（ＳＦ）水平对有ＨＢＶ Ｃ基因启动子（ＢＣＰ）变异的患者干扰素疗效的影响。方法：采用错配ＰＣＲ－ＲＦＬＰ技术检测ＨＢＶ Ｃ基因启动子（ＢＣＰ）变异,并检测其血清铁蛋白（ＳＦ）水平。结果：随着病情的加重ＳＦ水平升高,且当ＳＦ≥３００ｎｇ／ｍｌ时,可明显降低干扰素的疗效（Ｐ〈０．０５）;发生ＢＣＰ变异的病例,在干扰素治疗的过程中,ＳＦ水平升高的程度明显高于野生株组（Ｐ〈０．００１）。结论：提示ＳＦ升高与肝功能损伤有着密切关系,ＳＦ水平升高可降低干扰素治疗的有效率,且有变异的病例可促使ＳＦ水平升高。     

七株急性散发性戊型肝炎病毒部分核苷酸序列分析

比较我国流行性和散发性戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）的部分核苷酸和氨基酸序列及其与戊型肝炎流行的关系。方法应用逆转录套式聚合酶链反应法（ＲＴ－ｎＰＣＲ）从急性散发性戊型肝炎病人血清中扩增ＨＥＶ开放读码框架２（ＯＲＦ２）ｃＤＮＡ，并用ＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒｓｉｏｎ２．０ＤＮＡ序列分析试剂盒，经双脱氧核苷酸ＤＮＡ链末端终止直接测序法测定ＲＴ－ｎＰＣＲ扩增产物的核苷酸序列。结果从深圳、长春、杭州、西安、北京５个城市４１份急性散发性戊型肝炎病人血清中获得２８株ＨＥＶＯＲＦ２ｃＤＮＡ，对其中７株进行了核苷酸序列分析，表明它们与ＨＥＶ墨西哥株（Ｍ）的同源性为７８．９％～８０．２％；与ＨＥＶ缅甸（Ｂ）流行株（Ｅｐ）的同源性为９３．１％～９５．１％；与ＨＥＶ缅甸（Ｂ）散发株（Ｓｐ）的同源性为９２．３％～９４．２％；与ＨＥＶ中国新疆流行株ＣＨ１．１同源性为９６．５％～９８．９％；７株散发性ＨＥＶ间核苷酸序列的同源性为９５．７％～１００％。结论该７株散发性ＨＥＶ与ＨＥＶ（Ｂ）和ＨＥＶＣＨ１．１核苷酸序列的同源性较高，均属同一亚型。