乙型肝炎病毒基因突变与耐药株监测进展

拉米夫定(Lamivudine)为核苷酸类似物,主要用于抗乙型肝炎病毒治疗,能有效地抑制HBV的复制。但长期使用可引起乙型肝炎病毒基因突变,其突变部位主要在 HBV基因组 P区中高度保守的聚合酶基因YMDD模序,导致耐药病毒株的出现,影响临床治疗。目前临床检测突变的手段是建立在PCR技术基础上的方法。     

乙型肝炎病毒外膜大蛋白意义分析及与慢性乙型肝炎患者病毒复制的相关性研究

目的通过分析乙型肝炎病毒(HBV)感染患者血清免疫学标志物乙型肝炎病毒外膜大蛋白(HBV-LP)、HBV-DNA及乙型肝炎病毒标志物(HBV-M)的相关性,探讨HBV-LP对反映体内HBV复制的意义。方法选取2013年4月至2015年9月深圳市龙岗区中医院收治的慢性乙型肝炎感染患者540例,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测患者的血清HBVDNA,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HBV-LP及HBV-M,对HBV-LP、HBV-M及HBV-DNA之间的相关性进行分析。结果乙型肝炎E抗原(HBeAg)阳性患者的HBV-LP阳性率为96.39%,而HBV-DNA的阳性率为93.33%,两者差异无统计学意义(P0.05);HBV-LP水平与HBV-DNA的拷贝数对数值呈正相关;而HBeAg阴性患者的HBV-LP阳性率为63.33%,HBV-DNA的阳性率为51.11%,两者差异有统计学意义(P0.05)。结论 HBV外膜大蛋白能够有效反映慢性乙型肝炎患者体内HBV复制情况,其灵敏度高于HBeAg,对于HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者而言,HBV-LP更能反映患者体内病毒的复制状态。     

乙型肝炎病毒基因变异对干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的影响

目的：探讨乙型肝炎病毒基因不同位点变异及基因型对干扰素疗效的影响。方法：研究17例HBeAg阳性慢性乙型肝炎病人的临床表现、生化、血清学和病毒学指标，并分析这些病人干扰素治疗(IFN-α2b 3MU，每周三次，疗程6个月)前血清标本中的病毒X基因和前c／c基因的DNA序列。结果：所有发生T^1762-A^1764突变的5例病人对干扰素治疗均有应答，而其余12例病人中仅2例有应答。在5例既有前c区A^1896变异又有c区抗原决定簇aa107—118变异的病人中，4例无应答，1例有应答。其他3例有A^1896位点变异的病人中，2例同时伴有1～2处淋巴细胞表位变异的病人有应答，而1例伴有5处淋巴细胞表位变异的病人无应答。应答的血清HBV DNA复制水平低而抗HBc—IgM滴度高。所有病人的血清HBV DNA基因型均为B型或C型。结论：提示HBV基因变异、血清病毒载量和抗HBc—IgM滴度等可能是干扰素治疗效果的预测指标，但有待临床和实验室研究的进一步验证。     

慢性乙型肝炎重叠感染不同肝炎病毒的临床研究

至今确认的肝炎病毒有甲、乙、丙、丁、戊、庚等多种,相互之间没有交叉免疫力。慢性乙型肝炎（简称乙肝）患者也容易感染上其它肝炎病毒造成重叠感染。为了了解慢性乙肝患者不同类型的重叠感染的临床特性,我们对1997年3月～1999年6月收治的299例不同类型重叠感染病例进行分析。报告如下。1资料与方法1．1一般资料299例血清HBsAg、HBeAg、抗-HBcIgM、HBVDNA至少有2项以上阳性;检测抗EBVIgM和-CMVIgM均为阴性,并排除酒精性、药物性、中毒性、自身免疫性肝炎和脂肪肝、代谢性肝病等,确诊为慢性乙肝患者。男女之比为2.24：1,平…     

乙型肝炎病毒基因突变与中医证候的关系

乙型肝炎病毒感染是一个严重危害全世界人类健康的公共卫生问题.由于HBV DNA复制过程中具有突变特性,HBV不同位点突变,既对慢性乙型肝炎发展成肝硬化、肝癌有重要影响,又给疾病的预防、诊断、治疗等方面带来了新的挑战.     

乙型肝炎病毒前C基因突变株与暴发性肝炎

乙型肝炎病毒(HBV)感染的临床表现复杂而多样,感染HBV后血清中可出现多种标志物.血清中HBeAg阳性转为抗-HBe阳性是否代表病毒复制减弱?抗-HBe阳性肝炎患者为什么还会出现慢性化、重症化趋向?一直是临床上急待解决的问题.近年来,有关HBV前C基因突变的报道较多,并发现前C基因突变株感染在乙型肝炎慢性化及重症化甚至发展为暴发性肝炎(FH)中起重要作用.本文就前C基因突变株与FH的问题作一概略综述.     

慢性乙型肝炎的抗病毒治疗

慢性乙型病毒性肝炎(CHB)一直是一个全球性健康问题，全球大约3．5亿人感染乙肝病毒(HBV)。在慢性HBV感染的病程中，约15％～40％将产生并发症，如重症肝炎、肝硬化、肝功能衰竭及肝细胞肝癌(HCC)。目前，CHB的治疗目的仅在于抑制乙型肝炎病毒(HBV)的复制，缓解肝脏病变，本综述总结α-干扰素和拉米夫定在治疗慢性乙肝有效性和安全性的资料，不同临床状态下的治疗策略和未来的治病方向。     

47例慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒核心基因启动子变异检测临床分析

乙型肝炎病毒变异可使病毒逃避机体免疫 ,从而使抗病毒治疗失败且使病情趋于慢性化。我们检测 47例慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒核心基因启动子 (ＨＢＶ ＢＣＰ)变异 ,同时检测患者血清丙氨酸转氨酶 (ＡＬＴ)、天冬氨酸转氨酶(ＡＳＴ)、总胆红素 (ＴＢＩＬ)、白蛋白 (ＡＬＢ) ;检测凝血酶原时间(ＰＴ) ,并计算出凝血酶原活性 (ＰＴＡ) ;检测患者血清肝纤维化标记物 :透明质酸 (ＨＡ)、Ⅲ型前胶原 (ＰＣⅢ )、Ⅳ型胶原 (ＣⅣ )、层粘蛋白 (ＬＮ)。以初步探讨ＨＢＶ ＢＣＰ变异对乙肝患者肝功能及肝纤维化的影响。1　资料与方法1.1　病例选择…     

用重叠延伸聚合酶链反应制备鸭乙型肝炎病毒基因点突变

制备含鸭乙型肝炎病毒前核心区终止密码突变的基因片段，以对此基础突变有关生物学研究。用重叠延伸聚合酶链反应制备含此人工定向点突变的基因片段；用不对称聚合酶链反应制备单链ＤＮＡ模板作测序。凝胶电泳显示ＯＥＰＣＲ产物与克隆ＤＨＢＶ ＤＮＡ酶切片段位置一致，测序证实该点突变存在。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒YMDD变异的研究

目的探讨拉米夫定治疗1年后慢性乙型肝炎（CHB）患者发生YMDD基序变异的状况及其检测方法。方法采用荧光定量PCR法检测血清HBV DNA含量，荧光PCR法和变性高效液相色谱法检测HBV YMDD基序变异。结果61例CHB患者经过拉米夫定治疗1年后，40例（65．6％）HBV DNA阴转；在21例HBV DNA阳性患者中，10例为YMDD野生型，11例出现YMDD基序变异，变异率达18．0％（11／61）。在11例基序变异中，完全变异7例（63．6％），部分变异4例（36．4％）。在完全变异型中，YIDD变异型5例，YVDD变异型2例；在部分变异型中，YIDD变异型3例，YVDD变异型1例。结论CHB患者拉米夫定治疗1年后，出现较高的YMDD基序变异率。利用荧光PCR法结合变性高效液相色谱法检测基序变异，经济便捷，可作为CHB患者YMDD基序变异的常规监测。     

Surface gene mutations of hepatitis B virus among high-risk patients with occult hepatitis B virus infection

Surface gene mutants of hepatitis B virus (HBV) have been reported in a variety of patient groups. Because of limited data regarding these mutations in patients with occult HBV infections; we aimed to determine these mutations among high-risk patients with occult HBV infection. The presence of HBV-DNA was determined in patients with isolated anti-HBc by real-time polymerase chain reaction (PCR). Then, surface gene region was amplified by nested PCR and mutations were analyzed after sequencing. The mutations that resulted in nonfunctional hepatitis B surface antigen (HBsAg) were insertion of single nucleotide in 2 cases, which causes frameshift and single-nucleotide replacement, and premature stop codons at Leu15 and Gly10 in the other 2 cases. Amino acid substitution at amino acid position 207(S207N) was found in the other isolates. Our study suggested that “a” region mutations did not play a major role in HBsAg detection, and other genetic and nongenetic factors may be responsible for failure to detect HBsAg by routine laboratory tests.     

高通量检测技术检测乙型肝炎病毒变异的临床意义

目的探讨基因芯片技术检测乙型肝炎病毒(HBV)6位点变异的临床意义。方法对91例乙型肝炎患者采用基因芯片技术,检测HBV 6位点的自然变异。结果91例乙型肝炎患者HBV变异率98.9%(90/91),其中BCP区1762位点变异率最高(61.5%)。重度肝炎和肝硬化中双位点变异显著高于轻中度肝炎(P<0.01)。29例进行过拉米呋啶抗病毒治疗的病例中P区552位点变异率为96.6%(28/29)。结论基因芯片技术检测HBV变异具有高通量、高灵敏等特点,对观察HBV基因突变有很高的临床应用价值。     

乙型肝炎病毒第1 896位点变异与基因分型同肝脏功能的相关性分析

目的分析乙型肝炎病毒前C区第1896位点变异与HBV基因型与肝功能指标之间的关系。方法对50例慢性乙肝患者采用测序和荧光定量PCR等方法检测相关指标。结果第1896位点变异患者的ALT水平与野生型患者有显著性的差异;乙型肝炎病毒前C区第1896位点变异与基因型无关。结论乙型肝炎病毒前C区第1896位点变异可能与病毒持续侵入肝细胞有关。     

HBV基本C区启动子区位点突变及病毒载量与拉米夫定耐药的关系

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）基本C区启动子（BCP）区第1762、1764位点突变及病毒载量与拉米夫定治疗慢性乙型肝炎（CHB）P区第552、528位点变异产生的关系。方法选择CHB且未接受过拉米夫定治疗的患者56例,应用拉米夫定治疗6个月,采用乙型肝炎病毒基因多态性检测芯片对拉米夫定治疗前后乙型肝炎病毒BCP区第1762、1764位点,P区第552、528位点进行检测,同时对患者治疗前后血清病毒载量进行检测。对比分析BCP区第1762、1764位点突变患者（A组）和未突变患者（B组）应用拉米夫定治疗6个月后,P区第552、528位点变异率,以及治疗前后血清病毒载量水平。结果（1）应用拉米夫定治疗6个月后,A组P区第552、528位点总突变率显著高于B组（P〈O．05）;第552、528单位点以及第552和528双位点突变率两组相比较差异均无统计学意义（P〉O．05）。（2）A组患者治疗前血清病毒载量水平显著高于B组患者（P〈O．05）。（3）产生P区第552、528位点变异患者治疗前血清病毒载量水平,显著高于P区未变异患者（P〈O．05）。结论（1）乙型肝炎病毒BCP区第1762、1764位点突变可增加拉米夫定治疗的耐药率。（2）BCP区第1762、1764位点突变可增加乙型肝炎病毒的复制水平。（3）BCP区位点突变所引起的乙型肝炎病毒大量复制可能是导致拉米夫定耐药率增加的主要原因。     

拉米夫定耐药感染者HBV基因与YMDD变异的相关性探讨

目的探讨拉米夫定耐药感染者HBV基因型与YMDD变异的相关性。方法采用PCR扩增后测序的方法,对162例拉米夫定耐药感染者进HBV基因型的分析。实时荧光定量PCR法检测HBVYMDD变异及HBVDNA载量。率的比较采用Y2检验法,两组均数间的比较采用t检验法。结果162例拉米夫定耐药感染者中,B基因型102例（63．0％）,C基因型60例（37．0％）。YMDD变异111例（68．5％）,其中YIDD变异30例（18．5％）,YVDD变异32例（19．7％）,YIDD／YVDD混合型变异49例（30．3％）。统计结果显示,不同性别之间HBV基因型分布没有显著性差别（P〉0．05）。B型患者的年龄（29．7岁±10．2岁）显著低于C型患者的年龄（35．3岁±11．3岁）,差异有统计学意义（P〈0．05）。YMDD变异的发生率在B、C基因型之间差异无统计学意义（P〉0．05）。C基因型患者血清的HBVDNA含量（6．08±0．71）显著高于B基因型组（5．73±0．90）（P〈0．05）,而血清ALT水平没有显著性差别（P〉O．05）。结论拉米夫定耐药感染者YMDD变异与基因型无关。但C基因型患者平均年龄、病毒载量显著高于B基因型,可能是导致CHB患者对拉米夫定耐药的重要因素。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎YMDD变异的产生与病毒载量的关系

目的 观察拉米夫定治疗慢性乙型肝炎（CHB）YMDD变异的产生与血清病毒载量的关系。方法 选择应用拉米夫定治疗并产生YMDD变异的CHB患者53例，分析血清病毒载量水平与YMDD变异类型、产生时间的关系。另选择具有可比性的应用拉米夫定治疗但并未产生YMDD变异的CHB患者53例（1：1配对）对比分析治疗前血清HBV-DNA定量水平。结果 YMDD变异组治疗前血清HBVDNA定量水平显著高于未产生YMDD变异组（P〈0．01）。YMDD变异类型与血清HBVDNA定量水平不相关（P〉0．05），但YMDD变异产生时间与血清HBV-DNA定量水平相关（P〈0．05）。结论 CHB患者血清病毒载量水平越高，应用拉米夫定治疗越容易产生YMDD变异，且产生时间越早。血清病毒载量可作为应用拉米夫定治疗YMDD变异产生的早期预测指标。YMDD变异类型与病毒载量不相关。     

乙肝病毒C基因启动子基因变异的检测及临床意义

目的建立等位PCR检测HBVC基因启动子（BCP）基因碱基变异的方法,并探讨检测其基因突变对于乙肝病人临床治疗的意义。方法在3’端设计和合成与野生和突变碱基互补的引物,建立等位PCR检测碱基变异的方法,并通过核苷酸序列测定进行对比来检测慢性和急性乙肝病例、肝癌病例的血清样本。结果经统计学处理该检测方法与核苷酸序列测定所得的结果,得到x^2=0．004,P〉0．05,差异不显著。急性和慢性乙肝病例、肝癌病例的临床血清样本的检测结果为BCP基因碱基变异比例分别为3．9％、26．7％、41．2％,其中1762位及1764位双突变型血清样本在肝癌病例中的比例比慢性乙肝病例高,且有统计学意义。结论该等位PCR检测HBVC基因启动子变异的方法适用于临床血清样本检测,结果可靠且简便易行。BCP基因1762位及1764位突变的检测结果说明这两个突变与乙肝以及其后期发展为肝癌正相关。通过检测这两个突变可预测病情发展,对指导临床治疗有显著的意义。     

慢性HBV感染者肝组织HBV cccDNA的定量检测

目的建立一种肝活检组织中HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）的定量检测方法。方法待检肝组织标本共21份，来源于江苏省人民医院肝脏手术患者，包括19份慢性HBV感染，其中HBeAg（＋）标本10份，HBeAg（-）标本9份，4份非HBV感染为阴性对照组，取HBVDNA阳性的患者外周血作为rcDNA组。检测方法的主要步骤为肝组织经蛋白酶K和细胞裂解缓冲液消化后，用液相抽提法提取核酸，将提取的核酸溶液分为2等份。1份用特异性降解单链DNA的核酸酶加以消化，纯化后使用跨缺口引物和SYBR GreenⅠ荧光染料进行实时荧光定量PCR分析；另1等份则用以定量检测肝细胞看家基因（β-Globin）作为样本细胞参数。检测结果的特异性主要通过PCR反应产物的序列分析及rcDNA组结果的对照进行证实，HBeAg（＋）组和HBeAg（-）组cccDNA水平的差异通过两样本t检验进行分析。结果PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增产物的碱基数为350bp左右，DNA测序分析提示产物与目的片段的序列符合率为99％以上，且以rcDNA为对照的结果均为阴性，排除最有可能造成假阳性的rcDNA对结果的干扰。本方法对10mg HBeAg（＋）肝组织标本的cccDNA的检测阳性率为100％。血清HBeAg（＋）的肝组织样本的平均HBV cccDNA水平高于HBeAb（＋）的肝组织标本（P〈0．05）。结论通过上述三种途径证实了本文所建立方法的特异性。应用SYBR GreenⅠ荧光染料和β-Globin作为样本细胞参数所建立的实时荧光定量PCR方法检测肝细胞内HBV cccDNA，具有较高的特异性、敏感性，且成本较低的特点。     

各类慢性乙型肝炎患者HBV前S2抗原与HBV感染血清标志物及HBVDNA的关系

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)前S2抗原(preS2Ag)与HBV感染5项标志物(HBV-M)、HBV DNA之间的关系及对慢性乙型肝炎分类诊断的临床意义。方法对584例各类慢性乙型肝炎患者血清采用放射免疫法(R IA)检测preS2Ag,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBV-M(HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc),用聚合酶链反应(PCR)检测HBV DNA。结果慢性乙型肝炎轻度、中度、重度及肝炎后肝硬化患者preS2Ag的检出率分别为45.98%、67.10%、83.87%及92.86%;preS2Ag在HBeAg阳性、HBV DNA>105拷贝/mL患者中检出率明显高于HBeAg阴性、HBV DNA<105拷贝/mL患者,差异有统计学意义(P<0.001)。结论preS2Ag的检出意味着病毒有复制或有传染性;开展preS2Ag的检测有助于慢性乙型肝炎的分类、慢性乙型肝炎急性发作和预后的判断。