肠杆菌科产CTX-M酶细菌耐药性与β-内酰胺酶基因型的关系

目的 :了解我院肠杆菌科产CTX M酶细菌耐药性与 β 内酰胺酶基因型的关系。方法 :对 2 0 0 1年 1 0月～ 2 0 0 2年 5月我院临床分离的 4 0株产ESBLs肠杆菌科细菌琼脂对倍稀释法测定 1 0种抗菌药物的最低抑菌浓度 :用针对SHV、TEM、CTX N基因的特异性引物进行PCR扩增确定 β 内酰胺酶基因型 :对扩增的CTX M基因进行DNA序列分析。结果 :产CTX M酶菌中有 93～ 75 %产 2种或 2种以上 β 内酰胺酶。产CTX M酶菌株多重耐药率为 1 0 0 % ,对头孢噻肟、头孢吡肟、头孢他啶、头孢哌酮 /舒巴坦的耐药率分别为 81 .2 5 %、75 %、31 .2 5…     

华南地区质粒介导超广谱β-内酰胺酶的基因分型研究

目的：了解华南地区质粒介导超广谱β－内酰胺酶（ESBLs）的发生率及基因型特征。方法：收集2001年4月－9月革兰阴性菌临床分离无重复株共1184株，采用NCCLS表型筛选和确认试验进行了ESBLs产酶的识别，E-test法检测各亚型ESBLs的MICs值，质粒接合及电转化实验，耐药质粒提取及酶切指纹分析，等电聚焦电泳，PCR通用引物扩增TEM、SHV、CTX－M、VEB、PER、SFO基因及其克隆测序进行ESBLs基因分型和质粒定位。结果：革兰阴性苗ESBLs的检出率为14．6％（173／1184）；获得产ESBLs接合子67株，电转化子11株，其中产CTX－M－14型ESBLs为33．3％（26／78）、CTX－M－3为23．1％（18／78）、CTX－M－9为14．1％（11／78）及SHV-2a为2．6％（2／78），未定型为5．1％（4／78）；29．5％（23／78）野生株伴广谱酶TEM－1或SHV－1型；各型ESBLs基因约定位在35－190kb大小的可接合性低执行者拷贝数天然质粒上；CTX－M型ESBLs以对头孢噻肟高水平高耐为特征。结论：华南地区质粒介导的ESBLs以CTX－M型衍生酶为主，其次是SHV型酶。     

CMY型AmpC酶新基因亚型的序列分析与表达载体构建

目的 对两株弗劳地枸橼酸杆菌所产CMY型AmpC酶进行基因克隆、序列分析和重组表达载体的构建.方法 以产CMY型AmpC酶的弗劳地枸橼酸杆菌30、31号总基因组DNA为模板,PCR扩增CMY基因,将其克隆人pGEM-T载体后测定该核苷酸序列.30、31号菌与受体菌进行质粒接合实验,构建pBV220-CMY重组表达载体.对原菌株和重组菌株进行AmpC酶检测.结果 PCR扩增出大小为1146 bp的基因片段,与GenBank上多种CMY亚型的基因序列同源性为97%.质粒接合实验证实质粒上含CMY基因,为可转移质粒.三维实验结果显示30、31号菌和重组菌株所产的酶均能水解头孢西丁.结论 30、31号菌所产的CMY型AmpC酶为CMY新基因亚型.成功构建重组表达载体pBV220-CMY,为下一步酶的表达和纯化提供了依据.     

临床分离产头孢菌素酶阴沟肠杆菌的耐药性研究

目的：研究我院产头孢菌素酶（AmpC酶）阴沟肠杆菌的检出率、耐药情况厦ampC基因型。方法：收集临床分离的耐药阴沟肠杆菌15株;三维试验检测AmpC酶;NCCLS方法检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）;琼脂二倍稀释法测定MIC值;PCR扩增检测ampC基因及序列测定。结果：15株菌中8株菌（53,3％）产AmpC酶,3株菌（20．0％）产ESBLs。产AmpC酶的菌株除对亚胺培南全敏感外,对其它抗菌药不同程度耐药。5株菌的ampC基因与阴沟肠杆菌ECLC074的ampC基因100％同源,3株菌与之99％同源．2株菌的AmpC酶发生了1个氨基酸残基的改变。结论：产AmpC酶是阴沟肠杆菌对口．内酰胺类抗生素耐药的主要机制之一。阴沟肠杆菌ECLC074 ampC基因是我院主要的阴沟肠杆菌ampC基因型。产AmpC酶的阴沟肠杆菌常呈多重耐药,亚胺培南是治疗此类菌所致感染的最有效药物。     

产质粒介导AmpC酶和ESBLs细菌的耐药性及β-内酰胺酶基因型研究

目的　了解我院同时产质粒介导AmpC酶和超广谱 β 内酰胺酶 (ESBLs)肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌的耐药性及其 β 内酰胺酶的基因型特征。方法　 110株临床分离无重复肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌耐药株 ,采用酶提取物三维实验检测AmpC酶 ,美国临床实验室标准委员会 (NCCLS)表型筛选和确认实验检测ESBLs ;琼脂二倍稀释法测定抗生素对同时产AmpC酶和ESBLs菌株的最低抑菌浓度 (MICs) ;等电聚焦实验测定 β 内酰胺酶等电点 (pIs) ;质粒接合实验定位耐药基因 ;PCR通用引物扩增AmpC酶与ESBLs基因及其序列测定以确定其基因亚型。结果　同时产AmpC酶和ESBLs菌株在肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌中的检出率分别为 7.7% (5 6 5 )、8.9% (4 4 5 )。该类产酶菌株产 2～ 3种pI5 .4～ 9.0 β 内酰胺酶 ,对第三代头孢菌素、氨曲南、头孢美唑和含酶抑制剂复合制剂的敏感性极低 ,但对亚胺培南均敏感。 9株质粒中均检出AmpC酶基因DHA 1亚型 ,其中 1株同时检出ACT 1亚型 ;ESBLs基因亚型分别为CTX M 14、CTX M 3、CTX M 9,各有 4、3、2株 ;有 3株还携带广谱酶TEM 1基因。结论　我院存在同时产质粒介导DHA 1、ACT 1型AmpC酶和CTX M型ESBLs肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌流行株 ,药敏检测结果显示对大多数新型广谱 β 内酰胺类抗生     

产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌的研究

目的 :了解四川大学华西医院产超广谱 β 内酰胺酶 (ESBLs)大肠埃希菌中CTX M基因的检出情况及产CTX M酶大肠埃希菌的耐药性和同源性。方法 :对 2 0 0 1年 1 0月～ 2 0 0 2年 5月我院临床分离的 30株产ESBLs大肠埃希菌采用琼脂平皿对倍稀释法和PCR方法进行耐药表型和 β 内酰胺酶基因型分析 ;对扩增的CTX M基因进行DNA序列分析 ;用脉冲场凝胶电泳 (PFGE)分型技术了解产CTX M酶大肠埃希菌同源性。结果 :1 3株菌携带CTX M基因 ,CTX M酶亚型为CTX M 3和CTX M 1 4。产CTX M酶菌株对第三代头孢菌素耐药率高 ,对头孢噻肟…     

产AmpC酶阴沟肠杆菌耐药的基础与临床

目的 :对我院阴沟肠杆菌产AmpC酶菌株的检出率、耐药性及ampC结构基因序列进行分析 ,探讨阴沟肠杆菌产AmpC酶菌株的耐药性及临床特点。方法 :采用琼脂稀释法对我院临床标本中分离的阴沟肠杆菌进行产AmpC酶株的筛选 ,用酶粗提物头孢西丁三维试验结合PCR法检测AmpC酶 ,并测定产AmpC酶菌株对 9种抗菌药物的MIC值。对 3株高度耐药阴沟肠杆菌产AmpC酶的结构基因和 1株敏感菌行PCR扩增并对产物序列进行分析 ,测序的菌株与E .cloacaep99进行了核苷酸序列比较和推导的氨基酸序列比较。结果 :阴沟肠杆菌产AmpC酶株的检出率为2 4 .6 %。产A…     

CMY-39新基因亚型AmpC β-内酰胺酶的特性研究

目的对弗劳地枸橼酸杆菌所产CMY-39新基因亚型AmpCβ-内酰胺酶进行酶特性研究。方法 pET-32a（＋）/CMY-39表达质粒在BL21（DE3）中诱导表达,进行SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定酶蛋白的表达;原菌株和重组表达菌株进行药敏试验,并提取重组表达菌株的CMY-39酶蛋白进行AmpC酶三维试验和酶动力学检测。结果 pET-32a（＋）/CMY-39在大肠埃希菌中大量表达,蛋白相对分子质量约为60000,用特异抗体经Western检测该条带为阳性;AmpC酶三维试验为阳性;CMY型重组菌株药敏试验结果与原菌株相比,对青霉素类和头孢西丁具有明显的水解作用,第三、四代头孢菌素对之较为稳定,动力学结果与酶稳定性结果基本一致。结论证实重组菌株pET-32a（＋）/CMY-39能高效表达CMY-39酶蛋白,表达CMY型重组菌株与原菌株比较,对β-内酰胺类抗生素的敏感性和稳定性有所增加,亲和力下降。     

北京发现同时产DHA-1质粒AmpC型及CTX-M型超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌

目的研究大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌同时产超广谱β内酰胺酶(ESBL)及质粒型Ampc酶菌株的比率及其基因型。方法收集北京两家教学医院2001--2002年产ESBL且对头孢西叮耐药的59株大肠埃希菌和21株肺炎克雷伯菌，采用等电聚焦电泳测定β内酰胺酶的等电点；接合试验证实酶基因有无可转移性，并用碱裂解法提取质粒；采用多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction，MPCR)及序列分析确定质粒AmpC酶的基因型。脉冲场凝胶电泳(pulsed field gelel ectrophoresis，PFGE)确定耐药菌株的亲缘关系。结果北京两家医院ESBL中质粒型AmCZ酶的发生率，大肠埃希菌分别为0和2％，肺炎克雷伯菌则分别为9．7％和17．1％。1株大肠埃希菌及9株肺炎克雷伯菌产生DHA-1型质粒AmpC酶，同时也产CTX-3型(6株)或CTX—M-14(1株)或SHV-12(3株)型ESBL。10株中，3株肺炎克雷伯菌可将头孢西叮耐药性传给受体菌。这10株菌均至少携带1个约33—36kb的大质粒，未发现质粒的传播。PFGE发现这10株菌来自不同的克隆株。结论北京地区发现同时产DHA-1质粒AmpC型及CTX—M型ESBL的肺炎克雷伯菌，它们来自不同的克隆。     

新四代头孢菌素β-内酰胺酶稳定性的研究

目的研究第四代注射用头孢菌素头孢匹罗对8株包括质粒介导与染色体介导产酶菌株β-内酰胺酶的稳定性,并与其它4种头孢菌素进行比较.方法采用超声波破碎法提取细菌β-内酰胺酶,紫外分光光度法测定酶对抗生素的水解率.结果头孢匹罗对各产酶菌株β-内酰胺酶的相对水解率<5%,尤其对质粒介导的超广谱β-内酰胺酶TEM-3、SHV-4及染色体介导Ⅰ型β-内酰胺酶的稳定性明显优于头孢噻肟及其他头孢菌素.结论头孢匹罗对β-内酰胺酶具有高度稳定性.     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆与原核表达

目的 克隆肿瘤抗原MAGE-3基因3’端657bp片段，对其编码的蛋白羧基端97-314aa进行原核表达。方法 从含人MAGE-3基因全长cDNA的pUC19／MAGE-3质粒中经聚合酶链式反应(PCR)扩增3’端657bp片段，并克隆入pGEX-4T-1载体，构建重组原核表达质粒pGEX／MAGE-3，对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达。结果 从pUC19／MAGE-3重组质粒中扩增获得一条约660bp的条带，测序结果表明与GenBank公布的MAGE-3序列一致，成功地构建了pGEX／MAGE-3原核表达质粒，含有该质粒的大肠杆菌DH5α经异丙基-β-半乳糖苷(Isopropyl—beta—D—thiogalactopyranoside，IPTG)诱导后表达Mr为54000的谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferse，GST)融合蛋白。表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的28％。结论 成功地构建了pGEX／MAGE-3原核表达质粒，获得了MAGE-3蛋白羧基端97～314aa融合蛋白，为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

L1型金属β-内酰胺酶的原核表达及特性研究

目的：对临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌所产L1型金属β-内酰胺酶基因进行原核表迭，并检测多种β-内酰胺类抗生素对重组L1酶的稳定性。方法：PER扩增L1酶的编码基因，将其亚克隆入pUCm—T载体，测序后将L1基因克隆至表达栽体pET-41a（＋）后在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达，分光光度计测定多种β-内酰胺类抗生素对L1型金属β-内酰胺酶的稳定性。结果：本实验中的L1酶与国外同类酶的氨基酸同源性为92．44％。重组L1酶水解青霉素及碳青霉烯类抗生素的能力接近，氨曲南及头孢他啶对L1酶高度稳定。结论：对L1型金属B内酰胺酶的克隆测序及成功表达为进一步研究该酶的分子生物学特性奠定了基础。抗生素对L1酶的稳定性研究为指导临床合理应用抗生素提供了科学的理论依据。     

肠杆菌科细菌中超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的研究

目的 调查我院院内肠杆菌科细菌中产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）菌株的发生率以及ESBL的表型和基因型。方法 对1999年2月-5月临床分离的162株肠杆菌科细菌,采用美国临床实验室标准化委员会规定的ESBL表型筛选和确证试验确定ESBL的发生率;等电聚集电泳,抑制试验,接合试验确定ESBL菌株中酶的表型;质粒的提取,脉冲场凝胶电泳（PFGE）、TEM-、SHV-、CTX-M-3特异引物的PCR和测序确定ESBL的基因型。结果 11.4%（5/44）的大肠杆菌、39.5%(17/43)的肺炎克雷伯菌、6.0%（3/50）的阴沟肠杆菌和8.0%(2/25)的弗劳地枸橼酸菌产ESBL。对于这27株菌,头孢噻肟的MIC明显高于头孢他啶,除1株阴沟肠杆菌外,其它26株菌对亚胺培南敏感,大多数菌株产2-6种酶,70.3%(19/27)的菌株产生CTX-M-3型的ESBL（等电点为8.6)。这种酶能被克拉维酸抑制,其编码的耐药性能够转移至敏感株,并且对头孢噻肟的耐药高于头孢他啶,对小部分菌株用PF-GE分型发现存在多个克隆。结论 产ESBL的肠杆菌科在院内较普遍;CTX-M-3型的ESBL最为常见。     

转染超抗原SEA肝癌细胞的构建及鉴定

目的用基因重组的方法将葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因转染至肝癌细胞．方法先从产SEA标准菌株中提取并扩增SEA全长基因，将SEA基因克隆及亚克隆至真核表达载体pLXSN构建pLXSN—SEA重组质粒，再将重组质粒转染至人肝癌细胞系BEL-7402细胞，用RT—PCR和ELISA法鉴定．结果从产SEA标准菌株ATCCl3565中提取并扩增出SEA基因全长片段；SEA基因克隆和亚克隆至真核表达载体pLXSN，经测序证实所得序列与GenBank中的标准序列完全一致；将pLXSN—SEA质粒转染肝癌细胞BEL-7402，经筛选获得稳定表达的抗性单克隆．RT—PCR扩增出约800bD的基因片段，经ELISA分析细胞培养上清中SEA蛋白的含量在皮克的水平．结论成功构建了重组超抗原SEA基因的克隆载体及真核表达载体，将SEA基因转染至肝癌细胞株BEL－7402细胞后癌细胞能够表达并持续分泌SEA蛋白．     

同时产ArmA型16S rRNA甲基化酶及KPC-2型β-内酰胺酶泛耐药阴沟肠杆菌的研究

目的 探讨上海交通大学医学院附属瑞金医院分离的5株泛耐药阴沟肠杆菌产碳青霉烯酶及16S rRNA甲基化酶的情况及两者之间的相关性.方法 用E test法检测5株泛耐药阴沟肠杆菌对10种抗菌药物的MIC值.PCR扩增16S rRNA甲基化酶基因armA、mtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA,β-内酰胺酶基因TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、CTX-M-25、PER-1、VEB-1.鸟枪克隆法克隆碳青霉烯酶基因,并对克隆片段进行测序.质粒接合试验验证碳青霉烯酶基因及16S rRNA甲基化酶基因是否具有转移性.脉冲场凝胶电泳(PFGE)法对5株菌进行分子分型.等电聚焦电泳法检测β-内酰胺酶等电点.Southern杂交法对耐药决定因子进行定位.结果 5株阴沟肠杆菌对10种抗菌药物的MIC值均＞32 mg/L.克隆的碳青霉稀酶基因为blaKPC-2,酶编码基因上游为一转座酶基因,两侧为复制靶位,下游为ISKpn6的插入序列,该序列包括一个重复序列和tnpA转座子,酶编码基因位于54.2 kb的一个非接合性大质粒上.等电聚焦电泳显示5株菌均产4种β-内酰胺酶(TEM-1,pI5.4;KPC-2,pI6.7;SHV-12,pI8.2;CTX-M-14,pI8.4).16S rRNA甲基化酶基因位于接合性质粒上,而blaKPC-2基因则位于非接合性质粒上,5株菌PFGE型别一致.结论 5株泛耐药阴沟肠杆菌对碳青霉烯类耐药由产碳青霉烯酶KPC-2所介导.blaKPC-2与armA型16S rRNA甲基化酶基因由两条不同的质粒编码,不存在相关性.临床医院应加强监控,以防止交叉感染.     

CTX—M一3型超广谱β-内酰胺酶原核表达条件的研究

目的探讨重组质粒pET一28a（＋）／CTX—M一3分别在大肠埃希菌ER2566和BL21（DE3）中进行原核表达的最佳条件。方法分别在不同的宿主菌、诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度中诱导pET．28a（＋）／CTX—M一3融合表达载体,目的产物经SDS—PAGE和BandScan凝胶分析软件分析,以获得最佳表达条件。结果表达载体的最佳诱导条件是重组质粒在BE21（DE3）中18℃诱导24h,IPTG终浓度为0．8mmol／L;表达载体在最佳条件下表达时,目的蛋白的最高表达量占菌体总蛋白的33％。结论获得pET一28a（＋）／CTX—M一3在大肠埃希菌中表达CTX—M一3型超广谱β一内酰胺酶（extended—spectrumB—lactamase,ESBLs）蛋白的最佳条件,为此酶的大量纯化奠定了基础。     

ICU耐药黄杆菌携带β-内酰胺酶基因的研究

目的 :探讨ICU临床分离黄杆菌耐药株携带 β 内酰胺酶的类型及基因介导方式。方法 :研究对象为从ICU分离所得的三株黄杆菌临床耐药株。产 β 内酰胺酶情况采用纸片法定性检测 ;细菌质粒和染色体以市售试剂盒抽提 ;酶编码基因用PCR检测分析。结果 :3株菌均产 β 内酰胺酶 ,PCR分析在其染色体和质粒上共发现 6种酶基因。其中菌株 0 2 2 0 3存在染色体和质粒共同介导的PSE 1 ,0 2 2 4 4存在质粒介导的TEM、AmpC、PSE 1 ,而 0 2 2 5 8除由质粒介导的SHV、OXA 1、CTX M 1外 ,尚由染色体介导编码SHV、TEM。结论 :ICU分…     

人源性神经营养素-6成熟肽基因融合表达载体的构建及表达产物的纯化

为了得到人源性神经营养素-6(N eurotroph in-6,NT-6)成熟肽片段,本研究以经测序鉴定的人源性NT-6 cDNA为模板,通过聚合酶链式反应(Po lym erase cha in reaction,PCR)扩增得到NT-6蛋白成熟肽编码区基因片段;将该基因克隆到融合表达载体pGEX 1-λT,构建重组原核融合表达质粒pGEX-NT-6;在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropy l-βD-th ioga lactos ide,IPTG)诱导的条件下,观察融合蛋白在大肠杆菌JM 109中的表达情况;利用蛋白回收试剂盒对表达产物进行纯化。结果表明经PCR扩增后,得到一分子量为460 bp左右的片段;含有该片段的重组质粒经电泳及双酶切鉴定表明,所得到的重组质粒即为含有目的片段的pGEX 1-NT-6;与带有pGEX 1-λT质粒的细菌相对照,pGEX 1-NT-6质粒转化的大肠杆菌JM 109,在IPTG诱导下表达了特异性的融合蛋白,该蛋白分子量为41 KD。获得的融合蛋白经凝血酶酶切后,得到了分子量大约为15 KD的NT-6成熟肽。本研究成功构建了人源性NT-6成熟肽编码区基因融合表达载体,并纯化了其表达产物,为研究人源性NT-6的生物学功能奠定了基础。     

多重耐药铜绿假单胞菌超广谱β-内酰胺酶分析

目的 对多重耐药铜绿假单胞菌产β－内酰胺酶进行分析。方法 用E－试验和三相水解试验分析46株常规药敏试验全部耐药的铜绿假单胞菌的耐药表型，并用PCR扩增和产物测序方法检测其中可能产β－内酰胺酶的情况。结果 46株中8株产超广谱β－内酰胺酶，经分子生物学方法证实有blaVEB-1基因，同时还有D类酶blaOXA-10基因；46株中5株为持续高产AmpC酶；1株产生1种既能水解亚胺培南，又能被氯唑西林抑制的酶。结论 我院多重耐药铜绿假单胞菌所产β－内酰胺酶以超广谱β－内酰胺酶（8／46同时有blaVEB-1基因和blaOXA-10基因）和持续高产AmpC酶（5／46）为主。     

新一代β—内酰胺抗生素对阴沟杆菌β—内酰胺酶的诱导分析

采用药物梯度平皿法,筛出两株耐Aztreonam(AZ)阴沟杆菌,其中一株β-内酰胺酶明显升高,另一株外膜蛋白改变。分析研究AZ,亚胺硫霉素(IMI),头孢氨噻(CTX)和氧哌嗪青霉素(PIP)对上述两株耐药菌及相应敏感株的β-内酰胺酶诱导情况,结果表明,IMI为强诱酶剂,CTX次之,AZ和PIP较弱;药物对细菌诱酶能力还与细菌外膜通透性,是否发生组成型突变有关。进一步分析诱导产生之β—内酰胺酶的水解底物轮廓,对酶抑制剂敏感性及等电点,发现诱导酶与组成酶,基础酶性质相似,均属Richmond—sykes分类中Ⅰ型酶。时间杀菌曲线表明,1/4MIC的AZ与1/4MIC的1M1联用于对二药均敏感的阴沟杆菌,产生相互拮抗。