反义翻译延伸因子TEF-1δ对氯化镉致癌性的逆转作用

背景与目的：翻译延伸因子TEF-1δ(基因文库新添编号为AF304351)是一个新发现的镉应答原癌基因。本研究之目的在于探讨反义TEF-1δ能否逆转镉转化细胞的致癌性。材料与方法：用磷酸钙介导转染法和G418细胞筛选技术,建立CdCl2转化BALB／c-3T3细胞反义TEF-1δ稳定表达系统,再用软琼脂检测和裸鼠致瘤试验对这些转基因细胞的致癌性逆转情况进行鉴定。结果：CdCl2转化BALB／c-3T3细胞中反义TEF-1δ表达可逆转这些细胞的转化表型,与非转染细胞和载体转染对照细胞比较,转染反义TEF-1δ的镉转化细胞在软琼脂上所形成的锚非依赖性生长集落减少29％～44％。转染反义TEF-1δ基因的镉转化细胞可延迟裸鼠出现肿瘤的时间,而且这些肿瘤的大小显著变小,肿瘤重量平均下降54％～58％。结论：反义TEF-1δ mRNA表达可逆转镉转化细胞的致癌性;应用反义TEF-1δ阻断TEF-1δ癌基因表达对镉诱发的肿瘤可能有治疗价值。     

氯化镉恶性转化16HBE细胞中ERCC1基因表达和序列的变化

目的 探讨氯化镉(CdCl2)诱发人支气管上皮16HBE细胞恶性转化过程中,ERCC1基因mRNA和蛋白动态变化的规律及其序列变化情况.方法 用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学SP法,检测16HBE细胞及其CdCl2恶性转化细胞不同阶段(第5、15、35代细胞及成瘤细胞)ERCC1基因mRNA和蛋白的表达情况.用直接测序法,分析ERCC1基因第3、4外显子的序列情况.结果 随着转化代数的增加,ERCC1基因mRNA和蛋白的表达逐渐降低,至第35代细胞后表达明显下调,mRNA表达从16HBE的0.7028±0.0170下降到第35代细胞的0.3480±0.0453,蛋白表达强度从16HBE的8.40±1.34下降到第35代细胞的0.20±0.44,差异均有统计学意义(P＜0.01).ERCC1基因第4外显子在第1位点出现腺嘌呤(A)缺失,为移码突变.结论 镉致癌的分子机制可能与ERCC1基因水平的下调和突变有关.     

氯化镉诱发16HBE细胞恶性转化中hOGG1基因表达和序列变化的研究

目的：探讨氯化镉诱发人支气管上皮（16HBE）细胞系恶性转化过程中hOGG1基因mRNA和蛋白动态变化的规律及其序列变化情况。方法：用反转录-聚合酶链反应（PT-PCR）和免疫组织化学（SP法）检测16HBE细胞、氯化镉恶性转化16HBE细胞系不同阶段（第5、15和35代细胞及成瘤细胞）hOGG1基因mRNA和蛋白的表达情况；用直接测序法分析hOGG1基因第7外显子的序列情况。结果：随着转化代数的增加，h0GGl基因mRNA和蛋白的表达逐渐降低，到第15代细胞后表达明显下降（P〈0．05）；hOGG1基因第7外显子第162位点插入一个腺嘌呤A，为移码突变。结论：hOGG1基因水平的下调和突变可能是氯化镉分子致癌的重要机制。     

结晶型NiS诱发恶性转化细胞中的p16基因和FHIT基因的变化

目的 检测结晶型NiS诱发永生化人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化过程中脆性组氨酸三联体基因(FHIT)和p16基因的变化,探讨镍化合物致癌的分子机制。方法 采用RT-PCR、DNA序列分析、银染PCR—SSCP方法检测恶性转化细胞、成瘤细胞中FHIT基因和p16基因的变化。结果 与对照组16HBE相比,转化细胞、成瘤细胞p16基因第2外显子、第2-3外显子末见突变,mRNA表达末见异常;FHIT基因第5,6,7,8外显子及第1-4外显子、第5-9外显子末见突变,但发现转化细胞、成瘤细胞FHIT基因的mRNA失表达或出现异常转录本;对其中FHIT基因第5-9外显子的一异常转录本测序分析显示,FHIT第6,7,8外显子缺失,第5,9外显子异常拼接,且中间插入一个36bp的小片段。结论 在结晶型NiS诱发16HBE恶性转化过程中,p16基因在DNA和mRNA水平末见异常改变,提示p16基因在镍致癌过程中可能不发挥作用;FHIT基因在mRNA水平出现缺失或异常转录本,表明FHIT基因在镍致癌过程中可能发挥一定作用;镍诱导的FHIT基因异常,可能是将外源致癌物、染色体脆性部位不稳定性和细胞恶变相联系起来的一个分子事件,FHIT基因可能是镍等外源致癌物作用的主要靶基因之一。     

镉对NRK肾细胞PKCα表达的影响及PKC抑制剂BisⅠ的生物学作用

目的：探讨不同浓度氯化镉（CdCl2）对NRK细胞内蛋白激酶Cα（PKCα）mRNA及其蛋白质表达的影响,以及PKC抑制剂Bisindolymalei mide I（Bis I）对镉染毒NRK细胞PKCαmRNA及蛋白质表达的生物学作用。方法：应用实时荧光定量PCR技术检测不同浓度（0、1.25、2.50、5.00、10.00μmol/L）CdCl2对NRK肾细胞处理6h与12h后PKCαmRNA表达的影响,同时用Western blot技术检测CdCl2对NRK肾细胞内PKCα蛋白质表达的影响。用PKC抑制剂Bis I预处理细胞后,用不同浓度CdCl2（0、2.50、5.00μmol/L）进行染毒,再检测PKCαmRNA及蛋白质的表达变化。结果：CdCl2浓度在1.25~10.00μmol/L范围内,可引起NRK肾细胞内PKCαmRNA及蛋白质表达水平升高,并呈时间_剂量_效应关系;PKC抑制剂Bis I能明显抑制镉引起的PKCαmRNA及蛋白质的表达。结论：CdCl2可以诱导NRK肾细胞内PKCαmRNA及蛋白质表达,PKC抑制剂Bis I具有一定程度抑制CdCl2对PKCα的诱作用,因此在抑制CdCl2对生物机体的伤害作用方面具有生物学意义。     

p63和p73的表达与苯并(a)芘致H1299和16HBE细胞DNA损伤的关系

背景与目的:研究p63与p73的mRNA表达与BaP致人肺腺癌细胞(H1299)和人支气管上皮细胞(16HBE)DNA损伤的关系.材料与方法:分别用不同浓度BaP(8、16、32、64和128 μmol/L)处理H1299和16HBE两种细胞,在4 h和12 h时,使用相应的生化检测试剂盒分别测定细胞裂解液中MDA的水平和SOD、GSH-Px的活性,用qRT-PCR方法测定处理后细胞的p53、p63、p73、mdm2和mdm4的mRNA水平;用Comet实验评价细胞DNA损伤程度.结果:16、32和64 μmol/L BaP处理4 h时,两种细胞MDA水平显著性升高,SOD和GSH-Px活性显著性下降(P<0.05).用BaP处理H1299和16HBE细胞4 h和12 h时均观察到DNA损伤随浓度增加而加重,且呈剂量-效应关系(P<0.01),mdm2、mdm4 mRNA表达水平升高(P<0.01).不过仅在12 h时p53基因mRNA表达水平较对照组显著增加(P<0.01).在4 h和12 h时点,仅在H1299细胞的p63和p73 mRNA表达增加(P<0.05). 结论:在BaP致p53缺失的H1299细胞的DNA损伤中,BaP可能通过不依赖p53信号通路激活了p63和p73 mRNA的表达.     

GMA诱导16HBE恶性转化细胞中LncRNAEMX2OS的表达及意义

目的：探讨LncRNA EMX2OS在甲基丙烯酸环氧丙酯（GMA）诱导的16HBE恶性转化细胞中的表达变化及意义。方法：取GMA诱导的第30代16HBE恶性转化细胞及DMSO对照组细胞,采用高通量LncRNA芯片比较两组样本表达谱的差异,并用生物信息学方法筛选出LncRNA EMX2OS及其靶向基因EMX2,采用实时荧光定量PCR（qPCR）分析16HBE恶性转化细胞中LncRNA EMX2OS和EMX2 mRNA的表达水平,并与对照组细胞比较。结果：LncRNA芯片结果显示,与DMSO对照组细胞相比,GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中LncRNA EMX2OS上调6.01倍;qPCR结果显示,相对于对照细胞,16HBE恶性转化细胞中LncRNA EMX2OS表达上调3.37倍,EMX2 mRNA上调1.88倍（P < 0.05）。EMX2 mRNA和LncRNA EMX2OS表达的变化趋势一致。结论：GMA可以诱导16HBE细胞LncRNA EMX2OS表达上调,LncRNA EMX2OS可作为GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中相关特异分子标志之一。     

TEF-1δ基因真核细胞稳定表达系统的构建与鉴定

目的: 构建TEF-1δ (mouse translation elongation factor-1δ) 的稳定表达系统.方法: 采用磷酸钙介导转染技术和G418细胞筛选法,以pcDNA3.1/V5-His-TOPO为表达载体,构建了TEF-1δ转基因CHO和COS7细胞系,Western Blot分析与鉴定表达蛋白.结果: 在10株转染和经G418反复筛选的CHO细胞系中,有3株(编码为COH-pcDNA3.1-TEF-1δ#3,#6,#14)具有高效稳定表达的TEF-1δ编码蛋白质(Mr约31×103),其余CHO细胞株的TEF-1δ蛋白质表达相对较弱或无表达.在4株转染和经G418反复筛选的COS7细胞系中,4株细胞(编码为COS7-pcCDNA3.1-TEF-1δ #4,#8,#14和#17)均有高效稳定的TEF-1δ编码蛋白表达,相应的无转染组及载体对照组的CHO和COS7细胞均无TEF-1δ蛋白质表达.结论: 这两类TEF-1δ转基因哺乳动物细胞稳定表达系统已成功构建与鉴定,该表达系统的建立对于TEF-1δ这一新基因的生物学功能研究,尤其是镉的致癌作用与致癌机制的研究有重要应用价值.     

TEF-1δ基因真核细胞稳定表达系统的构建与鉴定

目的: 构建TEF-1δ (mouse translation elongation factor-1δ) 的稳定表达系统.方法: 采用磷酸钙介导转染技术和G418细胞筛选法,以pcDNA3.1/V5-His-TOPO为表达载体,构建了TEF-1δ转基因CHO和COS7细胞系,Western Blot分析与鉴定表达蛋白.结果: 在10株转染和经G418反复筛选的CHO细胞系中,有3株(编码为COH-pcDNA3.1-TEF-1δ#3,#6,#14)具有高效稳定表达的TEF-1δ编码蛋白质(Mr约31×103),其余CHO细胞株的TEF-1δ蛋白质表达相对较弱或无表达.在4株转染和经G418反复筛选的COS7细胞系中,4株细胞(编码为COS7-pcCDNA3.1-TEF-1δ #4,#8,#14和#17)均有高效稳定的TEF-1δ编码蛋白表达,相应的无转染组及载体对照组的CHO和COS7细胞均无TEF-1δ蛋白质表达.结论: 这两类TEF-1δ转基因哺乳动物细胞稳定表达系统已成功构建与鉴定,该表达系统的建立对于TEF-1δ这一新基因的生物学功能研究,尤其是镉的致癌作用与致癌机制的研究有重要应用价值.     

结晶型硫化镍及反式-BPDE恶性转化16HBE细胞hMSH2基因甲基化的研究

背景与目的： 对结晶型硫化镍(Nickel sulfide,NiS)及反式二氢二醇环氧苯并芘(anti-7,8,-dihydrodiol-9,10-epoxide benzo[a] pyrene,BPDE)恶性转化及成瘤的人支气管上皮细胞(Human bronchial epithelial,16HBE)hMSH2基因启动子甲基化状况及其mRNA表达进行研究,探讨镍及反式-BPDE的表遗传致癌机制。材料与方法： 采用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)法和RT-PCR法检测结晶型NiS及反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子甲基化状况及其mRNA表达,与非转化的16HBE细胞进行比较;并用去甲基化因子5-Azac(5-Aza-2′-deoxycytidine)处理有异常甲基化的细胞。 结果： 发现结晶型NiS及反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子区存在CpG岛的高甲基化;与非转化16HBE细胞比较,转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因mRNA表达下降;有异常甲基化的细胞经去甲基化处理后甲基化消失。结论： 结晶型NiS及反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子区CpG岛的高甲基化使其mRNA表达下降,并可能导致hMSH2基因表达抑制,这可能是结晶型NiS及反式-BPDE诱导16HBE细胞转化和成瘤的一种表遗传致癌机制。甲基化的可逆性对今后研究其表型逆转以及药物治疗提供了重要依据。     

甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮细胞恶性转化过程中DNMT1及MBD1基因表达的变化

目的：分析甲基丙烯酸环氧丙酯（glycidyl methacrylate,GMA）致人支气管上皮16HBE细胞恶性转化过程中不同时点甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白家族基因的表达差异,初步探讨GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化的表观遗传机制。方法：采用人类全基因组表达谱芯片筛选GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白家族的差异表达基因,并采用实时定量PCR（Real time PCR）技术检测筛选所得差异基因DNMT1及MBD1 mRNA的表达情况。结果：芯片结果显示在转化第10代（前期）细胞中DNMT1及MBD1基因较同代龄对照细胞表达上调,实时定量PCR进一步确证DNMT1及MBD1基因表达分别上调80.60%、79.10%,与芯片结果一致。结论：甲基化可能是GMA致16HBE细胞发生恶性转化的一种机制,DNMT1及MBD1基因可能是多个甲基化相关基因转录表达下调的关键调控点,其在GMA致16HBE细胞恶性转化过程中起着重要作用。     

甲基丙烯酸环氧丙酯诱导16HBE细胞恶性转化过程中LncRNA表达特征分析及ceRNA调控网络预测

目的： 筛选甲基丙烯酸环氧丙酯（GMA）诱导人支气管上皮16HBE细胞恶性转化过程中不同时期差异表达的LncRNA并以此为基础构建ceRNA调控网络,分析相关信号通路和生物学功能。方法： 收集用GMA和溶剂DMSO分别处理的16HBE细胞。采用LncRNA芯片检测并分析两组细胞中LncRNA表达量的差异,运用TargetScan和MiRanda数据库筛选出关键的差异表达LncRNA,使用Cytoscape构建以差异表达LncRNA为核心的ceRNA调控网络,之后对差异表达LncRNA的靶基因和通路进行分析预测,通过实时荧光定量PCR （qPCR）对上述LncRNA相对表达量进行检测验证。结果： 芯片筛选结果发现,与DMSO对照组相比,GMA处理组共16个LncRNA在细胞恶性转化过程中表达上调。在此基础上筛选构建了由3个LncRNA,32个mRNA和204个miRNA组成的LncRNA相关ceRNA调控网络,其中有3个调控轴（LncRNA G013234-hsa-miR-378b-TMEM129、LncRNA CTA-384D8.35-hsa-miR-486-3p-LYPD、LncRNA G087116-miR-29b-3p-NAV1）与GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程相关（P<0.05）,提示这3个调控轴是与此恶性转化过程关联较为密切的ceRNA三元组。qPCR验证结果表明在细胞恶性转化过程的不同时期LncRNA G013234,CTA-384D8.35和G087116的相对表达水平变化趋势与LncRNA芯片结果一致。结论： 在GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化过程中,LncRNA G013234、CTA-384D8.35、G087116在恶性转化不同时期均发生上调,以此为基础构建的ceRNA调控网络及预测得到细胞恶性转化相关的关键mRNA,为GMA诱导16HBE细胞恶性转化机制研究提供了支持数据。     

甲基丙烯酸环氧丙酯诱导16HBE细胞恶性转化相关m6A修饰异常mRNA的分析

目的： 检测甲基丙烯酸环氧丙酯（GMA）诱导16HBE细胞恶性转化相关mRNA的m⁶A甲基化修饰水平,筛选出m⁶A修饰的mRNA并进行功能注释。方法： GMA（8 μg/mL）重复染毒16HBE细胞后,收集GMA染毒组和DMSO对照组的第30代细胞,采用高通量人类表观转录组芯片检测16HBE细胞恶性转化相关mRNA的m⁶A修饰水平,应用Visual Studio Code软件进行m⁶A修饰mRNA的筛选,并利用Omicshare工具对这些mRNA进行GO富集分析和KEGG通路分析。结果： 与对照组细胞比较,GMA诱导的恶性转化16HBE细胞中m⁶A修饰水平异常的mRNA共有454个,其中高甲基化水平mRNA 334个,低甲基化水平mRNA 120个;表达水平异常的mRNA共有434个,其中高表达mRNA 236个,低表达mRNA 198个。m⁶A修饰的mRNA有45个,GO富集分析结果显示上述mRNA主要富集于SNAP受体活性、SNARE结合、SNARE复合体等生物学过程,KEGG通路分析主要富集于囊泡运输中的SNARE相互作用、非同源末端连接、苯丙氨酸代谢等通路。结论： m⁶A修饰mRNA可能在GMA诱导16HBE恶性转化过程发挥重要作用。     

LncRNA PCA3在甲基丙烯酸环氧丙酯诱导16HBE恶性转化细胞中的表达及意义

目的:探讨长链非编码RNA PCA3(LncRNA PCA3)在甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)诱导的16HBE恶性转化细胞中的表达水平及意义。方法:收获经8 μg/mL GMA诱导的第30代16HBE恶性转化细胞及同代龄DMSO溶剂对照组细胞,应用高通量LncRNA芯片比较两组样本表达谱的差异,通过差异倍数、邻近编码基因信息分析等策略初步筛选出16HBE恶性转化细胞中LncRNA PCA3及其最可能的相关蛋白编码基因PRUNE2,采用实时荧光定量PCR(qPCR)和全基因组表达谱芯片分析LncRNA PCA3和PRUNE2的表达量,并与同代龄DMSO对照组细胞比较。结果:LncRNA芯片结果显示,与同代龄DMSO组相比,GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中LncRNA PCA3上调7.17倍,PRUNE2下调2.54倍;qPCR结果显示,与同代龄DMSO组[(1.36±0.44)×10^-5]相比,GMA诱导的恶性转化细胞[(2.67±0.63)×10^-5]中LncRNA PCA3表达上调(P<0.05);全基因组表达谱芯片显示,16HBE恶性转化细胞的PRUNE2表达量(10.95)较DMSO组(19.46)明显下调,与LncRNA芯片结果一致。结论:LncRNA PCA3可作为GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中相关特异分子标志之一。     

GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中LINC00472的表达及其意义

目的：探讨在甲基丙烯酸环氧丙酯（GMA）诱导人支气管上皮细胞（16HBE）恶性转化过程中长链非编码RNA LINC00472的表达特征及其生物学意义。方法：以DMSO作为溶剂对照组,实验组采用8 μg/mL的GMA染毒处理72 h,重复染毒3次,传代培养,收获两组细胞的第10、20和30代（分别代表前、中、后期）16HBE细胞,采用Arraystar人类LncRNA芯片（v4.0）分析细胞中LINC00472的表达改变,实时荧光定量PCR （qPCR）检测LINC00472和预测靶基因miR-24-3p的相对表达水平。结果：芯片检测结果显示,与同代龄DMSO对照组相比,GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中LINC00472在转化第10代和第20代分别下调2.30倍和3.57倍,第30代上调2.32倍。qPCR检测结果表明,与同代龄对照组相比,LINC00472在早期的相对表达水平差异无统计学意义,而在中期和后期的相对表达水平的变化情况与芯片结果基本一致,其可能的靶基因miR-24-3p在不同时期相对表达水平的差异均具有统计学意义（P < 0.05）,但差异倍数均 < 2。结论：LINC00472在GMA诱导16HBE细胞恶性转化的前期表达水平未发生明显改变,而在细胞恶性转化的中期低表达、后期高表达,推测LINC00472可能在GMA诱导16HBE细胞恶性转化后期发挥作用,但LINC00472和miR-24-3p在此过程中是否存在相互作用以及其作用机制有待进一步研究。     

人支气管上皮hsa-miR-148a-3p 低表达细胞株的建立

目的： 建立稳定的hsa-miR-148a-3p低表达人支气管上皮细胞株(16HBE)。方法：根据miRBase中提供的序列信息设计hsa-miR-148a-3p tough decoy RNA(TuD RNA),并将其连接到慢病毒载体pLKO.1-puro上。将重组慢病毒载体转染至293FT细胞并包装为慢病毒后,收集病毒上清,感染正常16HBE细胞。用嘌呤霉素筛选出has-miR-148a-3p低表达的16HBE细胞株,通过荧光定量PCR对其进行鉴定,然后对筛选出的细胞分别采用荧光定量PCR和Western blot检测DNA甲基转移酶1(DNMT1) mRNA和蛋白的表达水平。结果：测序结果表明含hsa-miR-148a-3p TuD RNA的重组慢病毒载体构建成功;荧光定量PCR检测显示has-miR-148a-3p低表达的16HBE细胞株has-miR-148a-3p的表达量比正常16HBE细胞低44%(P<0.01),其作用靶基因DNMT1的mRNA和蛋白表达水平分别为正常细胞的3.4倍和2.0倍(P均<0.01)。结论：成功建立hsa-miR-148a-3p低表达的16HBE细胞,hsa-miR-148a-3p的低表达能提高DNMT1 mRNA和蛋白的表达水平。     

蛋白激酶CK2抑制剂对H460细胞内活性氧水平及DNA双链断裂影响

目的 观察蛋白激酶CK2抑制剂对人肺癌细胞系H460细胞内活性氧水平及DNA双链断裂损伤的影响。方法 使用终浓度为0、12.5、25.0、50.0 μmol/L的蛋白激酶CK2抑制剂醌茜素分别作用H460细胞24 h,检测CK2各亚基蛋白及mRNA水平变化。不同浓度梯度醌茜素作用4、24 h后,采用流式细胞仪检测H460细胞内活性氧水平变化。通过免疫荧光法检测CK2抑制剂对H460细胞γ-H₂AX表达的影响,并计算细胞内γ-H₂AX焦点的平均值。采用方差分析和t检验。结果 醌茜素对H460细胞CK2各亚基蛋白或mRNA水平无明显影响(CK2α,0 μmol∶12.5 μmol/L,P=0.966;0 μmol/L∶25 μmol/L,P=0.355;0 μmol/L∶50 μmol/L,P=0.864, CK2α’, 0 μmol/L∶12.5 μmol/L,P=0.409;0 μmol/L∶25 μmol/L,P=0.833;0 μmol/L∶50 μmol/L,P=0.0.746, CK2β, 0 μmol/L∶12.5 μmol/L,P=0.532;0 μmol/L∶25 μmol/L,P=0.830;0 μmol/L∶50 μmol/L,P=0.061)。随着醌茜素浓度增加及作用时间延长,H460细胞内活性氧水平明显升高。不同浓度醌茜素可增加细胞内γ-H₂AX焦点数,并呈剂量和时间依赖性(醌茜素作用时间4 h或24 h, 0 μmol/L∶12.5 μmol/L,12.5 μmol/L∶25 μmol/L,25 μmol/L∶50 μmol/L,P均=0.000,浓度为12.5 μmol/L,25 μmol/L或50 μmol/L,4 h∶24 h,P均=0.000)。结论 醌茜素可通过抑制蛋白激酶CK2活性增加肺癌H460细胞内活性氧水平及DNA双链断裂损伤,该研究为醌茜素作为一种有潜力的肺癌放射增敏剂提供了理论基础。     

甲基丙烯酸环氧丙酯致16HBE细胞恶性转化不同时期METTL9基因甲基化状态分析

目的:分析甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)致人支气管上皮(16HBE)细胞恶性转化不同时期甲基转移酶样基因METTL9甲基化状态及其表达情况,并探讨其意义。方法:收获GMA染毒第10代(早期)、20代(中期)、30代(后期)的16HBE细胞,应用甲基化芯片检测METTL9基因在GMA诱导16HBE细胞恶性转化不同时期的甲基化状态,采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测该基因在恶性转化不同时期的表达量,并与同期DMSO溶剂对照组细胞比较。结果:甲基化芯片结果显示,对照组第10代和第20代细胞未发生甲基化,第30代细胞发生甲基化;GMA染毒组16HBE细胞在第10代和第20代METTL9基因均发生甲基化(PeakScore>2),而第30代细胞未见甲基化。qPCR结果显示,与同期溶剂对照组相比,GMA染毒组16HBE细胞在第10代和第20代METTL9基因表达量上调(P<0.05);经甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-cdr)处理后,该基因与同代龄GMA组细胞相比,第10代和第30代METTL9基因的表达量水平均上升(P<0.05),第20代表达水平下降(P<0.05)。结论:METTL9基因可作为GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化前、中期的一个特异分子标志。     

结晶型硫化镍诱发细胞恶变过程中端锚聚合酶mRNA的表达

背景与目的:探讨结晶型硫化镍(NiS)诱发人支气管上皮细胞恶变过程中端锚聚合酶(tankyrase)mRNA的变化。材料与方法:用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测细胞tankyrasemRNA的表达。结果:Tankyrase在细胞恶变过程中不同阶段细胞的表达均高于正常细胞。结论:结晶型NiS诱发人支气管上皮细胞恶性转化涉及了tankyrase活性改变,tankyrase活性改变可能是结晶型NiS诱发肺癌的早期分子事件。     

自噬途径对反式-BPDE诱导人支气管上皮细胞16HBE影响及其机制的探讨

目的:研究反式-BPDE诱导正常的人支气管上皮细胞16HBE发生恶性转化前后自噬水平的变化及其可能机制。方法:利用前期建立的细胞恶性转化模型,采用激光共聚焦扫描显微镜成像技术,在无损伤状态下,实时观测反式-BPDE恶性转化细胞(16HBE-T)和正常细胞(16HBE-N)中自噬体标记蛋白GFP-LC3的荧光强度及定位,并利用蛋白质印迹法技术检测细胞内自噬信号通路关键效应分子的表达。结果:16HBE-T细胞与16HBE-N细胞相比,GFP-LC3蛋白的点状聚集明显减少,只有16HBE-N细胞的1/3左右,表明自噬水平下降,蛋白质印迹法检测发现,mTOR激酶活性上升,Beclin 1表达下降。结论:反式-BPDE可能通过自噬途径参与诱导16HBE细胞恶性转化的癌变过程,将为预防和治疗肺癌提供重要信息。