骨髓来源成骨细胞体外成骨表达的研究

目的探索在体外诱导兔骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化及成骨表达的特性。方法抽取兔骨髓,通过离心法获取单个核细胞,在体外经条件培养基培养21d,通过倒置显微镜及激光共聚焦显微镜观察成骨细胞的形态学特点;应用MTT法测定成骨细胞活性;并检测成骨细胞分泌碱性磷酸酶活性及形成矿化结节情况。结果体外BMSCs可在成骨条件培养液下诱导培养后可向成骨细胞分化,经倒置显微镜和激光共聚焦显微镜观察证实,诱导后BMSCs由长梭形转变为短胖形的成骨细胞,MTT检测成骨细胞活性良好,分泌碱性磷酸酶并形成矿化结节。结论骨髓基质干细胞在体外可定向诱导为成骨细胞,并具有成骨细胞功能,有希望成为理想的种子细胞应用于临床。     

钛表面人工肽抑制格登链球菌生长的实验研究

摘要： 目的 检测自主设计合成的人工肽在钛表面的吸附情况及吸附后的抗菌效果, 为种植体抗菌的实验研究提供新的思路。方法 使用 ExPASy ProtParam、 ProtScale 软件、 圆二色光谱和 Zeta 电位仪等, 分析或测定人工肽与抗菌肽的各项理化性质及结构特征。利用常温孵育的方法将人工肽锚定于钛表面。使用 X 射线光电子能谱与原子力显微镜检测人工肽在钛表面的吸附。通过共聚焦激光显微镜观察锚定于钛表面的人工肽对格登链球菌的抑菌作用。使用透射电镜检测游离人工肽与抗菌肽对格登链球菌结构的破坏作用。结果 自主设计合成的人工肽仍具有抗菌肽发挥抗菌作用所需的各项理化性质及结构特征。在孵育于 5 g/L 人工肽的 PBS 溶液中的钛片表面即可检测到人工肽的吸附, 且该试件对格登链球菌的存活及黏附均有一定的抑制效果。结论 自主设计合成的人工肽实现了在钛表面吸附并抑制格登链球菌生长的设想。     

体外诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的 探讨体外成骨诱导的兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的形态和功能特征.方法 体外培养获取生长状态良好的兔BMSCs,进行成骨诱导,观察并检测成骨细胞的生物学特性.结果 BMSCs可在成骨条件培养液下诱导为成骨细胞.经鉴定,碱性磷酸酶和矿化结节染色阳性,激光共聚焦显微镜下成骨细胞鬼笔环肽显示骨架F-actin为红色荧光.结论 BMSCs在体外可定向诱导为成骨细胞,有希望成为理想的种子细胞应用于临床.     

纯钛种植体表面的飞秒激光制备及其短期植入研究

目的:观察飞秒激光处理种植体表面对种植体-骨界面结合强度及种植体早期骨结合的作用。方法:应用飞秒激光处理浸没于羟基磷灰石(HA)过饱和溶液中的纯钛试样表面作为实验组,未处理组为对照组,用扫描电镜和能谱仪分析试样表面形貌及元素组成;将试样植入新西兰大白兔股骨4周后制作组织学切片来观察实验组试样的早期成骨性及骨诱导性。结果:扫描电镜下实验组试样表面的图案化结构由尖峰状和沟槽状结构组成,在尖峰状突起和沟槽之间可见与基体紧密结合的负载物,能谱分析显示负载物的主要成分为Ti、Ca、P、O,对照组试样表面光滑,仅见机械加工的划痕。组织学结果显示,与对照组相比,实验组试样表面类骨质、钙磷盐的沉积更加活跃。结论:飞秒激光能在浸没于过饱和HA溶液中的纯钛试样表面形成多层图案化的拓扑结构,并同时负载Ca/P元素,有利于种植体的早期成骨及初期稳定性。     

龙葵碱对HepG2细胞线粒体膜电位及细胞内[Ca^2＋]i的影响

目的：观察龙葵碱对HepG2细胞线粒体膜电位及细胞内[Ca^2＋]i的影响，揭示龙葵碱诱导细胞凋亡的机制。方法：采用AO／EB双染HepG2细胞，激光共聚焦扫描显微镜观察细胞形态学改变；TMRE单染HepG2细胞，激光共聚焦扫描显微镜观察细胞线粒体膜电位的改变；Fluo-3／AM单染HepG2细胞，激光共聚焦扫描显微镜观察细胞内[Ca^2＋]i的改变；TMRE和Fluo-3／AM双染HepG2细胞，激光共聚焦扫描显微镜同时观察细胞线粒体膜电位和细胞内[Ca^2＋]i的改变。结果：形态学实验表明0．0032μg／mL、0．016μg／mL龙葵碱使细胞外周呈微弱皱缩状改变，0．08、0．4、2μg／mL龙葵碱使HepG2细胞出现大量碎片及凋亡小体等典型的细胞凋亡形态，即龙葵碱能够诱导HepG2细胞凋亡；TMRE单染激光共聚焦测定表明龙葵碱能够降低HepG2细胞膜电位；Fluo-3／AM单染激光共聚焦测定表明龙葵碱能够升高肿瘤细胞内[Ca^2＋]。浓度；TMRE和Fluo-3／AM双染激光共聚焦观察表明龙葵碱在降低线粒体膜电位的同时能够升高细胞内[Ca^2＋]i浓度。结论：龙葵碱能够诱导HepG2细胞凋亡，其机制为降低HepG2细胞膜电位，开放细胞膜PT通道，使细胞内Ca^2＋顺浓度梯度转运，从而升高细胞内Ca^2＋浓度启动细胞凋亡机制。     

FABP3基因荧光载体构建及其蛋白的亚细胞定位

目的构建脂肪酸结合蛋白3(FABP3)基因的荧光表达载体FABP3-pEGFP-N2,并应用绿荧光融合蛋白技术检测FABP3蛋白的亚细胞定位。方法 RT-PCR法获得FABP3基因编码框,克隆到pEGFP-N2载体中,利用脂质体将构建的表达载体转染P19细胞后,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察细胞内FABP3蛋白定位。结果成功克隆FABP3基因片段,并将其重组到pEGFP-N2载体中。荧光显微镜和激光共聚焦显微镜显示,FABP3蛋白主要分布于P19细胞的胞浆和胞核中。结论成功构建了FABP3-pEGFP-N2真核表达载体,FABP3在P19细胞的胞浆和胞核中呈弥漫分布特点。     

钛表面载银抗菌功能膜的抑菌性研究

目的 通过对钛片进行表面处理制备出载银抗菌功能膜,研究处理前后钛片对种植体周围炎易感细菌的抑菌性能.方法 利用微弧氧化法在钛表面制备陶瓷层,运用光催化沉积将银离子沉积于陶瓷层表面,制得含银离子的杭菌功能膜;采用扫描电镜观察钛片处理前后表面形貌及抗细菌黏附性能;通过计算抑菌率研究处理前后钛片对牙龈卟啉单胞菌及金黄色葡萄球...     

钛及钛合金种植体的两种表面处理对细菌黏附能力的影响

目的研究两种表面处理(等离子渗氮和物理气相沉积TiN涂层)对钛、钛合金表面的组织结构、性能及对变形链球菌黏附的影响。方法将相同规格的钛、钛合金片经逐级抛光后分别随机分成3组,每组3片,依次为抛光组,渗氮表面处理组,TiN涂层表面处理组。以抛光钛、钛合金组作为对照。测量所有试件表面的粗糙度值,并采用扫描电镜、Axiovert 25CA光学图像分析仪及GDA750对钛、钛合金表面渗镀层的表面形态进行分析;将材料接种于变形链球菌悬液,在荧光显微镜下计数黏附细菌的数量。结果两种表面处理仅使原有表面粗糙度略微增加;扫描电镜显示两种表面处理后材料表面的原始划痕消失;GDS检测分析结果表明:钛、钛合金两种表面处理后,表面主要由氮化钛化合物组成。经两种处理后,钛、钛合金黏附细菌的量显著减少,而两种表面处理差异无统计学意义。结论钛、钛合金经两种表面处理后形成了稳定的改性层,且能减少细菌的黏附。相对于有涂层脱落之忧的物理气相沉积TiN涂层技术,等离子渗氮技术有望作为种植体穿龈部和种植体基台部的表面处理技术。     

氧化苦参碱诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的实验研究

目的　研究氧化苦参碱对MCF 7细胞的诱导凋亡作用机制。方法　用光学显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪和DNA凝胶电泳等技术观察细胞凋亡。结果　实验显示氧化苦参碱作用于体外培养的MCF 7细胞可诱导发生凋亡 ,凋亡细胞表现为细胞固缩 ,核染色质聚集或碎裂、胞质空泡化等 ;DNA电泳可见DNA梯形条带 ;激光共聚焦显微镜示DNA含量下降 ,流式细胞仪检测sub G1峰在G1期前出现 ,S期细胞比例增高。结论　氧化苦参碱对体外培养MCF 7细胞生长有抑制作用 ,机制与通过阻止细胞周期的进程 ,启动细胞自身调控程序 ,诱导肿瘤细胞凋亡有关     

应用微弧氧化-水热处理法在纯钛表面制备生物梯度陶瓷涂层

目的 应用微弧氧化和水热处理技术在纯钛表面制备TiO2/HA梯度涂层,并对该涂层成分、形貌等理化性能进行评价.方法 纯钛试件分为三组,分别进行微弧氧化处理(M组)、微弧氧华-水热处理(M H组)和纯钛对照(C组).采用扫描电镜观察表面形貌并用X线衍射对其进行成分分析,通过划痕实验检测膜基结合力.结果 做弧氧化处理后试件表面呈现多孔状,主要为锐钛矿型TiO2;经过后续水热处理,从扫描电镜(SEM)照片可以看到试件表面析出一层白色柱形结晶体,同时X射线衍时仪(XRD)潜线出现了羟基磷灰石的衍射峰.结论 微弧氧化及水热处理能够增强纯钛种植体的生物相容性.     

骨形态发生蛋白-2基因转染骨髓基质干细胞复合壳聚糖体外构建组织工程软骨的实验研究

目的观察转人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因的骨髓基质干细胞(BMSCs)向软骨细胞方向分化的能力,并种植于壳聚糖体外构建组织工程软骨。方法应用慢病毒介导把人BMP-2基因和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因转入大鼠BMSCs,通过荧光观察、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Westernblot、免疫组织化学等方法检测BMP-2、Ⅱ型胶原表达及软骨基质分泌情况;噻唑蓝(MTT)检测转基因后细胞的增殖活力。结果BMP-2基因和eGFP基因成功转染BMSCs,Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达均显著增强,细胞种植壳聚糖支架后生长、粘附良好。结论BMP-2可在BMSCs内表达,并诱导其向软骨方向分化;与壳聚糖复合培养可构建组织工程骨。     

复合骨髓间充质干细胞的多肽-透明质酸支架的构建与表征

目的 采用多肽修饰的透明质酸制备一种复合骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的凝胶支架系统。方法 在交联剂作用下,冷冻干燥后,制备得到多肽修饰的透明质酸凝胶支架;使用FTIR和NMR对支架化学结构进行表征;SEM和压汞法对支架表面形态和内部结构进行表征;通过免疫荧光染色和CLSM考察BMSCs在支架上的黏附生长状况。结果 ¹H-NMR和FTIR结果显示,在交联剂存在下,多肽修饰的透明质酸凝胶支架成功制备;SEM观察到凝胶支架具有较规则的三维网状结构。压汞法测定其孔隙率为94.02%,吸水膨胀率为4 357.0%。CLSM结果显示BMSCs在多肽修饰的凝胶支架上伸出较多伪足,具有更强的黏附作用。结论 经多肽修饰的透明质酸凝胶支架具有较高的孔隙率,呈现较规则的三维网状结构,且显著改善了干细胞在凝胶支架上的黏附性,有利于细胞的生长。     

骨髓基质细胞与可注射聚丙交酯多孔微载体共培养的体外实验研究

目的体外共培养骨髓基质细胞与聚丙交酯多孔微载体,研究微载体对骨髓基质细胞的增殖、凋亡等生理特性的影响,为细胞移植治疗提供一种安全可靠的载体。方法密度梯度离心法获取大鼠骨髓基质细胞,与可注射聚丙交酯多孔微载体在体外共培养,倒置显微镜及扫描电镜下观察细胞的生长及黏附在微载体的情况,并应用MTT法、流式细胞仪比较共培养、单独培养以及黏附在微载体的细胞的增殖及凋亡等生理特性。结果两者共培养时,骨髓基质细胞可长期存活、增殖,并可以黏附于微载体的表面及内部孔洞中,共培养时微载体对骨髓基质细胞的增殖、凋亡等特性无明显影响。结论可注射聚丙交酯多孔微载体是一种安全、可靠的细胞载体。     

骨髓基质细胞在不同载体表面生长碱性磷酸酶活性的表达

目的研究骨髓基质细胞在牙骨质和骨片表面生长ALP活性的表达情况。方法将骨髓基质细胞与牙骨质片和股骨片在体外共同培养,分别在第7天、第28天进行光镜观察及碱性磷酸酶的测定。结果骨髓基质细胞在牙骨质片和骨片表面生长,两组均有ALP的表达,牙骨质组较弱。结论结果表达在体外矿化液培养条件下,骨髓基质细胞在牙骨质和骨片表面生长附着良好,可向成骨样细胞转化。     

脑脊液对骨髓基质细胞作用的动态观察

目的 动态观察脑脊液对骨髓基质细胞向神经元方向分化的作用。方法 采用Percoll液分离大鼠骨髓基质细胞,体外扩增。当第2或第3代细胞生长达60％～70％融合时,加入不同病人脑脊液,分别于不同时间观察其形态学改变,取诱导后的细胞作免疫细胞化学鉴定。结果 在颅咽管病人脑脊液中骨髓基质细胞的分化速度较快,且发生政变的程度较大;而在脑外伤积水的病人脑脊液中骨髓基质细胞的分化速度相对较慢,且发生改变的细胞数较前者少。免疫细胞化学染色NSE呈弱阳性,NF呈弱阳性。结论 脑脊液可诱导骨髓基质细胞向神经元方向分化。     

FnCBD64增强骨髓基质干细胞黏附力的实验研究

目的观察预涂蛋白对细胞黏附的影响,以寻找增强细胞黏附力的有效方法。方法①取四个96孔板分为四组:Fn、FnCBD64(重组纤维连接蛋白羧基端细胞结合域)、牛血清白蛋白BSA及未预涂组,前三种蛋白分别预涂孔底,未预涂组为对照组。分八个时点,间隔30min,每孔接种骨髓基质干细胞悬液,细胞数为5×104个,MTT检测;②无菌条件下将脱细胞瓣叶圆片置入12孔板中(心室面向上)别给,分予Fn、FnCBD64、牛血清白蛋白BSA预先包埋,未预包埋作为对照组。接种细胞悬液,每只瓣叶种植细胞数为3×10个。在开始种植细胞的第8天取瓣叶进行细胞计数和MTT检测。结果各组随着时间的延长5MTT的OD吸光值增加,组内各时点比较有显著性差异。经Fn和FnCBD64预涂组其MTT的OD吸570570光值在各时点均明显高于预涂BSA和对照组。Fn组与FnCBD64组相比无显著性差异。脱细胞瓣叶进行预处理后再种植骨髓基质干细胞,经Fn和FnCBD64预处理组,其细胞计数、MTT的OD570明显高于预涂牛血清白蛋白及对照组。结论Fn和FnCBD64促进细胞的聚集、黏附及增殖,是制备组织工程瓣的有用方法。     

The effect of titanium particles on rat bone marrow stem cells in vitro

In arthroplasty prostheses and dental implant, titanium is an excellent biocompatible material for its advanced physical qualities and better biocompatibility. However, it was reported that high ratios of titanium particles can be liberated due to the continual loading or articulation cycles of the implant. Because bone marrow stem cells (BMSCs) located adjacent to the implant are critical contributors to osseous tissue integrity, this study researched the influence of titanium particles on BMSCs’ viability, proliferation, and cell skeleton. In addition, the phagocytosis of titanium particles by BMSCs and expression of tumor suppressor protein p53 were also examined. It was found that exposure of BMSCs to titanium particles disrupted their viability and proliferation in vitro, which may due to the phagocytosis of titanium particles by BMSCs. Moreover, cell skeleton was destroyed and the p53 protein level increased as the titanium particles were added. For these results, it was concluded that titanium particles had a cytotoxic effect on BMSCs in vitro and would inhibit the bone formation around the implant.     

壳聚糖-丝素蛋白-磷酸三钙支架的力学性能及异位成骨能力的研究

目的对壳聚糖-丝素蛋白支架(CS-SF)与壳聚糖-丝素蛋白-磷酸三钙支架(CS-SF-TCP)的力学性能及早期体内成骨能力进行实验研究,以寻求更适合牙周组织工程的支架材料。方法采用二次冻干技术制备2种支架,用Instron5544拉伸实验机对该2种支架的压缩模量进行测试,并将2种支架与矿化诱导后的骨髓基质细胞(BMSCs)复合培养3d后无菌条件下移植入裸鼠背部皮下,4周时取出标本行大体观察、苏木精-伊红染色、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色,观察2种支架的体内成骨能力。结果力学性能检测结果显示:CS-SF组与CS-SF-TCP组的抗压强度分别为(0.44±0.15)MPa、(1.44±0.96)MPa。CS-SF-TCP组高于CS-SF组(P<0.05)。早期体内成骨能力结果:肉眼观察取出的植入物均有薄膜包绕。HE染色可见CS-SF+BMSCs与CS-SF-TCP+BMSCs组可见支架中心长入大量的细胞并有胶原样物质生成。免疫组织化学见2组均有不同程度的Ⅰ型胶原阳性表达,CS-SF-TCP+BMSCs组表达要高于CS-SF+BMSCs组(P<0.05)。结论与CS-SF支架相比,CS-SF-TCP支架有更好的力学性能及诱导BMSCs形成新生的骨组织的能力,更适合于牙周组织工程的支架。     

诱导后上清液在BMSCs向神经元样细胞分化中的作用

目的:研究体外使用SHH、Ra、Fn组成的诱导体系诱导骨髓间充质细胞后的上清液对BMSCs向神经细胞分化的作用。方法:从健康志愿者髂骨处抽取骨髓4mL,体外分离、培养、扩增后用400ng/LSHH、0.5μmolRa和5μmolFn组成的诱导体系进行诱导,取诱导后12,24h的诱导液上清分别作用于BMSCs。7d后使用倒置显微镜和免疫组织化学方法观察诱导前后细胞的变化。结果:诱导7d之后各组均有部分细胞胞体收缩、伸长突起,表现为神经细胞的形态。12h组同SHH+Ra+Fn组NSE、MAP-2阳性细胞比例差异无显著(P>0.05)。12h组分化率高于24h组(P<0.05)。结论:12h后诱导液上清可以有效地诱导BMSCs向神经细胞分化。     

bFGF通过上调Ras/ERK信号通路诱导BMSCs表达Ⅰ型胶原

目的研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF)诱导体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell,BMSCs)成骨性分化及其作用机制。方法从SD大鼠骨髓中获得BMSCs,纯化培养传代后用不同浓度bFGF(5、10、20μg.L-1)在不同时间(d 0、3、5、7、14、21)分别采用透射电镜和光镜观察细胞形态结构变化;用免疫细胞化学和RT-PCR检测Ⅰ型胶原蛋白及mRNA表达;用Western blot和免疫细胞化学方法分析细胞内p-ERK蛋白表达。结果 BMSCs经bFGF作用后在光镜和透射电镜下均为成骨样细胞的形态特征;bFGF促进细胞Ⅰ型胶原蛋白和mRNA表达,同时细胞p-ERK蛋白表达升高。结论 bFGF可活化Ras/ERK信号转导通路,促进BMSCs向成骨细胞分化。