弓形虫GRA7基因的克隆表达及免疫分析

本文构建了刚地弓形虫RH株致密颗粒蛋白7(GRA7)基因原核表达重组质粒,进行蛋白表达并分析重组蛋白的免疫反应性.设计合成引物,从弓形虫RH株基因组DNA中特异扩增出GRA7基因片段并进行序列分析.目的片段用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后分别构建重组质粒pET32a-GRA7和pET28a-GRA7,而后转入大肠埃希菌BL21 (DE3)中诱导表达,Western blotting分析表达蛋白.结果显示,从弓形虫RH株中成功扩增出大小约710 bp的GRA7基因片段,构建的重组质粒经双酶切和PCR鉴定及测序,目的基因片段与预期相符.重组质粒pET32a-GRA7经IPTG诱导后,可高效表达重组蛋白,Western blotting分析显示重组GRA7蛋白能被弓形虫慢性感染血清识别,而重组质粒pET28a-GRA7未能诱导表达出目的蛋白.原核表达的重组GRA7抗原具有特异的免疫反应性,为弓形虫的诊断应用和疫苗研究奠定了基础.     

弓形虫ROP2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :构建弓形虫棒状体蛋白 (ROP2 )基因重组质粒并在大肠杆菌中表达 ,用于筛选弓形虫新的诊断抗原和疫苗分子。方法 :根据ROP2基因已知序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出ROP2基因片段 ,再克隆到pGEX 4T 1质粒 ,重组质粒经酶切及PCR鉴定 ,而后进行测序 ;重组质粒在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中进行ITPG诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE及WesternBlot分析。结果 :ROP2基因PCR产物大小与预期相符 ,约 1 0 4 3bp ,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合 ;SDS PAGE及免疫印迹显示ROP2融合蛋白表观分子量约为 5 5kDa ,表达产物约占菌体总蛋白1 7% ,具有一定的免疫反应性。结论 :克隆并表达了弓形虫ROP2基因 ,为下一步弓形虫诊断及疫苗研究奠定了基础     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫微线体蛋白MIC3基因。方法 从弓形虫RH株分离总的RNA,反转成cDNA.根据MIC3基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应（PCR）方法从弓形虫cDNA中扩增MIC3基因片段,插入pGEM-T载体,并转化大肠杆菌Top10,经PCR、双酶切、测序验证后,将MIC3基因片段定向亚克隆到载体pET-28a中构建原核表达重组质粒pET-28a-MIC3,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果 从弓形虫RH株cDNA中扩增出792bp大小的MIC3基因片段并诱导表达27 300 Mr的重组MIC3蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pET-28a-MIC3重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。     

人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达

目的：克隆人LIGHT胞外区基因（hsLIGHT），构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从HL60细胞中扩增hsLIGHT，将其克隆人原核表达质粒pGEX-4T-2，构建其重组表达质粒pGEX-4T-2／hsLIGHT，以不同浓度IPTG诱导表达，于不同时间经SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定。结果：经RT-PCR扩增获得的hsLIGHT序列与Genebank报道的LIGHT基因胞外区序列完全一致；SDS-PAGE和Westernblot分析证实重组质粒可表达出相对分子量为47000的蛋白，与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了人LIGHT胞外区基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌E-coli BL21中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-hsLIGHT，为进一步探讨LIGHT的抗肿瘤生物学活性、探索肿瘤免疫治疗新方法奠定了基础。     

人IL-1RⅡ基因的克隆及其表达

克隆人IL 1RⅡ基因 ,构建其逆转录病毒载体 ,以探讨其在IL 1主导疾病中的作用。方法 :用RT PCR法从人外周血单个核细胞 (PBMC)中克隆人的IL 1RⅡ基因。将其克隆到原核表达质粒PET2 2b中 ,构建重组质粒PET2 2b IL 1RⅡ。将该重组质粒依次进行PCR、酶切鉴定及测序后 ,转化BL2 1菌 ,以IPTG诱导表达。表达产物用Westernblot鉴定。另外 ,将以酶切重组质粒PET2 2b IL 1RⅡ所获IL 1RⅡ基因的全长ORF ,克隆到逆转录病毒质粒中并转染 2 93细胞 ,用免疫组化染色法检查IL 1RⅡ基因的表达。结果 :用RT PCR法 ,从人PBMC中扩增出 12 0 3bp的cDNA ,测序证实为人IL 1RⅡ基因。Westernblot表明 ,重组质粒可表达IL 1RⅡ蛋白。免疫组化染色表明 ,IL 1RⅡ重组逆转录质粒可在 2 93细胞中高效表达IL 1RⅡ蛋白。结论 :成功地克隆了人IL 1RⅡ基因 ,构建了其原核表达载体和重组逆转录病毒载体 ,并在BL2 1菌中表达IL 1RⅡ重组蛋白 ,为进一步研究IL 1RⅡ基因在相关疾病中的作用创造了有利条件     

弓形虫ROP1基因的体外扩增及克隆

弓形虫棒状体蛋白（ROP1）存在于速殖子棒状体内。根其已知基因序列设计合成一对引物，用PCR技术从弓形虫RH及ZS2株的基因组DNA中扩增出编码ROP1的基因片段，将扩增产物与pBV220原核高效表达质粒重组，构建成功pBV200-RCP1重组子，转化大肠杆菌TG1，DHSα，以进一步诱导表达RCP1非融合蛋白，用于对弓形虫侵入机制及免疫特性的研究。     

弓形虫虎源分离株ROPIO基因的克隆、序列分析及其表达研究

采用RT-PCR技术从弓形虫虎源分离株中扩增出ROP10基因，将其克隆入pMD18．T载体中进行测序和生物信息学分析，并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。该基因全长1761bp，编码586个氨基酸，其中前28个氨基酸残基构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比，16个核苷酸存在变异，导致7个氨基酸发生改变，但两者N-联糖基化位点的数量和位置没有差异，两虫株核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99．2％和98．8％。转化重组质粒pETROP10的大肠杆菌B121（DE，）在IPTG的诱导下，可表达出分子量为67．6kDa的重组蛋白，表达量占菌体蛋白的13．8％。     

弓形虫复合基因SAG1-BAG1的构建、表达及重组抗原的免疫反应性分析

目的构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1及分析重组抗原的免疫反应性。方法利用PCR扩增弓形虫SAG1基因,利用RT-PCR扩增弓形虫BAG1基因,通过酶切连接分别将SAG1、BAG1基因克隆到pET28a表达载体中构建复合基因SAG1-BAG1。将质粒pET28a-SAG1-BAG1转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,Western-blot分析该重组蛋白的免疫反应性。结果复合基因SAG1-BAG1全长约1 407 bp,重组蛋白相对分子质量约为50 000,表达量约占菌体总蛋白的10%,Western-blot分析显示重组蛋白具有良好的免疫反应性。结论成功构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1。     

弓形虫虎源分离株ROP10基因的克隆、序列分析及其表达研究

采用RT-PCR技术从弓形虫虎源分离株中扩增出ROP10基因,将其克隆入pMD18-T载体中进行测序和生物信息学分析,并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。该基因全长1761bp,编码586个氨基酸,其中前28个氨基酸残基构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比,16个核苷酸存在变异,导致7个氨基酸发生改变,但两者N-联糖基化位点的数量和位置没有差异,两虫株核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99.2%和98.8%。转化重组质粒pETROP10的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下,可表达出分子量为67.6 kDa的重组蛋白,表达量占菌体蛋白的13.8%。     

刚地弓形虫醛缩酶蛋白的表达及其多克隆抗体的纯化

目的:体外制备弓形虫醛缩酶(aldolase)蛋白及其多克隆抗体.方法:以弓形虫cDNA链为模板,PCR扩增醛缩酶基因,构建aldolase/pET30a原核表达系统;IPTG诱导表达aldolase-His6蛋白;用纯化的蛋白加免疫佐剂免疫SD大鼠,收集抗血清,制备多克隆抗体,亲和层析纯化并分析抗体的效价.结果:构建了aldolase原核表达系统,表达并纯化了aldolase-His6蛋白;获得了抗该蛋白的大鼠源性抗血清,纯化后的多克隆抗体效价为1∶4 000.结论:在体外制备并纯化了aldolase-His6蛋白及其多克隆抗体,为后续研究aldolase的功能奠定了基础.     

弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因的克隆、鉴定与生物信息学分析

目的克隆并鉴定弓形虫PRU株表面抗原SAG2C基因序列和cDNA序列，对比不同毒力弓形虫株（PRU、RH、ME49）中SAG2C基因序列。进行生物信息学分析。方法根据SAG2C基因已知序列设计合成一对引物，应用PCR技术从Prugniaud（PRU）株弓形虫基因组DNA和总RNA中扩增SAG2C基因，克隆入pMD19-T载体并进行序列测定。应用DNAMAN软件、NCBI网站（http：／／www。ncbi．nlm．nih.gov／）分析3种虫株之间SAG2C基因的同源性；利用生物信息学网站ExPASy（http：／／us.expasy．org／）对获得的基因及推导出的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果PCR扩增得到弓形虫PRU株SAG2C基因及其全长cDNA序列．酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒。测序结果表明，获得SAG2C基因序列1225bp，全长cDNA序列1095bp，编码364个氨基酸。同源性分析显示。弓形虫Prugniaud株和RH株SAG2C基因同源性为97．14％；Prugniaud株与ME49株cDNA序列同源性为96．89％；编码氨基酸序列同源性为92％。N端为信号肽，C端疏水序列预测它为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白．存在13个潜在抗原表位及多个保守功能区域。结论成功克隆了弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因序列及其全长cDNA序列。序列分析显示其为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白。     

刚地弓形虫SAG3基因体外扩增及生物信息学分析

目的获取刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）RH株表面抗原SAG3目的基因片段,对其结构和功能进行生物信息学分析,预测其编码蛋白作为候选抗原基因的可行性。方法提取弓形虫的基因组DNA,自行设计一对寡核苷酸引物,PCR体外扩增SAG3基因,用生物信息学方法对SAG3蛋白的理化性质、结构和功能进行预测。结果扩增出的基因片段约1174bp,测序后鉴定其为弓形虫RH株SAG3基因片段。预测SAG3蛋白相对分子质量约为41785．2。能形成两个功能结构域,氨基酸序列的前38（或39）位为信号肽序列。通过多种预测方法分析SAG3氨基酸序列抗原表位可能位于第10、50、80、95、160、180、220、250、300、330和360位点内或附近。结论成功获得SAG3基因,为深入研究该基因结构奠定了基础。     

Rapid and sensitive diagnosis of Toxoplasma gondii infections by PCR

DNA was extracted with a modified Qiagen DNA Mini Kit method from 20 clinical samples and was amplified by PCR using specific primers for the T. gondii B1 gene. T. gondii was detected correctly in 18 of the 20 clinical samples in < 5 h, with a detection limit of two parasites/sample. The results were in good agreement with those obtained by a more complicated and time-consuming procedure involving two-step nested PCR and either liquid hybridisation or colorimetric detection using internal probes.     

核心链霉亲和素基因的克隆及表达

文章采用PCR方法 ,以链霉亲和素菌 (Streptmycesavidinii)基因组DNA为模板 ,克隆出 384bp的DNA片段并以BamHI及XhoI位点装入PSK载体 ,经测序确证为核心链霉亲和素基因 (core strepavidin )。将该基因重组到质粒pET 2 4a ( + ) ,构建重组表达质粒pET 2 4a CS。转化大肠杆菌BL2 1,经IPTG诱导后得到高效表达。SDS PAGE图谱显示表达产物相对分子质量为15 0 0 0 ,与其基因编码蛋白的理论值相符。HRP标记的生物素作为抗体进行Westernblot,结果在 15 0 0 0处可见特异性条带 ,因此表明核心链霉亲和素能与生物素特异性结合     

2005年湛江市、韶关市、汕头市人兽弓形虫感染状况调查

目的了解广东省湛江市、韶关市、汕头市的人兽弓形虫感染情况。方法收集3个地区人、猪、鼠血清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）间接法检测弓形虫IgG抗体。结果湛江市检测猪血清279份，阳性13份，阳性率为4．66％，检测鼠血清93份，阳性7份，阳性率7．53％；韶关市检测人血清42份，阳性0份，检测鼠血清95份，阳性3份，阳性率3．16％；汕头市检测人血清50份，阳性6份，阳性率为12．00％，检测鼠血清100份，阳性3份，阳性率为4．00％。结论汕头市人群存在弓形虫感染，湛江市、韶关市、汕头市兽类存在弓形虫感染，3个地区的鼠类弓形虫感染率无统计学意义，家鼠、野鼠的弓形虫感染率也无统计学意义。     

弓形虫HT分离株ROP5蛋白基因的克隆、序列分析及其表达研究

目的克隆和表达弓形虫虎源分离株（HT株）ROP5蛋白基因。方法运用RT—PCR技术从弓形虫HT株中扩增出ROP5基因，将其克隆人T载体中进行测序和分析．并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。结果该基因全长1650bp，编码549个氨基酸。其中前24个氨基酸构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比，有12个核苷酸有差异，导致7个氨基酸发生改变，两者核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99．2％和98．9％。转化重组质粒pETROP5的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG的诱导下，可表达出相对分子质量为64800的重组蛋白，并且能与弓形虫抗体发生血清学反应，表达量占菌体蛋白的15．6％。结论成功克隆和表达了弓形虫HT株ROP5蛋白基因，表达的重组蛋白具有良好的反应原性。     

Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention

Toxoplasmosis, caused by the protozoan parasite Toxoplasma gondii , is one of the most common parasitic infections of man and other warm-blooded animals. It has been found world-wide from Alaska to Australia. Nearly one-third of humanity has been exposed to this parasite. In most adults it does not cause serious illness, but it can cause blindness and mental retardation in congenitally infected children and devastating disease in immunocompromised individuals.