弓形虫影响前列腺素E2合成的细胞内信号调节途径

目的　探讨弓形虫感染巨噬细胞过程中花生四烯酸 (AA)及前列腺素E₂ (PGE₂ )的产生及其相关的细胞内信号调节途径。　方法　构建刚地弓形虫 小鼠巨噬细胞侵染模型 ,应用气相色谱、酶联免疫吸附测定 (ELISA)、逆转录 聚合酶链反应 (RT-PCR)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)检测钙离子调节剂乙二醇双 ( 2-氨基乙醚 )四乙酸 (EG-TA)、钙离子螯合剂 (BAPTA/AM )、钙调蛋白抑制剂三氟拉嗪 (TFP)及蛋白激酶C (PKC)抑制剂 1-( 5-磺酰基 ) 异喹啉-2-甲基-哌嗪盐酸盐 (H7)对弓形虫诱导的AA、PGE₂ 含量及促细胞分裂剂诱导性环加氧酶-2 (COX-2 )mRNA和蛋白质表达水平的影响。　结果　EGTA、BAPTA/AM及TFP均可抑制弓形虫诱导的巨噬细胞AA和PGE₂ 合成 ;PKC抑制剂H7可明显抑制弓形虫和脂多糖 (LPS)诱导的巨噬细胞PGE₂ 合成 ,并伴随着COX-2mRNA和蛋白质表达呈剂量依赖性减少。　结论　弓形虫侵染巨噬细胞过程可能通过钙信号转导途径调节COX-2底物AA的含量和PKC依赖的COX-2代谢途径调节PGE₂ 的合成。     

外源性花生四烯酸在弓形虫入侵巨噬细胞中的信号作用

目的　探讨花生四烯酸在弓形虫侵染巨噬细胞中的信号作用。　方法　采用普通光镜、流式细胞仪检测巨噬细胞的感染率;Fura2/AM染色,荧光分光光度法测定游离钙离子浓度。　结果　宿主细胞内钙离子浓度及巨噬细胞感染率随着外源性花生四烯酸浓度的增加而升高,并呈剂量依赖性关系。细胞外的钙离子内流,细胞内储存的钙离子释放,包括胞膜钙离子通道均在花生四烯酸的作用下,参与了胞内钙离子的升高。钙离子通道阻断剂对花生四烯酸作用前后的感染率的影响不明显。　结论　花生四烯酸可能通过钙离子作用于宿主细胞,增高其感染率。     

金丝桃素对小鼠巨噬细胞内刚地弓形虫速殖子的增殖抑制作用

目的 观察金丝桃素(Hypericin,Hy)对小鼠巨噬细胞内弓形虫的增殖抑制作用,为抗弓形虫天然药物的筛选提供线索。方法 分离小鼠腹腔巨噬细胞(Macrophage,Mφ),建立体外Mφ感染稳定表达绿色荧光蛋白的弓形虫(RH-green fluorescent protein,RH-GFP)速殖子模型,观察不同剂量Hy的最佳作用效果。实验分4组:①A组(对照组),不加Hy;②B组(Mφ感染RH-GFP+100 μg/mL Hy);③C组(Mφ感染RH-GFP+200 μg/mL Hy);④D组(Mφ感染RH-GFP+400 μg/mL Hy),分别在培养1、2和3 h后利用荧光显微镜和流式细胞术观察计数感染的Mφ和游离速殖子在各药物浓度及各时间点的变化;透射电镜观察虫体超微结构的变化。结果 与对照组相比,随着Hy浓度的增加和用药时间的延长,Mφ内速殖子数量明显减少,游离速殖子数量也显著减少,荧光强度逐渐降低;经药物组不同浓度Hy作用后,游离/Mφ内弓形虫的比值逐渐升高,至400 μg/mL剂量作用3 h后开始下降,游离与胞内速殖子比例的差异在同一时间段内均有统计学意义 (P<0.05),但药物作用1 h或2 h各实验组之间无统计学差异 (P>0.05),作用3 h各浓度组之间差异有统计学意义(P<0.05),各实验组同一药物浓度下在孵育1、2和3 h后效果增强(P<0.05)。透射电镜观察显示,随Hy作用时间延长,虫体逐渐出现肿胀,胞膜与基质之间空隙明显,空泡形成且增多、变大,胞膜断裂,内部结构溶解溢出。结论 体外实验初步显示Hy呈剂量和时间依赖性地增强对Mφ内弓形虫速殖子增殖的抑制作用,可降低宿主细胞感染率,且对胞外速殖子有一定杀伤作用。     

刚地弓形虫巨噬细胞迁移抑制因子基因敲除虫株的构建与鉴定

目的 构建并鉴定刚地弓形虫RH株巨噬细胞迁移抑制因子(Tgmif)基因敲除虫株。方法 设计刚地弓形虫RH株Tgmif的单向导RNA (sgRNA)和点突变引物,将pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒定点突变为针对Tgmif基因的pSAG1::Cas9-U6::sg Tgmif质粒。构建含有Tgmif上游1 001 bp (Tgmif-up)、二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶基因(dhfr-ts)和Tgmif下游1 011 bp (Tgmif-down)等3个片段的Tgmif供体质粒,从Tgmif供体质粒PCR扩增获得Tgmif供体DNA。将pSAG1::Cas9-U6::sg Tgmif质粒和Tgmif供体DNA混合后电击转染野生型刚地弓形虫RH株(RH_WT)速殖子,用乙胺嘧啶培养7 d,筛选获得稳定表达乙胺嘧啶抗性的虫株并进行单克隆筛选,PCR扩增dhfr-ts上、下游同源臂和Tgmif鉴定Tgmif基因敲除单克隆株(RH_ΔTgmif)。提取RH_ΔTgmif和RH_WT株虫体蛋白,蛋白质免疫...     

莪术对SGC7901胃癌细胞COX-1,COX-2,VEGF和PGE2表达的影响

目的:观察莪术对人胃癌SGC7901细胞 COX-1,COX-2,VEGF和PGE2的影响．方法:MTT法观察莪术对胃癌细胞的抑制作用,绘制其抑制率曲线,选取抑制率为25％时的药物浓度作为加药浓度,用RT-PCR以及Western blot方法检测加药后人胃癌细胞 COX-1,COX-2基因及其蛋白表达的变化．用ELISA方法检测加药后培养基中VEGF和 PGE2的表达情况．结果:莪术对胃癌细胞有一定的抑制作用,且随着浓度的增加,其抑制作用加强;将RT-PCR 产物经电泳分析,证实胃癌细胞中有COX-1、 COX-2基因的表达,对各条带进行灰度分析发现:中西药对COX-1和COX-2均有抑制作用,莪术对COX-2的抑制作用大于塞来昔布;Western blot曝光结果可见,COX-1各组在 70 kDa处可见特异性的蛋白条带,COX-2各组在80 kDa处可见特异性的蛋白条带．对各条带进行灰度分析发现:各组中西药对COX-2 均有明显的抑制作用,而对COX-1则无抑制作用,其中,莪术对COX-2的抑制作用要强于celecoxib;西药celecoxib及莪术组可明显降低人胃癌细胞VEGF的表达,与细胞组相比,其差别有统计学意义(91．0±18．2,127．8 ±12．1 ng／L vs162．0±15．1 ng／L,P<0．01);西药celecoxib组PGE2表达低于细胞组,但其差别无统计学意义,莪术可明显降低人胃癌细胞PGE2的表达,与细胞组相比,其差别有统计学意义(67．5±6．9 ng／L vs 78．7±5．6 ng／L, P<0．01)．结论:莪术可能是通过抑制COX-2及其下游 PGE2表达,使VEGF表达下调而抑制肿瘤．     

弓形虫微线体蛋白MIC2和M2AP真核表达载体的构建

目的构建弓形虫RH株微线体蛋白M2AP和MIC2的真核表达载pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap,为建立同时表达MIC2和M2AP蛋白的重组毕赤酵母表达系统,制备重组粘附蛋白复合体MIC2-M2AP奠定基础。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,用Oligo dT-Adaptor引物逆转录合成cDNA。根据已知的弓形虫mic2和m2ap基因序列,采用引物设计软件Primer premier5.0自行设计并合成引物,以cDNA为模板,PCR扩增mic2和m2ap基因,克隆入pMD-19-simple-T载体,经酶切和测序鉴定后回收目的片段,分别插入至pGAPZαA内,构建重组毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap,转化入E.coli DH5α。提取转化菌质粒,进行酶切和测序鉴定。结果 PCR扩增得到的mic2和m2ap基因分别为2 200bp和1 000bp,与预期大小一致。T-A克隆重组质粒pMD19-T-mic2、pMD19-T-m2ap和重组酵母表达质粒pGAPZαA-mic2、pGAPZαA-m2ap经测序鉴定,与GenBank收录的弓形虫mic2基因和m2ap基因序列同源性为100%,重组毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap构建成功。结论成功构建弓形虫重组毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap,为进一步研究MIC2和M2AP相互作用机制及其免疫保护效应奠定了基础。     

尼美舒利对人胃癌SGC-7901细胞PGE2合成及COX-2、VEGF表达的影响

目的观察尼美舒利对人胃癌SGC-7901细胞前列腺素E2（PGE2）合成及环氧合酶（COX）-2、血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响，探讨其抑制胃癌血管生成的机制。方法对人胃癌SGC-7901细胞进行培养．免疫组织化学、放射免疫法检测不同浓度尼美舒利作用后细胞COX-2、PGE2、VEGF的表达。结果与阴性对照组相比。尼美舒利100、200μmol／L作用48h后SGC-7901细胞的COX-2、VEGF表达明显降低（P〈0．05），COX-2与VEGF的表达呈正相关（r=0．8080，P〈0．05）；随着尼美舒利浓度的升高，PGE2分泌逐渐降低。结论抑制COX-2的活性与表达、减少PGE。的合成及由此引起的VEGF表达降低，在抑制胃癌血管生长中可能具有一定作用。     

弓形虫表面抗原SAG2基因的克隆表达纯化及鉴定

目的构建弓形虫表面抗原2(SAG2)基因重组质粒并在大肠埃希菌中表达。方法根据SAG2基因序列设计并合成引物,用PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因片段,再克隆到p GEX-4T载体中,构建重组质粒。重组质粒经酶切鉴定并测序后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达,产物经SDS-PAGE分析并纯化,以Western blotting分析其反应原性。结果 SAG2基因PCR产物大小约为561 bp,与预期相符。重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合。重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的SAG2融合蛋白分子量约为47 ku,该蛋白可被GST标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫SAG2基因,表达蛋白具有反应原性。     

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA2全基因的原核重组表达

目的克隆弓形虫RH株致密颗粒蛋白2（GRA2）的全长基因,在大肠埃希菌工程菌中重组表达GST—His—GRA2融合蛋白。方法提取弓形虫总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增GRA2基因全长,与pET-41Ek／LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠埃希菌Rosetta^TM（DE3）pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白,然后采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白产物。结果PCR鉴定弓形虫GRA2全基因重组表达质粒构建正确;诱导表达的GST—His—GRA2融合重组蛋白分子质量单位为52ku,与预测值相符。结论本研究成功构建了弓形虫GRA2全基因重组蛋白质粒,该质粒能表达GRA2蛋白,为研究GRA2与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

扁桃酸对小鼠实验感染弓形虫的疗效

用扁桃酸对急性弓形虫感染小鼠进行实验治疗,动态观察小鼠感染弓形虫后腹水中弓形虫数量的变化、光镜结构及超微结构的改变。在小鼠感染弓形虫２４ ｈ 、７２ ｈ 将小鼠解剖及小鼠发病死亡后取小鼠腹水,分别计数试验组和对照组各时间腹水中弓形虫数,并将腹水涂片做Ｇｉｅｍｓａ 染色,光镜下观察虫体结构变化及用腹水制作电镜切片。结果显示,试验组小鼠３ 个不同时间腹水中弓形虫数与对照组相比均明显减少（ Ｐ＜ ０．０１） ;光镜观察可见试验组小鼠腹水中弓形虫形态异常,虫体肿胀,胞膜破裂,胞质减少,胞内出现空泡,胞核染色质疏松、聚集成块,核内出现空泡;电镜观察可见虫体超微结构受到不同程度的破坏。     

弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体构建及在Vero细胞中的表达

目的　构建弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体 ,并在Vero细胞中表达。　方法　设计 1对引物 ,从弓形虫RH株速殖子基因组DNA中扩增SAG2全长编码基因 ,构建 pVAX1 SAG2真核表达重组质粒。以限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ进行双酶切、PCR鉴定 ,纯化后进行测序鉴定。脂质体介导法瞬时转染Vero细胞 ,同时以 pVAX1为对照 ,48h后收集细胞 ,Western blot鉴定。　结果　从弓形虫RH株DNA中扩增出了 5 77bp的SAG2基因 ,构建了真核表达载体 pVAX1 SAG2 ,在质脂体介导下转染Vero细胞 ,质粒DNA成功的转染到细胞中。通过Westen blot分析 ,细胞裂解液样品有 1条可被弓形虫免疫血清所识别的约 17ku大小的条带 ,与预计大小一致。　结论　真核表达载体pVAX1 SAG2在Vero细胞中有一定表达 ,且有一定的活性。     

蒿甲醚对小鼠体内弓形虫作用的超微结构研究

应用透射电镜观察蒿甲醚对弓形虫超微结构的影响。发现用药后弓形虫速殖子的主要病理改变为：虫体细胞膜、核膜断裂；线粒体肿胀，呈空泡变性或嵴凝集均质化；内质网扩张；棒状体及致密颗粒显著减少；甚至出现细胞核碎裂、溶解，胞质内基质破坏溶解呈大空泡，细胞成分可由细胞内脱出，整个虫体固缩或溶解死亡。     

截短的弓形虫P30基因在E.coli中的高效表达及纯化条件的探索

目的：构建能在E.coli中高效表达的弓形虫主要表面抗原（P30）基因的重组表达质粒,并对纯化条件进行优化。方法：对已知的弓形虫P30基因序列进行部分取舍,用PCR技术从弓形虫ZS1株的基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段,插入载体pET－30(a）中,转化大肠杆蓖DH5α,IPTG诱导表达,包涵体经洗涤、变性、复性及不同程度的浓缩后,进行SDS－PAGE及免疫印迹分析。结果：从弓形虫ZS1株基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段,成功构建重组表达质料粒pET－P30;SDS－PAGE显示蛋白表达带的分子量约为31kD,表达量占菌体总蛋白的31.58％,经1M及2M尿素洗涤后,其纯度分别达63.42％及75.7%;免疫印迹显示,该纯蛋白能被弓形虫病人阳性血清所识别,产而且当浓缩至初始体积的1／3－1／6时,纯化蛋白与DNA免疫鼠血清的反应最强。结论： 成功构建重组质粒pET-P30,并以融合蛋白的形式进行了高效表达,经变 性、复性后,该蛋白具有特异的免疫反应性,为弓形虫诊断试剂盒的研制打下基础。     

脑脊液中弓形虫循环抗原的组分分析

本文在国内首先应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＢ对弓形虫循环抗原（ＣＡｇ）阳性脑脊液标本进行抗原组分分析，并用正常人脑脊液、ＲＨ株弓形虫速殖子的代谢抗原（ＭＡ）及细胞质抗原（ＣＡ）作为平行对照。结果显示，脑脊液及ＲＨ株ＭＡ的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白区带范围均在１４～１０８ｋＤ处，在３８～６７ｋＤ处有明显的电泳区带。ＥＬＩＢ反应后均在５０ｋＤ处出现明显的反应区带。从而证实，脑脊液标本中的ＣＡｇ为弓形虫虫体在宿主体内增殖的代谢及裂解产物。同时提示，酶联免疫印迹技术（ＥＬＩＢ）可代替弓形虫的病原学检查，以作为弓形虫病急性、活动性感染的确诊指标。     

用包皮成纤维细胞培养弓形虫速殖子的研究

目的　建立用包皮成纤维细胞 (Humanforeskinfibroblasts ,HFF)培养弓形虫速殖子的方法。　方法　将包皮环切术切下的包皮在含青、链霉素的Hank’s液中充分洗涤后 ,用眼科剪子剪成 0 .5cm3 的组织小块 ,移入培养瓶中培养 ,待HFF细胞长满瓶底后 ,用胰酶消化并将其接种到培养皿中的盖玻片上培养 ,HFF长满盖玻片后 ,用弓形虫速殖子感染HFF ,镜下观察并于 1、2 .5、4、5 .5、10、2 3和 3 2h取出其中一皿中的盖玻片 ,经姬氏染色、二甲苯透明后 ,镜下观察速殖子生长情况。　结果　弓形虫速殖子大多在感染后 3h～ 5h侵入HFF ,3 2h左右 ,假包囊破裂 ,释放出虫体。　结论　成功建立了用HFF培养弓形虫的方法。     

武汉地区医院病人弓形虫感染情况调查

应用酶联免疫吸附试验，对武汉地区７５１例医院病人进行了弓形虫特异性抗体ＩｇＧ、ＩｇＭ和循环抗原ＣＡｇ的检测，共检出阳性２２９例，总阳性率为３０．４９％．其中ＩｇＧ、ＩｇＭ和ＣＡｇ的单项阳性率分别为１３．５８％，７．３２％和３．２０％；三项中两项阳性的阳性率分别为３．５６％（ＩｇＧ，ＩｇＭ），０．８０％（ＩｇＭ，ＣＡｇ），１．４６％（ＩｇＧ，ＣＡｇ）；三项均阳性５例，阳性率为０．６７％。结果表明：医院病人中弓形虫感染较普遍，感染率在各病种之间有明显差异，但与病人的年龄、性别、职业及有无猫、狗类动物接触史无明显关系。     

孕鼠感染弓形虫后的动态病理变化观察

经昆明种孕鼠尾静脉注射弓形虫ＮＴ强毒株滋养体孵育液，于注射后第２、４、８、１２、２４、４８、７２ｈ分批处死，动态观察孕鼠各主要脏器的病理变化。结果表明在肺、肾、肝、脾、心等脏器的实质细胞核内或胞浆内均发现弓形虫，引起的病理变化均为非特异性，表现为实质细胞的轻度变性、坏死及少量淋巴细胞、单核细胞浸润。本实验结果提示在积极预防、治疗先天性弓形虫病胎儿发育异常的同时，对母体各脏器的功能、形态学变化需引起足够的重视，这是降低先天性弓形虫病发病率的关键。     

改良凝集试验用于检测禽类弓形虫感染的探讨

本文报道了应用改良凝集试验 ( MAT)检测禽类的弓形虫抗体水平。共检测了包括 41只家鸡在内的 77份禽类 (隶属5目、5科、13属、2 1种 )的血清 ,结果 MAT阳性 5份 ,阳性率为 6 .5 %。 4只阳性珍禽的弓形虫抗体滴度分别为 1∶ 2 0 ( 3禽 )和1∶ 6 40 ( 1禽 ) ,1只阳性家鸡的抗体滴度为 1∶ 40。珍禽的弓形虫抗体阳性率 ( 11.1% )高于家鸡的抗体阳性率 ( 2 .4% ) ,但二者无显著差异 ( P>0 .0 5 )。本文结果表明 ,简便、快速的 MAT适合于禽类弓形虫感染的血清学检测     

弓形虫感染者DNA和抗体变化的动态观察

本文对 5 0 0例有神经症状患者 ,用静脉抗凝血进行了弓形虫 DNA和抗体的检测 ,结果表明 :弓形虫 DNA阳性率2 9.2 % (146 / 5 0 0 ) ,抗体阳性率 32 .6 % (16 3/ 5 0 0 )。又对 146例弓形虫 DNA阳性者进行了治疗 1周、3周、5周、10周后 DNA及抗体变化的动态观察。结果可知 :弓形虫 DNA转阴率随治疗时间延长而提高 ,10周后全部转阴。抗体的产生为治疗 5周后达到高峰 95 .2 % ,仍有 4.8%未产生抗体。治疗 10周后阳性率只剩 2 4.7% ,以上结果显示 ,对弓形虫感染后治疗效果的观察有重要的指导意义